Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 3 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC VI SINH Môn học : SINH HỌC VI SINH Giảng viên hướng dẫn : TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HỒNG Nhóm sinh viên thực : NHÓM 3, T6, Tiết Năm học : 2022 – 2023 Tháng 10-2022 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM STT HỌ TÊN MSSV 01 Đặng Thị Bảo Quyên 21126482 02 Hen Rích 21126488 03 Nguyễn Văn Tân 21126493 04 Nguyễn Phúc Thiện 21126514 05 Nguyễn Thị Thuỳ 21126529 06 Võ Linh Thư 21126525 07 Lê Thị Thùy Trang 21126550 KÝ TÊN MỤC LỤC I TIẾN HÀNH TẬP GÓI ĐĨA……………………………………………… .1 II CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH…….2 III NHUỘM GRAM VÀ QUAN SÁT NẤM………………………………… 13 TIẾN HÀNH TẬP GÓI ĐĨA Nguyên liệu: - Giấy báo - Đĩa (từ 8-10 đĩa) Quy trình thực hiện: Sau đĩa rửa sạch, để khơ tiến hành gói đĩa đem hấp khử trùng Bước 1: Lựa chọn giấy báo có kích thước phù hợp Xếp đĩa thành chồng khoảng mười đĩa, đặt mặt phẳng Bước 2: Đặt chồng đĩa nằm ngang dọc mép ngang tờ giấy báo, quấn giấy báo quanh 2/3 chồng đĩa nằm ngang, gấp hai mép giấy vng góc mặt phẳng Bước 3: Một tay cầm chặt, làm trước phía, đẩy nhẹ trước sử dụng ba ngón tay gấp mép giấy theo hướng xéo 1/3 đĩa ép sát vào vành đĩa, đẩy nhẹ trước gấp thêm nếp gấp nữa, chuyển tay gấp bên cịn lại Bước 4: Tiếp tục cuộn phía trước, gấp đến hết mép giấy hai đầu, gấp mép giấy cuối song song với mép giấy giữ 1/2 mép giấy cuối gấp vng góc với mép giấy để chặt, tiến hành làm bên cịn lại Mục đích cần gói đĩa: Hạn chế nhiễm vi sinh vật hiếu khí vào đĩa, dễ dàng di chuyển vào nồi hấp Lưu ý: Cần gói chặt tay, tránh lỏng lẻo, gấp mép giấy thứ hai trở xéo 1/3 đĩa tránh gấp vng góc vào tâm Hình a Hình b Hình Hình a,b) Một chồng gói mười đĩa chụp mặt CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH Thực hành công việc sau: tập xoay đĩa, chuẩn bị mơi trường dịch trích giá đậu, đổ đĩa môi trường luyện tập thao tác cấy I Cách pha chế mơi trường, cần xác: Gồm bước sau: - Cân thành phần môi trường - Nếu môi trường lỏng: pha thành phần vào nước, ý thứ tự pha chế - Nếu mơi trường đặc: hịa tan thành phần vào nước thêm 1,5-2% agar đun đến agar tan chảy - Lọc: thường lọc môi trường qua vải - Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật yêu cầu nghiên cứu - Phân phối vào dụng cụ chứa: bình chứa cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, làm mơi trường thạch đĩa cho vào khoảng 10-15ml/đĩa, làm thạch nghiêng cho vào 1/4-1/5 chiều cao ống nghiệm - Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC, atm) nhằm tiêu diệt tất bào tử vi sinh vật khơng mong muốn có sẵn môi trường Thực pha chế môi trường dịch trích giá đậu: 2.1 Nguyên liệu: - Giá đậu: 100g - Glucose: 5g - Trypton: 2.5g - Yeast extract: 0.5g - Agar: 7.5g - H2O: 500 ml 2.2 Quy trình thực hiện: Bước 1: Cân nguyên liệu cần sử dụng có thành phần mơi trường vào bình chứa Bước 2: Đun 100g giá đậu với 700-800ml H2O để sôi 20 phút, lọc lấy môi trường dịch giá đậu qua vải rây lọc Bước 3: Sử dụng ống đong đong 500ml môi trường dịch giá đậu lọc cho vào bình chứa nguyên liệu cân bước 1, lắc hỗn hợp Bước 4: Sử dụng ống đong phân phối vào bình chứa bình 250ml hỗn hợp bước 3, hơ miệng bình chứa hỗn hợp đèn cồn để khử khuẩn miệng bình chứa, sử dụng nút bơng khơng thấm nước để đóng chặt miệng bình chứa, bao quanh lớp báo cố định dây thun đem tiệt trùng 121oC 15 phút Lưu ý: - Sử dụng giấy bạc, giấy kính khơng thấm nước đặt lên cân để cân nguyên liệu - Cần xoay tròn nút bơng để đóng chặt miệng tránh ép vỡ bình mơi trường, đóng chặt nút bơng khơng để mơi trường chạm vào nút bơng, đóng khơng chặt dẫn đến tình trạng số vi sinh vật xâm nhập vào môi trường Hình 2: Mơi trường dịch trích giá đậu II Tiến hành công việc đổ đĩa tủ cấy: Sau chuẩn bị môi trường, thực công việc đổ đĩa Các bước khử khuẩn trước tiến hành công việc đổ đĩa: Bước 1: Rửa tay, xịt cồn 70o sát khuẩn tay, tiến hành lau tủ cấy, xịt cồn 70o sử dụng giấy vải lau tủ cấy nhằm hạn chế vi sinh vật, lau chiều từ xuống, lau hai bên thành tủ cấy, lưu ý tay không chạm vào mặt kính tủ, lau mặt bàn tủ cấy, cuối lau mặt kính tủ, tiến hành lau phía cịn lại Bước 2: Khử khuẩn vật dụng cần sử dụng trước đem vào tủ cấy cồn 70o, lau bề mặt vật dụng (đĩa petri, đèn cồn, bút, bật lửa ) cồn 70o cần cho việc thao tác Các bước tiến hành thao tác đổ đĩa: Bước 1: Sắp xếp vật dụng theo chiều tay thuận để thuận tiện cho người cấy phạm vi làm việc tủ cấy Ngồi vị trí thoải mái, hai tay thao tác phạm vi thao tác tủ cấy Bước 2: Tiến hành đổ đĩa, thực thao tác gần đèn cồn, hơ nút lửa đèn cồn, tiến hành mở nút bơng bình mơi trường cách xoay trịn nút bơng, đặt nút bơng chỗ quy định, cần khử khuẩn xung quanh miệng bình mơi trường đèn cồn Bước 3: Lấy đĩa, xoay vành đĩa đèn cồn nhằm khử khuẩn bề mặt xung quanh đĩa, mở đĩa để đổ môi trường cần phải giữ thăng đĩa, tiến hành thao tác gần đèn cồn Bước 4: Tiến hành đổ đĩa, đổ môi trường 2/3 đĩa, nghiên nhẹ cho môi trường trải đĩa, hơ qua đèn cồn vị trí vừa mở nắp để đổ đĩa xoay vành đĩa nhằm khử khuẩn, đặt nhẹ đĩa xuống mặt bàn tủ cấy, khử khuẩn miệng bình mơi trường đèn cồn, tiếp tục thực thao tác đổ đĩa đạt yêu cầu số lượng Bước 5: Khử khuẩn miệng bình mơi trường, xoay nút bơng để đóng bình mơi trường không thực thao tác đổ đĩa nữa, xếp chồng gọn đĩa đổ môi trường, tắt đèn cồn, lặp lại bước khử khuẩn tủ cấy vật dụng kết thúc công việc Lưu ý: - Thao tác phạm vi tủ cấy thực gần đèn cồn nhằm hạn chế vi sinh vật - Không chống tay thực thao tác tủ cấy, gây nguy hiểm thao tác với đèn cồn - Khi lấy nút bơng cần xoay trịn nút bơng để kéo tất bám miệng bình mơi trường để tránh nhiễm vi sinh vật - Thao tác quay đĩa vừa phải, nhanh dẫn đến chưa khử khuẩn kịp, chậm dễ gây bỏng trình xoay đĩa để khử khuẩn đĩa - Mở đĩa nhỏ để tỉ lệ nhiễm vi sinh vật khác thấp - Đổ môi trường q dẫn đến tính trạng dễ bị rách mơi trường, đổ nhiều môi trường gây tốn môi trường dẫn đến mơi trường dính lây lan lên nắp đĩa làm tỷ lệ nhiễm vi sinh vật khác nhanh đổ mơi trường lỏng nóng nước bốc lên bám nắp đĩa mà kết hợp dinh dưỡng tạo môi trường cho vi sinh vật khác phát triển nên tỷ lệ nhiễm vi sinh vật khác cao III Phương pháp cấy: Các kĩ thuật cấy: Để chuyển vi sinh vật từ mơi trường rắn sang mơi trường khác người ta chủ yếu sử dụng que cấy vòng/thẳng que cấy móc Khi sử dụng que cấy, thường que cấy tiệt trùng lửa đèn cồn đèn Bunsel Khi tiệt trùng phải đảm bảo đầu que cấy thành phần que cấy phải tiệt trùng hồn tồn cách đốt nóng đỏ (quy tắc giây) Luyện tập thao tác cấy: 2.1 Nhiệm vụ: Thực thao tác cấy sử dụng que cấy vòng, que cấy trãi, que cấy móc mơi trường dịch trích giá đậu (GD) mơi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Mỗi nhóm 18 đĩa, thành viên thực đổ đĩa cho thao tác cấy loại môi trường 2.2 Tiến hành thao tác cấy: 2.2.1 Các bước khử khuẩn trước thực thao tác cấy tủ cấy: Tương tự việc đổ đĩa, trước cấy cần khử khuẩn tay, tủ cấy dụng cụ trước cho vào tủ cấy Bước 1: Rửa tay, xịt cồn 70o sát khuẩn tay, tiến hành lau tủ cấy, xịt cồn 70o sử dụng giấy vải lau tủ cấy nhằm hạn chế vi sinh vật, lau chiều từ xuống, lau hai bên thành tủ cấy, lưu ý tay không chạm vào mặt kính tủ, lau mặt bàn tủ cấy, cuối lau mặt kính tủ, tiến hành lau phía lại Bước 2: Khử khuẩn vật dụng (đĩa petri, đèn cồn, bút, bật lửa, lọ cồn chứa que cấy, mẫu cấy…) cần sử dụng trước đem vào tủ cấy cồn 70o, lau bề mặt vật dụng cần cho việc thao tác, xếp gọn gàng thuận với chiều tay thao tác 2.2.2 Cấy đĩa mơi trường thạch khoai tây (PDA) que cấy móc: 2.2.2.1 Các bước tiến hành: Bước 1: Thực tất bước khử khuẩn trước cấy nêu Bật đèn cồn, thực thao tác gần đèn cồn, ghi thông tin nắp đĩa cấy, điều chỉnh lại vị trí ngồi Bước 2: Lấy que cấy móc hơ lửa đèn cồn đến đỏ đầu que cấy, xoay theo phương ngang hơ đến tay cầm que cấy móc, xoay tròn que cấy để tiệt trùng hết que cấy, đốt đầu que cấy đỏ lần Bước 3: Tiến hành lấy mẫu đĩa có nấm, khuẩn (kiểm tra độ nóng cách chạm vào mơi trường khơng có nấm, khuẩn), thực thao tác hai tay, tay cầm que cấy, tay cầm đĩa, xoay vành đĩa có nấm, khuẩn lửa đèn cồn, tiến hành lấy mẫu, ngón mở nhỏ đĩa chứa mẫu sử dụng que cấy tiệt trùng cào nhẹ lên vùng có nấm, khuẩn, lấy mẫu ra, đậy nắp đĩa sau tiếp tục xoay đĩa chứa mẫu lửa đèn cồn để tránh vi sinh vật xâm nhập Bước 4: Tiếp đến lấy đĩa môi trường mới, tiến hành xoay đĩa lửa đèn cồn sau mở nhỏ nắp đĩa thực thao tác cấy móc chấm điểm (3 điểm tam giác, điểm đối xứng), kết thúc cấy móc, tiếp tục xoay vành đĩa lửa đèn cồn để hạn chế vi sinh vật khác xâm nhập, cuối khử khuẩn que cấy móc lửa đèn cồn, úp ngược đĩa cấy hoàn thành, đem đĩa bảo quản Lưu ý: - Thực thao tác gần đèn cồn, phạm vi tủ cấy - Tiệt trùng kĩ que cấy tránh nhiễm vi sinh vật khác - Khử khuẩn vành đĩa cẩn thận 2.2.2.2 Tiến hành đánh giá kết quả: Hình a Hình b Hình a,b: Cấy nấm đĩa mơi trường thạch que cấy móc Nhận xét: Hình a) Tình trạng bị nhiễm vi sinh vật khác xung quanh vành đĩa Hình b) Tình trạng nấm cấy không lên, không phát triển 2.2.2.3 Đánh giá nguyên nhân, mục đích hướng khắc phụ: a Nguyên nhân: - Khi lấy mẫu nấm, que cấy nóng chưa kiểm tra độ nóng cách chạm vào mơi trường khơng có nấm, khuẩn lấy mẫu trực tiếp gây tình trạng làm chết nấm, tiến hành cấy khơng nhận kết (Hình b) - Trong trình cấy que cấy chưa khử khuẩn kĩ dẫn đến tình trạng nhiễm vi sinh vật khác (Hình a,b) - Tay chưa sát khuẩn, vành đĩa chưa khử khuẩn cẩn thận, gây tình trạng nhiễm vi sinh vật quanh vành đĩa (Hình a,b) - Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc q đơng người, q trình thao tác thực tiệt trùng khơng kĩ gây tình trạng nhiễm vi sinh vật xung quanh (Hình a,b) b Mục đích: - Được sử dụng cấy chuyền nhằm mục đích chuyển vi sinh vật từ mơi trường cũ sang môi trường c Hướng khắc phục: - Tiệt trùng que cấy cẩn thận, sát khuẩn tay cẩn thận, cải thiện môi trường làm việc xung quanh hạn chế người - Khi thao tác xong úp ngược đĩa - Kiểm tra độ nóng que cấy trước lấy mẫu để cấy - Luyện tập nâng cao kỹ 2.2.3 Thực kỹ thuật cấy ria chữ T, cấy đĩa môi trường giá đậu que cấy vòng: 2.2.3.1 Các bước tiến hành: Bước 1: Thực tất bước khử khuẩn trước cấy nêu Bật đèn cồn, thực thao tác gần đèn cồn, ghi thông tin nắp đĩa cấy, điều chỉnh lại vị trí ngồi Bước 2: Lấy que cấy vòng hơ lửa đèn cồn đến đỏ đầu que cấy, xoay theo phương ngang hơ đến tay cầm que cấy vòng, xoay tròn que cấy để tiệt trùng hết que cấy, đốt đầu que cấy đến đỏ thêm lần Bước 3: Tiến hành lấy mẫu đĩa có nấm, khuẩn (kiểm tra độ nóng cách chạm vào mơi trường khơng có nấm, khuẩn), thực thao tác hai tay, tay cầm que cấy, tay cầm đĩa, xoay vành đĩa có nấm, khuẩn lửa đèn cồn, tiến hành lấy mẫu, ngón mở nhỏ đĩa chứa mẫu sử dụng que cấy vòng tiệt trùng cào nhẹ lên vùng có nấm, khuẩn, lấy mẫu ra, đậy nắp đĩa sau tiếp tục xoay đĩa chứa mẫu lửa đèn cồn để tránh vi sinh vật xâm nhập Bước 4: Tiếp đến lấy đĩa môi trường giá đỗ, tiến hành xoay đĩa lửa đèn cồn sau mở nhỏ nắp đĩa ta thực thao tác cấy ria chữ T, đặt que cấy vào góc xa đĩa thạch, áp que cấy xuống đĩa thạch bắt đầu ria theo đường Z dày (tạo sinh khối dày) sát vào đến khoảng 1/3 đĩa thạch ta dừng lại, đậy nắp quay 90o hơ lửa đèn cồn, kéo đường từ vùng thứ sang vùng thứ tiếp tục ria cấy đường Z (tạo sinh khối thưa vùng thứ nhất) sát vào không chạm vào vùng thứ nữa, đến thạch lại ta xoay 90o khử khuẩn lửa đèn cồn, ta kéo đường vùng thứ sang vùng thứ ria theo đường Z (thưa vùng thứ 2), đậy nắp hơ lửa đèn cồn, tiệt trùng que cấy vòng, úp ngược đĩa cấy hồn thành, đem đĩa bảo quản Hình minh họa Bước Lưu ý: - Cẩn thận khoảng cách tạo sinh khối vùng - Thực thao tác gần đèn cồn, phạm vi tủ cấy - Tiệt trùng kĩ que cấy vòng tránh nhiễm vi sinh vật khác - Khử khuẩn vành đĩa cẩn thận - Tránh cấy đường cấy thứ sát 2.2.3.2 Tiến hành đánh giá kết quả: Hình a Hình b Hình a,b: Kỹ thuật cấy ria, cấy que cấy vịng Nhận xét: Hình a: Chưa cấy hết khung đĩa, đường cấy sau chạm vùng cấy trước tạo vùng sinh khối Hình b: Chưa cấy hết khung đĩa, đường cấy sau chạm vùng khác tạo vùng sinh khối bị nhiễm vi sinh vật khác, đường sinh khối thứ chưa bắt ngang từ vùng sinh khối thứ 2.2.3.3 Đánh giá nguyên nhân, mục đích hướng khắc phục: a Nguyên nhân: - Trong trình cấy que cấy chưa tiệt trùng kĩ dẫn đến tình trạng nhiễm vi sinh vật khác ( Hình a,b) - Tay, vành đĩa chưa khử khuẩn cẩn thận, gây tình trạng nhiễm vi sinh vật quanh vành đĩa ( Hình a,b) - Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc q đơng người, q trình thao tác thực khử trùng khơng kỹ gây tình trạng nhiễm vi sinh vật xung quanh (Hình a,b) - Kỹ cấy chưa tốt ( Hình a,b) b Mục đích: - Được sử dụng cấy chuyền nhằm mục đích chuyển vi sinh vật từ môi trường cũ sang môi trường c Hướng khắc phục: - Cấy hết khung đĩa - Khử khuẩn cẩn thận, cấy tròn vành đĩa hết khung đĩa - Cấy đường sinh khối, cấy thưa đường thứ tạo khuẩn lạc - Luyện tập nâng cao kỹ - Hạn chế người làm việc xung quanh tủ cấy 2.2.4 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy trãi, môi trường giá đậu (GD): 2.2.4.1 Các bước tiến hành: Bước 1: Thực tất bước khử khuẩn trước cấy nêu Bật đèn cồn, thực thao tác gần đèn cồn, lấy đĩa cấy dùng bút đánh dấu thông tin, điều chỉnh lại vị trí ngồi Bước 2: Xoay trịn tháo nút bơng đậy ống nghiệm, đặt nút bơng vị trí thích hợp, lấy ống nghiệm đựng dung dịch mẫu pha loãng, hơ miệng ống nghiệm lửa đèn cồn, lắc ống nghiệm trộn mẫu Sử dụng micropipet hút 100 µL mẫu, bơm mẫu vào đĩa mơi trường khử khuẩn vành đĩa lửa đèn cồn Khử khuẩn que cấy trãi lửa đèn cồn, mở đĩa (dùng que cấy trãi quét nhẹ lớp nước nắp đĩa (nếu có) chờ từ 10-15 giây để que cấy trãi giảm độ nóng) Bước 3: Cấy trãi cấy tay, tốc độ cấy nhanh, cấy trịn vành đĩa, cấy tới mặt mơi trường đĩa cấy khô (nhận diện nhờ ánh sáng đèn tủ cấy), kiểm tra xung quanh vành đĩa, đến khơ hồn tồn, đóng nắp, tiến hành khử khuẩn lại que cấy trãi vành đĩa hơ lửa đèn cồn, úp ngược đĩa cấy hoàn thành, đem đĩa bảo quản Lưu ý: - Trong trình thao tác sử dụng micropipet, tay cố định không dốc ngược micropipet - Dùng que cấy trãi quét nhẹ lớp nước nắp đĩa (nếu có) để tránh nhỏ xuống bề mặt môi trường dẫn đến kết đĩa cấy bị vết loang - Cấy tay, nhẹ nhàng, trịn vành đĩa cấy đến mặt đĩa khơ hoàn toàn 10 2.2.4.2 Tiến hành đánh giá kết quả: Hình b Hình a Hình c Hình a, b, c: Cấy đĩa môi trường thạch que trãi Nhận xét: Hình 5a: Cấy làm rách mơi trường, cấy trãi chưa khô tạo mảng vi sinh vật, chưa đĩa Hình 5b: Cấy chưa đều, vị trí giữ đĩa chưa khô bị nhiễm vi sinh vật khác Hình 5c: Cấy khơ tạo khuẩn lạc đơn nhiên chưa vành đĩa 11 2.2.4.3 Đánh giá nguyên nhân, mục đích hướng khắc phục: a Đánh giá nguyên nhân: - Thao tác mạnh tay dẫn đến rách mơi trường (Hình 5a) - Cấy không tay, cấy trãi chưa khô dẫn tới sai kết quả, sinh khối xếp chồng lên khơng tạo khuẩn lạc đơn (Hình 5a, b) - Môi trường xung quanh tủ cấy chưa đảm bảo, bị ảnh hưởng, làm việc q đơng người, q trình thao tác thực khử trùng (que cấy) không kỹ gây tình trạng nhiễm vi sinh vật xung quanh (Hình 5a, b, c) - Bị đọng nước nắp đĩa - Mật độ nấm men lúc pha loãng thấp - Que cấy trãi khử khuẩn hơ lửa đèn cồn chưa nguội trãi lên bề mặt môi trường dẫn đến mật độ nấm bị giảm chết b Mục đích: - Phân lập nấm, khuẩn, vi sinh vật - Đếm mật độ c Hướng khắc phục: - Lắc ống nghiệm thủy tinh chứa mẫu, mật độ ổn định - Cấy khô, tay cấy vành đĩa - Hạn chế người làm việc xung quanh tủ cấy - Thao tác thực khử trùng (que cấy) kĩ - Luyện tập nâng cao kỹ 12 NHUỘM GRAM VÀ QUAN SÁT NẤM I Nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram dương: Thành tế bào vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan (phức chất protein-đường) dày, chúng liên kết chặt chẽ với giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu, giữ ngun màu tím ban đầu khơng bị ảnh hưởng yếu tố tuổi, tác dụng kháng sinh… Vi khuẩn Gram âm: Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ protein màng ngoài, có thành phần lipid nồng độ cao chúng hịa tan chất khử màu (alcohol ), phức hợp tinh thể tím violet-iodine khơng bền, bị tẩy màu màu thay đổi thuốc nhuộm khác Dựa vào hai đặc điểm trên, ta quan sát thấy bắt màu tím vi khuẩn Gram dương, cịn thấy màu hồng vi khuẩn Gram âm Vật liệu, hóa chất Sử dụng vi sinh vật sau để thí nghiệm: a Vật liệu, hóa chất: - Dung dịch Crystal violet - Dung dịch Lugol - Dung dịch tẩy màu (dung dịch Alcohol 95%) - Dung dịch Safranin b Sử dụng vi sinh vật sau để thí nghiệm: - Staphylococcus sp - Bacillus subtilis - E Coli Quy trình thực hiện: Quy trình thực loại vi sinh vật giống Bước 1: Chuẩn bị vết bôi cố định vi sinh vật từ 3-5 phút Lấy lame lau qua khăn giấy hơ qua đèn cồn để loại bỏ tạp chất vi sinh vật khác lame, dùng bút đánh dấu tên mặt cấy Sử dụng que cấy vòng tiệt trùng, tiến hành lấy mẫu (lưu ý: nhiệt độ que cấy tránh làm chết khuẩn), trải mỏng lên lame phần đánh dấu, dùng que 13 cấy vịng xoay trịn để cố định mẫu (có thể hơ nhanh lame qua lửa đèn cồn), chờ mẫu khô Đối với khuẩn môi trường lỏng: lấy dịch lỏng chứa mẫu cho trực tiếp lên lame trải Đối với khuẩn bề mặt thạch: lấy nước cất nước vô trùng nhỏ sẵn lame, cào nhẹ lấy mẫu khuẩn, tiến hành bước Bước 2: Dùng dung dịch Crystal violet phủ lên vết bôi Để yên phút Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Crystal violet, trải đều, để phút Để nghiêng lame 45o, rửa nhanh lame nước cất cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối chảy khỏi lame khơng cịn màu) Lưu ý: Khơng xịt trực tiếp vào vùng cố định vi sinh vật Bước 3: Phủ dung dịch Lugol lên vết bôi Để yên phút Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Lugol, trải đều, để phút Để nghiêng lame 45o, tẩy màu dung dịch Alcohol 95% đến giọt cuối chảy khỏi lame khơng cịn màu (khoảng 10-20 giây) Ngay rửa lame với nước cất (khoảng 15 giây) Lưu ý: Đây bước quan trọng Nếu bị tẩy màu mức, số vi khuẩn Gram dương bị màu tím trở thành Gram âm (bị nhuộm hồng) sau nhuộm màu lần thứ Bước 4: Phủ dung dịch Safranin lên vết bôi Để yên phút Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Safranin lên vết bôi, trải đều, để yêu phút Để nghiêng lame 45o Rửa nước (khoảng 15 giây) Bước 5: Để khơ lame trước quan sát kính hiển vi Sử dụng dầu soi kính vật dầu để quan sát kính hiển vi 14 Tóm tắt: Thứ tự Gram (+) Thuốc thử Gram (-) Tím Crystal violet Tím Tím Lugol Tím Tím Tẩy Alcohol 95% Khơng màu Tím Safranin Hồng Quan sát vi sinh vật vừa nhuộm kính hiển vi đánh giá kết quả: STT Vi Sinh Vật Staphylococcus sp Bacillus subtilis E Coli Gram Gram (+) Gram (+) Gram (-) Hình a Màu Tím Tím Hồng Hình b Hình a, b: Quan sát Staphylococcus sp kính hiển vi Nhận xét: Staphylococcus sp có hình cầu, Gram (+) bắt màu tím 15 Hình a Hình b Hình a, b: Quan sát Bacillus subtilis kính hiển vi Nhận xét: Bacillus subtilis trực khuẩn, Gram (+) bắt màu tím, hình que, tế bào già khó bắt màu Hình a Hình b Hình a, b: Quan sát E Coli kính hiển vi Nhận xét: E Coli trực khuẩn Gram (-), hình que, bắt màu hồng 16 Một số lưu ý: - Một số giống vi khuẩn Gram dương “già” khả giữ màu phức chất violet-iodine nhầm lẫn thành Gram âm quan sát - Không làm vết bơi vi khuẩn q dày, địi hỏi thời gian tẩy màu lâu thuốc nhuộm thấm vào tế bào không đồng - Một số sai sót khác: Que cấy nóng, hơ mức cố định vi sinh vật lame  làm vỡ tế bào, từ màu tế bào Gram (+) bị rửa trơi làm sai kết - Nếu bị tẩy màu mức, số vi khuẩn Gram dương bị màu tím bị nhận diện Gram âm sau nhuộm màu lần thứ - Thời gian tẩy màu bắt màu yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết nhuộm Gram II Quan sát nấm: Nhận diện đặc điểm sinh thái đặc trưng quan sát kính hiển vi Nấm sợi Aspergillus thuộc lớp nấm bất tồn Deuteromycetes, khơng có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợ có vách ngăn Bào tử vơ tính bào tử trần Trichoderma thuộc lớp nấm bất tồn Deuteromycetes, có khuẩn lạc màu lục (khi tăng trưởng nắng mặt trời) Đây loại nấm đối kháng có chức khả kiểm sốt loại nấm vi sinh vật gây bệnh khác trồng Đặc biệt nấm Trichoderma hiệu với cao với loại nấm gây bệnh vùng rễ thơng dụng Nhóm nấm bất tồn nấm sinh sản vơ tính bào tử bụi mang giá bào tử có hình dạng khác xếp thành chuỗi (đính bào tử) đầu có cuống bào tử Quan sát nấm kính hiển vi: 17 Hình : Aspergillus sp Hình 10 : Trichoderma sp 18