báo cáo th vi sinh trong y học nhóm 6 sáng t3

Kết quả bài 1 Sau khi thực hiện điện di mẫu trong thời gian 25 phút ở 100V, nhóm 6 ghi nhận được kết quả chạy điện di như hình 3.1: Hình ảnh bảng điện di ghi nhận không hiển thị band của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TP Thủ Đức, ngày 20 tháng 5 năm 2024

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Bảo Quốc

Nhóm sinh viên thực hiện : Nhóm 6

Châu Nguyên Huyền Trân 21126546 DH21SHB

Lê Thị Thùy Trang 21126550 DH21SHB

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BẢNG v

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

2.2 Vật liệu nghiên cứu 3

2.2.1 Vật liệu 3

2.3 Phương pháp nghiên cứu 4

2.3.1 Bài 1: Kiểm tra DNA tổng số 4

2.3.1.1 Các bước tiến hành 4

2.3.2 Bài 2: Chạy PCR 16S để phát hiện Salmonella 5

2.3.3 Bài 3: PCR và điện di DNA Salmonella 7

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

3.1 Bài 1: Kiểm tra DNA tổng số 9

3.1.1 Kết quả bài 1 9

3.1.2 Thảo luận 9

3.2 Bài 2: Chạy PCR 16S để phát hiện Salmonella 10

3.2.1 Kết quả bài 2 10

3.2.2 Thảo luận 10

3.3 Bài 3: PCR và điện di DNA Salmonella 11

3.3.1 Kết quả bài 3 – Lần 1 11

3.3.2 Thảo luận 11

3.3.3 Kết quả bài 3 - Lần 2 12 3.3.4 Thảo luận 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO 14

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Salmonella 1

Hình 2.1 Vortex mẫu 5

Hình 2.2 Các thành phần phản ứng 6

Hình 2.3 Tube hỗn hợp phản ứng chạy PCR 6

Hình 2.4 Quá trình chạy luân nhiệt PCR 6

Hình 2.5 Voter tube chứa DNA 7

Hình 2.6 Màn hình hiển thị đã thiết lặp chạy trên máy PCR 8

Hình 3.1 Kết quả bài 1 9

Hình 3.2 Kết quả bài 2 10

Hình 3.3 Kết quả bài 3 (lần 1) 11

Hình 3.4 Kết quả bài 3 (lần 2) 12

Hình 3.5 Kết quả bài thử lại các mẫu 12

v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Bảng nhiệt độ quá trình PCR 6 Bảng 2.2 Thiết lập máy PCR 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Salmonella được đặt theo tên của D E Salmon, một nhà vi khuẩn học người Mỹ, người đầu tiên phân lập vi khuẩn từ ruột lợn vào năm 1884 Vi khuẩn Salmonella là

một sản xuất hydro sunfua gram âm, di động, hydro sunfua, một vi sinh vật nội bào không có axit thường gây viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới và gây nhiễm trùng chéo giữa người và động vật Nhiều động vật được biết đến là người mang vi khuẩn

Salmonella Vi khuẩn Salmonella cũng gây nhiễm trùng khu trú đáng kể ở những bệnh

nhân bị suy giảm miễn dịch

Salmonella có thể lây lan bởi những người xử lý thực phẩm không rửa tay hoặc

các bề mặt và dụng cụ họ sử dụng giữa các bước chuẩn bị thực phẩm và khi mọi người

ăn thực phẩm sống hoặc nấu chưa chín Salmonella cũng có thể lây lan từ động vật

sang người Những người tiếp xúc trực tiếp với một số động vật, bao gồm gia cầm và

bò sát, có thể lây lan vi khuẩn từ động vật sang thức ăn nếu họ không thực hành vệ sinh rửa tay đúng cách trước khi xử lý thực phẩm Thú cưng cũng có thể lây lan vi

khuẩn trong môi trường gia đình nếu chúng ăn thức ăn bị nhiễm Salmonella

Nhiễm Salmonella có thể liên quan đến nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng khu

trú như viêm tủy xương, viêm màng não, viêm dạ dày ruột và nhiễm trùng đường tiết

niệu Viêm tủy xương do Salmonella thường gặp ở bệnh nhân mắc bệnh hồng cầu hình

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian từ 8 giờ đến 11 giờ 30 phút, ngày 9 tháng 4 năm 2024 đến ngày 7 tháng 5 năm 2024, tại phòng Nghiên cứu Chuẩn đoán bệnh học (BIO 304), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Đối chứng dương Salmonella

Đối chứng âm Salmonella

Gel agarose 1% đã nhuộm có thể được sử dụng để ước tính trọng lượng phân tử và

độ tinh khiết của (các) đoạn DNA trong một mẫu nhất định

Loading dye là chất tăng trọng lượng DNA, làm DNA lắng xuống sâu dưới giếng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bài 1: Kiểm tra DNA tổng số

Dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA tổng số thu được từ huyền phù tế bào vi sinh vật Xuất hiện band sáng là do có DNA trong mẫu, DNA sẽ được glycerol nặng hơn kéo lắng xuống đáy giếng, giúp DNA tránh khuếch tán ra bên ngoài, đồng thời làm băng điện di đẹp và gọn hơn Các chất chỉ thị như bromophenol blue sẽ giúp dễ dàng theo dõi

sự di chuyển của các sản phẩm điện di Cuối cùng, để quan sát được DNA cần phải nhuộm phân tử này bằng các chất nhuộm như Gelred, Và ngược lại nếu không có DNA trong mẫu những phản ứng trên sẽ không xảy ra và đồng thời band sáng cũng không xuất hiện

2.3.1.1 Các bước tiến hành

Điện di DNA tổng số

Bước 1: Pha gel agrarose có nồng độ 1% ( 0.25g agarose + 25ml 0,5X TBE), sau

đó bỏ vào lò vi sóng quay đến khi agarose tan hết tạo dung dịch trong suốt

Chú ý: Không đóng chặt nắp vì dễ gây nổ

Bước 2: Sau khi quay xong lấy hủ gel ra và để hỗn hợp nguội xuống còn 60℃ Tiếp

theo đổ gel ra khuôn và chờ gel đông đặc

Chú ý: Khi đổ gel agarose, một chiếc lược sẽ được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel đã đông đặc để tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào

Bước 3: Sau khi gel đã đông, bỏ gel vào máy điện di và cho TBE ngập qua gel Bước 4: Dùng micropipette hút 3 µl mẫu + 0,5µl loading dye + 1µl gelred → trộn

đều hỗn hợp trên bằng micropipette → bơm vào giếng trên miếng gel đã đổ trước đó

Bước 5: Tiến hành điện di (không cần ladder vì chỉ cần xác định xem DNA sau ly

trích có thật sự tồn tại hay không và đồng thời kiểm tra chất lượng của DNA)

2.3.2 Bài 2: Chạy PCR 16S để phát hiện vi khuẩn 16S

2.3.2.1 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ và máy móc dùng trong PCR

Sử dụng cặp primer 1489 (R) và 63 (F) thường được sử dụng cùng nhau trong phản

ứng PCR để khuếch đại vùng gen 16S của vi khuẩn

Dung dịch đệm TBE, thạch Agarose dùng trong điện di gel, Ethidium bromide dùng

để nhuộm gel, TAE (Tris-Acetate EDTA)

Máy ly tâm, bộ điện di, máy soi và chụp gel, máy luân nhiệt PCR

2.3.2.2 Các bước thực hiện quá trình chạy PCR

Bước 1: Vortex mẫu Q6 trong vòng 1 phút giúp mẫu đảm bảo quá trình phản ứng tiếp

xúc phân bố đều

Bước 2: Tổng 1 tube là 10µl : Cho 3µl nước tinh khiết (tỷ lệ 3µl cho 1 phản ứng)

vào tube mới cho tiếp 5µl Dream Taq, 0.5ul primer 1489 (R) và 0.5ul primer 63 (F) Sau

đó cho tiếp 1l mẫu DNA Q6 vào tube đậy kín nắp trộn đều và loại bỏ các bọt khí để đảm bảo các chất tiếp xúc, phân bố đều và đảm bảo quá trình truyền nhiệt tốt hơn

Hình 2.1 Vortex mẫu

Giai đoạn giữ nhiệt 4oC giúp bảo vệ DNA

Bước 4: Sau 1 giờ 27 phút lấy hỗn hợp phản ứng ra đem đi điện di

Bước 5: Hút 1l gel red với 4µl hỗn hợp phản ứng sản phẩm PCR sau đó hút 5µl

hỗn hợp trộn đều trên vào giếng để điện di Đợi trong vòng 25 phút

Hình 2.2 Các thành phần phản ứng Hình 2.3 Tube hỗn hợp phản ứng chạy PCR

Hình 2.4 Quá trình chạy luân nhiệt PCR

2.3.3 Bài 3: PCR và điện di DNA phát hiện Salmonella

2.3.3.1 PCR mẫu DNA Salmonella

Bước 1: Mẫu DNA Q6 đựng trong tube được votex trước khi thêm hóa chất để tiến hành

PCR mẫu

Bước 2: Lấy một tube mới lần lượt dùng micropipet hút 0,5 µl primer 63F, 0,5 µl

primer 1489R, 3 µl H2O, 5 µl dream Taq và cuối cùng là DNA mẫu Q6, sau đó trộn thật

Sau phản ứng Thời gian 3 phút 30 giây 30 giây 30 giây 7 phút ∞

Hình 2.5 Voter tube chứa DNA

8

2.3.3.2 Điện di mẫu DNA Salmonella

Sản phẩm DNA sau PCR, được điện di để xác định Salmonella có kết quả dương tính

hay âm tính

Bước 1: Đổ agarose với thành phần có khối lượng và nồng độ là 0,35 g gel agarose

1%, 35 ml TBE 0,5X ta sẽ quay nóng đến khi các thành phần dung dịch trong lại, đồng nhất với nhau và chờ đến khi nhiệt độ dung dịch giảm xuống chạm vào thành hũ thủy tinh đựng dung dịch thấy ấm là được Đổ dung dịch ra khuôn có lược răng cưa Chờ để dung dịch đông lại

Bước 2: Sử dụng micropipette lấy 1 µl gel red 0,6 X, 0,5 µl loading dye, 4 µl DNA

mẫu Q6 sau khi thực hiện phản ứng PCR

Bước 3: Dùng micropipette hút hỗn hợp cho vào giếng, sau đó lặp lại tương tự với

các mẫu tương tự cùng với Ladder 1Kb, đối chứng dương, đối chứng âm

Bước 4: Thiết lặp máy điện di chạy trong 30 phút

Hình 2.6 Màn hình hiển thị đã thiết lặp chạy trên máy PCR

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Bài 1: Kiểm tra DNA tổng số

Cần luyện tập thao tác nhiều hơn với các thiết bị phòng thí nghiệm và chú ý trong quá trình điện di phải thao tác một cách cẩn thận, quan sát kỹ trong quá trình mix mẫu và hút hóa chất/ DNA phải đảm bảo thu nhận được mẫu Trong quá trình thực hiện đưa mẫu DNA vào các giếng của gel agarose phải thao tác một cách nhanh chóng để tránh mất màu sau khi điện di

Hình 3.1 Kết quả bài 1

Đây không phải là kết quả chính xác về mẫu DNA mà nhóm thực hiện Mẫu DNA mà nhóm nhận được là Q6 theo kết quả đúng sẽ có chứa vi khuẩn 16S

Việc điện di mẫu không chính xác của nhóm có thể do quá trình thao tác chưa cẩn thận, chưa thực hiện kỹ trong quá trình mix mẫu và hút hóa chất hoặc khi hút mẫu chưa thu nhận được DNA nên cần phải đảm bảo thu nhận được mẫu Cần thao tác luyện tập nhiều hơn ở các bước thực hiện việc hút, mix mẫu hóa chất và trong quá trình thực hiện đưa mẫu DNA vào các giếng của gel agarose phải thao tác một cách nhanh chóng để tránh mất màu sau khi điện di

Hình 3.2 Kết quả bài 2

3.3 Bài 3: PCR và điện di DNA phát hiện Salmonella

3.3.1 Kết quả bài 3 – Lần 1

Sau khi thực hiện điện di mẫu trong thời gian 25 phút ở 100V, nhóm 6 (mẫu Q6) ghi nhận

được kết quả chạy điện di như hình 3.3:

Hình ảnh bảng điện di không ghi nhận hiển thị band của mẫu ở vị trí thứ 6 của nhóm Đối chứng (-) xuất hiện vạch band trên bảng điện di

3.3.2 Thảo luận

Kết quả ghi nhận không xuất hiện band của mẫu DNA ở vị trí thứ 6 có thể là do trong quá trình thực hiện việc mix mẫu hoặc votex mẫu chưa đều, hoặc do thao tác trong quá trình hút mẫu vào giếng của gel agarose

Đối chứng (-) xuất hiện vạch band trên bảng điện di chứng tỏ trong quá trình thao tác thực hiện mix mẫu và cho đối chứng vào giếng đã gây nhiễm mẫu dẫn đến mẫu đối chứng hiện thị band trên bảng điện di

Không thể đọc và ghi nhận kết quả của các kết quả mẫu DNA thực hiện của bài 3, cần thực

hiện lại để xác định, so sánh kết quả mẫu DNA và đối chứng có sự xuất hiện của vi khuẩn

Salmonella sp hay không

Hình 3.3 Kết quả bài 3 (lần 1)

12

3.3.3 Kết quả bài 3 - Lần 2

Sau khi thực hiện điện di mẫu trong thời gian 25 phút ở 100V, nhóm 6 (mẫu Q6) ghi nhận

được kết quả chạy điện di như hình 3.4:

Hình ảnh bảng điện di ghi nhận hiển thị band của mẫu ở vị trí thứ 6 của nhóm nhưng vạch sáng hiển thị band mờ, không rõ ràng

Hình 3.4 Kết quả bài 3 (lần 2)

Hình 3.5 Kết quả bài thử lại các mẫu

3.3.4 Thảo luận

Mẫu DNA của nhóm 6 ở hình 3.4 ghi nhận xuất hiện band của mẫu DNA ở vị trí thứ 6 tuy nhiên chưa hiển thị vạch sáng rõ ràng Kết quả này xuất hiện ở tất cả các nhóm và chưa cho ra kết quả band hiển thị một cách rõ ràng

Khi thực hiện chạy lại mẫu DNA của ca học sáng thứ 3, bảng điện di hiển thị rõ ràng các vạch sáng band và ghi nhận được mẫu DNA của nhóm 6 (Q6) có sự xuất hiện của vi khuẩn

14

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Su LH and Chiu CH (2007) Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature Chang Gung Med J 30(3):210-9

2 Johnson R, Mylona E, Frankel G.(2008) Typhoidal Salmonella: Distinctive virulence factors and pathogenesis Cell Microbiol 20(9):e12939