nhóm 07 thực hành vi sinh trong y học sáng thứ 3

Tại Liên minh Châu Âu EU, bệnh nhiễm khuẩn Salmonella là bệnh lây truyền từ động vật sang người được báo cáo nhiều thứ hai vào năm 2020 với 52.702 trường hợp được xác nhận, trong đó 29,8

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

4 Nguyễn Thị Bảo Trân 21126548 DH21SHB

5 Nguyễn Dương Phương Yến 21126593 DH21SHB

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hiện 2

1.3 Phương pháp thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Salmonella 3

2.1.1 Đặc điểm 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Các bệnh do Salmonella 4

2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 5

2.2.1 Định nghĩa 5

2.2.2 Nguyên lí hoạt động 5

2.2.3 Xây dựng phản úng PCR 5

2.3 Giới thiệu điện di gel agarose 6

2.3.1 Định nghĩa 6

2.3.2 Thành phần điện di 7

2.3.3 Phương pháp điện di 9

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 10

3.2 Vật liệu 10

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 10

3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3.1 Điện di tổng số kiểm tra chất lượng DNA 11

3.3.2 PCR 16S RNA xác định vi khuẩn 11

3.3.3 PCR với mồi Salmonella sp 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Điện di tổng số kiểm tra chất lượng DNA 14

4.1.1 Kết quả 14

4.1.2 Thảo luận 14

4.2 PCR 16S RNA xác định vi khuẩn 14

4.2.1 Kết quả 14

4.2.2 Thảo luận 15

4.3 PCR với mồi Salmonella sp 15

4.3.1 Kết quả 16

4.3.2 Thảo luận 17

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18

5.1 Kết luận 18

5.2 Kiến nghị 18

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình vi khuẩn Samonella 3

Hình 4.1 Kết quả điện di PCR tổng sổ 14

Hình 4.2 Kết quả điện di PCR 16S RNA 15

Hình 4.3 Kết quả điện di với mồi Salmonella lần 1 16

Hình 4.4 Kết quả điện di với mồi Salmonella lần 2 16

Hình 4.5 Kết quả điện di với mồi Salmonella lần 3 17

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Salmonella là một trong những mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm phổ biến nhất

từ động vật sang người và là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới

Salmonella có thể được tìm thấy trong nhiều loại thịt động vật mà là thực phẩm của con

người Theo báo cáo của Wang và ctv (2023) Salmonella là nguyên nhân chính gây viêm

dạ dày ruột do thực phẩm trên toàn thế giới, ước tính có 1,35 triệu ca bệnh, 26.500 ca nhập viện và 420 ca tử vong ở Hoa Kỳ mỗi năm Tại Liên minh Châu Âu (EU), bệnh

nhiễm khuẩn Salmonella là bệnh lây truyền từ động vật sang người được báo cáo nhiều

thứ hai vào năm 2020 với 52.702 trường hợp được xác nhận, trong đó 29,8% phải nhập viện và hầu hết là do bùng phát do thực phẩm gây ra Thịt lợn và các sản phẩm có nguồn

gốc từ thịt lợn là phương tiện truyền nhiễm khuẩn Salmonella thứ hai sau trứng và các

sản phẩm có nguồn gốc từ thịt lợn, do đó nêu bật tầm quan trọng của việc giải quyết tình

trạng ô nhiễm Salmonella trong chăn nuôi lợn và thịt lợn

Ở lợn, Salmonella chủ yếu cư trú trong đường tiêu hóa từ khoang miệng đến trực

tràng, do đó tạo thành nguồn lây nhiễm từ lợn sang lợn trong quá trình vận chuyển và

nhốt giữ Ngoài ra, Salmonella từ lợn dương tính có thể lây nhiễm vào thân thịt lợn

trong lò mổ trong quá trình giết mổ Tại Việt Nam đã có nhiều trường hợp ngộ độc diện

rộng phát hiện có sự hiện diện của Salmonella, trường hợp nặng có thể xảy ra tử vong,

như là tại Thành phố Đồng Hới với gần 250 người phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10 năm 2015 vì bánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khuẩn, gần 800 công nhân tại Tiền Giang phải nhập viện từ ngày 3 tháng 10 năm 2013 Tại Thành phố Hồ Chí Minh, trong đợt giám sát thí điểm năm 2013, sau khi lấy 1.618 mẫu tại chợ đầu mối Bình Điền, Hóc

Môn, Thủ Đức đã phát hiện Salmonella trong 30% mẫu thịt heo và 45% trong mẫu thịt

gà Tại Khánh Hoà, hơn 600 em sinh trường Ischool Nha Trang đã phải nhập viện và khiến ít nhất một bé trai tử vong sau bữa ăn trưa ngày 17/11/2022 do nhiễm khuẩn

Salmonella và một số khuẩn khác theo kết luận của Viện Pasteur Nha Trang

Một trong những thực phẩm chính của người dân Việt Nam là thịt heo Việc chăn nuôi heo ở Việt Nam vẫn đang được giữ vững tính ổn định và ngày càng phát triển để phục vụ cho nhu cầu sử dung Nhiều yếu tố rủi ro tồn tại ở trang trại lợn, bao gồm những

yếu tố liên quan đến thức ăn, quản lý vật nuôi, vệ sinh và an toàn sinh học Sự phức tạp

của sự tương tác giữa các yếu tố này có thể làm tăng hoặc giảm tỷ lệ nhiễm Salmonella

ở lợn, Vai trò của lợn là vật mang vi khuẩn Salmonella đã được nghiên cứu chuyên sâu

cả ở trang trại và lúc giết mổ Nhiễm khuẩn Salmonella ở lợn có thể gây sốt, tiêu chảy,

suy nhược và tử vong Sự ô nhiễm của thân thịt lợn có thể xảy ra trên dây chuyền giết

mổ và có liên quan đến sự lây nhiễm chéo từ các thân thịt khác và sự hiện diện của vi

khuẩn Salmonella trong môi trường Vì vậy để tránh những vấn đề liên quan đến ngộ độc gây ra bởi vi khuẩn Salmonella các phương pháp kiểm tra ngày càng được cải tiến,

phương pháp PCR là một trong những phương pháp kiểm tra phát hiện nhanh và chính xác đang rất được nhiều người sử dụng Phương pháp PCR có thể cho chúng ta biết được trong mẫu cần kiểm tra có sự xuất hiện của DNA vi khuẩn hay không trong một thời gian ngắn

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Salmonella

2.1.1 Đặc điểm

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae

(vi khuẩn đường ruột) là một giống vi khuẩn

hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi

không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh

sống trong đường ruột, có đường kính khoảng

0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có

vành lông rung hình roi

Vi khuẩn Salmonella đi vào hệ tiêu hóa của

cơ thể, sau khi bị chết sẽ giải phóng ra nội độc

tố Vi khuẩn Salmonella chết càng nhiều càng có

nhiều độc tố giải phóng tấn công vào cơ thể

người nhiễm Nội độc tố của vi khuẩn đường

ruột Salmonella gây ra ảnh hưởng rất xấu tại

ruột, nội độc tố sẽ làm tổn thương niêm mạc ruột

(kích thích ruột gây đau bụng, làm chảy máu,

hoặc có thể gây thủng ruột) Nội độc tố do vi khuẩn Salmonella giải phóng đi vào máu

đến hệ thần kinh trung ương làm tổn thương hệ thần kinh và nhiễm độc toàn thân

2.1.2 Phân loại

Chi Salmonella được chia thành 2 loài, S enterica và S bongori, bao gồm hơn

2500 kiểu huyết thanh đã biết Một số loại type huyết thanh đã được đặt tên Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng thông thường đôi khi rút ngắn tên khoa học để chỉ bao gồm

chi và serotype; ví dụ, S enterica, phân loài enterica, serotype Typhi ngắn hơn

Salmonella Typhi

Salmonella cũng có thể được chia thành 3 nhóm dựa trên sự thích nghi với con

người:

Hình 1.1 Hình vi khuẩn Salmonella Tên khoa học: Salmonella

Lớp cao hơn: Họ Enterobacteriaceae

Nhóm thích nghi cao với con người và không có vật chủ là con người: Nhóm này

bao gồm S Typhi and S Paratyphi type A, B (còn gọi là S Schottmülleri) và C (còn gọi

là S Hirschfeldii), chỉ gây bệnh ở người và thường gây sốt ruột (thương hàn)

Những vi sinh vật phù hợp với vật chủ không phải con người hoặc gây ra bệnh tật

gần như chỉ có ở động vật: Một số chủng trong nhóm này-S Dublin (gia súc), S Arizonae (bò sát), và S Choleraesuis (heo) cũng gây ra bệnh ở người

Những vi sinh vật có nhiều vật chủ: Nhóm này bao gồm > 2000 serotypes (ví dụ,

S Enteritidis, S Typhimurium) gây viêm dạ dày ruột do Salmonella và chiếm 85% số

bệnh nhiễm Salmonella ở Hoa Kỳ

2.1.3 Các bệnh do Salmonella

2.1.3.1 Salmonella sốt thương hàn

Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Salmonella typhi gây ra Bệnh

khởi phát đột ngột với sốt cao kéo dài, đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, mạch chậm, táo bón hoặc tiêu chảy và ho khan Tuy nhiên, cũng có trường hợp nhẹ hoặc không triệu chứng Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn xâm nhập cơ thể người cảm thụ, trung bình từ 8 - 14 ngày Bệnh thương hàn thường xảy ra ở nhưng nơi có điều kiện vệ sinh kém, đặc biệt là ở những nơi mà có tình hình vệ sinh nguồn nước, vệ sinh an toàn thực phẩm, nhà tiêu, hệ thống thoát nước không đạt tiêu chuẩn vệ sinh

2.1.3.2 Salmonella sốt không thương hàn

Salmonellae không thương hàn chủ yếu là nguyên nhân gây ra viêm dạ dày ruột,

nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng khu trú Các triệu chứng có thể là tiêu chảy, sốt cao với mệt lả hoặc triệu chứng nhiễm trùng khu trú Chẩn đoán bằng cách cấy máu, cấy

phân hay cấy mẫu bệnh phẩm tại chỗ Salmonella không thương hàn là phổ biến và vẫn

là một vấn đề y tế công cộng đáng kể ở Hoa Kỳ Nhiều type huyết thanh của Salmonella

đã được đặt tên và được đề cập đến không chính thức như là những chủng riêng biệt)

Hầu hết các trường hợp nhiễm Salmonella không thương hàn là do phân nhóm S

enterica Enteritidis type huyết thanh enterica, S Typhimurium, S Newport, S Heidelberg, và S Javiana Theo Bhutta Z A (2006) vẫn còn nhiều thách thức đối với

việc kiểm soát và quản lý hiệu quả bệnh thương hàn ở các quốc gia lưu hành bệnh Mặc

dù những điều này bao gồm việc thiết lập chẩn đoán và xác nhận lâm sàng nhanh chóng,

nhưng thực tế là cả S typhi và S paratyphi đều nhanh chóng trở nên đề kháng với các

loại kháng sinh thông thường là điều đáng lo ngại Giải quyết vấn đề này đòi hỏi một loạt biện pháp, bao gồm đầu tư thỏa đáng vào các dịch vụ nước sạch và vệ sinh, giáo dục cộng đồng, kiểm soát việc kê đơn thuốc kháng sinh và bán thuốc không kê đơn cũng như các chiến lược tiêm chủng quy mô lớn Hộp 2 trình bày chi tiết một số chiến lược phòng ngừa và lời khuyên dành cho khách du lịch đến các khu vực có bệnh thương hàn lưu hành

2.2 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.2.1 Định nghĩa

Các quy trình dựa trên DNA ngày càng trở nên phổ biến trong phòng thí nghiệm phân tích, nơi phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã trở thành một kỹ thuật không thể thiếu Được phát triển vào năm 1985 bởi Kary B Mullis, PCR đã cách mạng hóa cách sao chép axit deoxyribonucleic (DNA) Phát minh của Mullis cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra hàng triệu bản sao của một vùng DNA được chọn trong vòng vài giờ

Mục đích chính của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là tạo ra nhanh chóng nhiều bản sao của một vùng DNA hoặc RNA cụ thể để có thể phát hiện đầy đủ, thường bằng phương pháp điện di trên gel agarose PCR thường được sử dụng để khuếch đại, sửa đổi

và nhân bản gen cho các nghiên cứu biểu hiện Có nhiều ứng dụng khác của PCR, bao gồm xét nghiệm quan hệ cha con, mối quan hệ sinh học, kiểu gen chuột, chẩn đoán bệnh

di truyền, pháp y và tìm vi khuẩn và vi rút

2.2.2 Nguyên lí hoạt động

Nguyên lý hoạt động của máy PCR là tạo ra lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn ban đầu khuếch đại, nhân số lượng bản sau của khuôn này thành hàng triệu bản sau thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

2.2.3 Xây dựng phản úng PCR

Một phản ứng PCR diễn ra gồm các thành phần như sau:

(i) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối

Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94℃, các liên kết hydro sẽ bị phá

vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65℃, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72℃, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP

để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

2.3 Giới thiệu điện di Gel agarose

2.3.1 Định nghĩa

Điện di ngang trên gel agarose (điện di Gel agarose) là kỹ thuật được sử dụng chủ

yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được sử dụng

để phân tách RNA hoặc protein Điện di trên gel Agarose là một loại điện di được sử dụng để tách axit nucleic (phổ biến nhất là DNA) theo trọng lượng phân tử của chúng Agarose là một polyme tuyến tính hồ hóa để tạo thành một mạng lưới ba chiều gồm các kênh có kích thước từ 50 đến ≥ 200 nm Gel agarose có khả năng phân giải tương đối thấp hơn (so với gel polyacrylamide), nhưng có thể tách các phân tử có phạm vi trọng lượng phân tử lớn hơn (tương ứng với các phân tử DNA có kích thước từ 50 đến 20.000 bp) Trong quá trình điện di trên gel DNA, các mẫu DNA được nạp vào đầu tích điện

âm của gel (cực âm) Do đó, khi một dòng điện được đưa vào gel, các phân tử sẽ di chuyển về phía tích điện dương (cực dương) do các điện tích âm được mang theo bởi khung đường photphat của chúng Tốc độ phân tử DNA di chuyển dựa trên kích thước của DNA Đoạn DNA nhỏ sẽ di chuyển một khoảng cách lớn hơn DNA lớn hơn

Các đoạn DNA tách biệt có thể nhìn thấy dưới dạng các dải ở các vị trí khác nhau trong ma trận gel Các dải DNA này giúp xác định kích thước của các phân tử DNA trên gel agarose dọc theo thang DNA (mẫu có kích thước đoạn DNA đã biết)

2.3.2 Thành phần điện di

2.3.2.1 Dung dịch đệm

Dòng điện chạy qua dung dịch chất điện ly sẽ gây ra sự thay đổi thành phần hóa học của dung dịch và làm thay đổi pH của dung dịch pH của dung dịch là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá trình điện di nên phải giữ cho pH của dung dịch điện di không thay đổi trong suốt quá trình điện di Do đó, dung dịch điện di phải là dung dịch có khả năng đệm tốt, không quá loãng và không quá đặc, đảm bảo 2 yêu cầu sau:

Dung dịch đệm phải giữ cho protein ở trạng thái bền vững không bị biến tính

Dung dịch đệm phải phân tách tốt hỗn hợp protein thành các cấu tử

Các chỉ số đánh giá dung dịch đệm gồm: pH, lực ion và bản chất thành phần ion của dung dịch đệm

pH của dung dịch đệm là yếu tố quan trọng nhất của phương pháp điện di Protein

có tính chất lưỡng tính, dấu và lượng điện tích của protein phụ thuộc vào giá trị của pH

pH < pHi, protein tích điện dương; pH > pH, protein tích điện âm; pH càng khác xa với pHi thì phần tử di chuyển càng nhanh Tuy nhiên cần phải lưu ý pH không được quá kiềm (> 10) hay quá acid (< 3) vì sẽ làm biến tính chất cần điện di, làm mất khả năng tích điện của các phần tử, các phần tử sẽ không di chuyển

Bộ đệm Tris-acetate-EDTA và Tris-Borate-EDTA thường được sử dụng, nhưng các bộ đệm khác như Tris-phosphate, barbituric acid-sodium barbiturate hoặc Tris- barbiturate buffer có thể được sử dụng trong các ứng dụng khác DNA thường được hình dung bằng cách nhuộm với ethidium bromide (chất hóa học có khả năng gây ung thư)

và sau đó được xem dưới ánh sáng tia cực tím, nhưng các phương pháp nhuộm màu khác có sẵn, chẳng hạn như SYBR Green, GelRed, xanh methylen và tinh thể tím Nếu các đoạn DNA tách rời là cần thiết cho thí nghiệm tiếp tục ở hạ lưu, chúng có thể được cắt ra từ gel trong lát để thao tác tiếp theo

2.3.2.2 Agarose

Là một polysaccharide, thường được chiết xuất từ rong biển đỏ nhất định Nó là một polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi lặp lại của agarobiose, là một disaccharide tạo thành từ D -galactose và 3,6-anhydro- L -galactopyranose Agarose là một trong hai thành phần chính của thạch, và được tinh chế từ thạch bằng cách loại bỏ thành phần khác của agar, agaropectin Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều các kênh

có đường kính từ 50 nm đến> 200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng - nồng độ cao hơn mang lại đường kính lỗ chân lông trung bình thấp hơn Cấu trúc 3-D được tổ chức cùng với liên kết hydro và do đó có thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng thái lỏng

Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh học phân tử để tách các phân tử lớn, đặc biệt là DNA, bằng điện di Các tấm gel agarose (thường là 0,7 - 2%) đối với điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ dung dịch ấm, lỏng vào khuôn Một loạt các agaroses khác nhau của trọng lượng phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mục đích này Agarose cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một số phương pháp sắc ký để làm sạch protein