BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử cơ bản COLONY PCR

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐIỀU DƯỠNG – KỸ THUẬT Y HỌC BỘ MÔN XÉT NGHIỆM BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN TRẦN HỒNG PHÚC LỚP XN19 – NHĨM GVHD: Nguyễn Hồng Tuyết Minh Nguyễn Thị Trúc Anh Buổi 1: 03/10/2022 COLONY PCR I Mục đíícchh: Phát tế bào vi khuẩn có mang tái tổ hợp gen mong muốn thời gian ngắn, tốn đơn giản II Dụụnng cụ: - Đĩa thạch chứa khúm khuẩn - Đầu côn, pipette, giấy - Máy ly tâm - Máy Nanodrop - Đầu tube eppendrof - Dung dịch sát khuẩn - Tăm vô khuẩn - Hóa chất : KTS5 IIII - Quuy trrììnnhh: Bước 1: Dùng tăm vô khuẩn ( đầu côn sạch) lấy khúm khuẩn cho vào đầu tube eppendrof chứa 30 µL dung dịch KTS5 - Bước 2: Trộn hỗn hợp đun cách thủy ( 90-100 oC) vòng phút Bước 3: Đem mẫu vừa đun cách thủy, quay ly tâm 13000 vòng/phút vòng phút - Bước 4: Dùng pipette hút 20 µL phần dịch cho vào đầu tube khác - Bước 5: Trộn hút µL dịch đem đo máy Nanodrop IV Kếết quuảả: TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 54.6 NG/ µL A260: 1,093 A280: 0,561 A260/A280: 1,95 A260/A230: 0,91 Nhận xét: Biểu đồ chưa có dạng hình chng chuẩn, lỗi kĩ thuật, thao tác chưa chuẩn, dụng cụ chưa đạt độ Đồ thi có đỉnh 260nm -> Có DNA mẫu với tỉ lệ cao Đồ thị có thêm đỉnh 230nm -> có xuất chất hữu Đồ thị khơng có đỉnh 280 nm -> có ngoại nhiễm protein A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết A260/A230 < 1.8 : Hiện diện lượng đáng kể chất hữu Buổi 2: 04/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA HBV I Mục đíícchh: - Tách chiết DNA HBV II Dụụnng cụụ: - Găng tay ( không bột) - Eppendorf tube - KTS1: Phenol, Guanin Isothiocynate, KTS2: Chloroform KTS3:Isopropanol Glyco-Blue KTS4: Ethanol 70% KTS5: DEPC Mẫu bệnh phẩm Pipette, đầu côn, lọ đựng dung dịch sát khuẩn Máy ly tâm, máy Nanodrop IIII Quuy trrììnnhh: Gồm 17 bước: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 60ºC Vortex kỹ ống DNA IC Cho vào epp µl DNA IC Cho vào eppendorf 900 µl KTS1-R Cho 100 µl huyết vào ống Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 7.Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Thêm 600 µl KTS3 10 Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 11 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 12 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 13 Nhẹ nhàng thêm vào 900 µl KTS4 14 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 15 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 16 Làm khô cặn 10 phút 60ºC bồn ủ nhiệt khơ 17 RT .HịaNếucặnchưatrongchạy10PCRµl KTS5liềnthì.Thựcbảo quảnhiện ngở2ayphản 8ºC ứng 2phiên-3gày, mã ngược -20ºC vòng tháng * Sau đó, đo DNA máy Nanodrop ghi nhận kết IV Kếết quuảả: TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 533,4 ng/ µL A260: 10,669 A280: 5,621 A260/A280: 1.90 A260/A230: 2.4 Nhận xét: Đồ thị có Đỉnh 260, lệch 270 => có lượng DNA cao xuất lượng Protein đáng kể A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết A260/A230 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết Kết luận: Mẫu đạt độ tinh Buổi 3: 05/10/2022 KỸ THUẬT PCR I Mục đíícch: - PCR trình tổng hợp sợi DNA dựa DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác enzyme DNA polumerase II Chhuuẩẩn bịị: Dụụnng cụụ: -Máy PCR + hệ thống máy tínính -Găng tay khơng bột, ống Eppendorf -Đầu cơn, micropipipetettes, máy Vorortetex Hóóa chhấấtt: -DNA IC DNA chứng nội ngoạoại sininh -Maasstteer Miixx: o Tris – HCl pH 0.8, KCl, MgCl2 o dATP, dTTP dCTP, dGTP o Taq DNA polymerase -Prriimmoobbe Miixx: o Hệ mồi nhân vùng gene S HBV o TaqMan đặc hiệu cho HBV (FAM) o Hệ mồi nhân DNA IC o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX) IIII Quuy trììnnh thựực hiiệệnn: Rã đơng mẫu hồn tồn cách đặt nhiệt độ phòng tối đa 30 phút Sau ly tâm nhẹ 3000-4000 rpm đặt vào rack lạnh Chuẩn bị eppendorf 0.2ml, đánh số thứ tự ghi vào tờ giấy thông tin mẫu (ngày làm mẫu, người thực hiện, số) thêm eppendorf 0.2ml để chứa mẫu PC (positive control) Đem mẫu eppendorf vào buồng ATSH để thực Hút 5µl mẫu DNA XN vào eppendorf 0.2ml để Trộn thành bọt Lưu ý: cho mẫu vào hết sau đến PC cuối tránhĐem qngoạiuaylynhiễmtâm30.00 vòng/phút phút Tiến hành đem mẫu PCR Cách chỉnh chu kỳ nhiệt: Tạo folder, tạo chương trình cho HBV Chỉnh chu kỳ nhiệt theo kit: chu kỳ 95°C 15 phút 40 chu kỳ 95°C - 20 giây 60°C - phút (đọc tín hiệu) IV Kếết quuảả: Nhận xét: Kết Unknow IC mẫu -> tách chiết thất bại, cần thực lại Nguyên nhân: Do trình thao tác người thực Không trộn ống MasterMix máy vortex Sử dụng eppendorf strip phù hợp với máy Realtime PCR Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng 4.Vortex nhẹ dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết dung dịch Chứng dương Cho µl dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dung dịch Chứng dương nước cất lần vào ống eppendorf/ strip riêng lẻ chuẩn bị Bước 18 Lưu ý: Phản ứng Real-time PCR phải đặt vào máy chạy vòng sau bổ sung dịch DNA Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu phản ứng cho Chứng âm tách chiết, phản ứng cho Chứng dương phản ứng với nước cất lần làm chứng âm PCR Thứ tự chuẩn bị phản ứng phải là: Chứng âm PCR -> Chứng âm tách chiết ->Mẫu xét nghiệm -> Chứng dương 6.Đậy nắp eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) đặt vào máy Real-time PCR 6.1 Cài đặt vị trí mẫu block nhiệt máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM, HEX 6.2 Cài đặt chương trình sau: chu kì 950C – 15 phút 45 chu kì 950C – 20 giây; 570C – phút V Kếết quuảả: - Dựa vào tính hiệu huỳnh quan IC mẫu để định tính - Cả IC mẫu ngưỡng phát quy trình => Dương tính với DNA HP Nồng độ vi khuẩn ban đầu tỉ lệ nghịch với chu kỳ khuếch đại DNA Buổi 8: 20/10/2022 THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HBV I Mục đíícchh: - II Biết thứ tự xếp DNA virus gây nên HBV Chhuuẩẩn bịị: - Laptop có phần mềm Bioioededit - File chứa đoạn DNA mạch đơn (mẫu làm PCR) IIII Quuy trrììnnh thhựực hiiệện Bưướớc PCCR Bước Làm sạcạch sản phẩm PCR Bước Phản ứng giải trình tự (sequencing PCR) với loại ddNTPs Bước Làm sản phẩhẩm giải trình tự Bướớc Điệiện di mao quản Bước Phân tích trình tự giải phần mềm chun dụng theo phương pháp stranger IV Nhhậận xét kết quuảả: - Dựa vào kết PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm giải mã gen HBV hình -Kết định type vi khuẩn theo bảng sau: BUỔI – NGÀY 1/11/2022 I TÁCH CHIẾT HCV RNA Mục đíícch: - Xử lý huyết để thu RNA HCV II Chhuuẩẩn bịị Dụụnng cụụ: Micropipette (10 µl, 200 µl, 1000 µl) Máy quay ly tâm Máy lắc trộn (votex) Bồn ủ nhiệt khơ Đầu Hóóa chhấấtt: Huyết Bộ hóa chất tách chiến RNA AccuRive pRNA Prepkit – EX –RNA01.1A Thành phần hóa chất: - KTS1: Phenol, Guanin Isothiocynate, - KTS2: Chloroform - KTS3:Isopropanol Glyco-Blue - KTS4: Ethanol 70% - KTS5: DEPC IIII Quuy trrììnnh thựực hiiệệnn: Bước Chuẩn bị eppendorf 1,5 ml, ghi tên mẫu, người thực Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Bước Cho tiếp vào eppendororf 900 µl KTS1 – R Lưu ý: cần trộn dung dịch trước sử dụng Bưướớc Chho 1000 µl huyết vào eppendorf Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để yên 10 phút Bưướớc Chho 2000 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Bước Bước Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bưướớc Chhuuyyểển 6000 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml Chuẩn bị eppendorf 1,5 ml có ghi tên mẫu, người thực Lưu ý: thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Bưướớc Thhêêm 600 µl KTS3 Lưu ý: cần trộn dung dịch trước sử dụng Bước Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút Bước 10 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bước 11 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 12 Thêm 900 µl KTS4 (có thể rửa lần) Bước 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng Bước 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 15 Làm khô cặn 10 phút 60 C bồn ủ nhiệt khơ Bước 16 Hịa cặn 20 µl KTS5 Nếu khơng tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản RNA tách chiết 2-8 0C vòng 2-3 ngày, - 200C vòng tháng IV Kiểm tra độ tininh mẫu máy Nanodrop: - Khởi động máy tính kết nối với Nanodrop chọn phần đo Acid nucleic - Rửa máy: µl nước cất - Đo blank: dùng pipette hút – µl dung dịch TE vào vị trí đo, đóng cánh tay máy lại đo blank, sau dùng khăn giấy lau - Điền Sample ID trước đo mẫu - Hút – microllit dung dịch ống tube vào vị trí đo, đóng cánh tay máy, ấn Measure để thực đo mẫu - Đọc kết V Nhhậận xéét kếết quuảả: - Type RNA : 40 - Conc: 28.6 - A260: 0.715 - A280: 0.498 - 260/280: 1.43 < 1.8 - 260/230: 0.16 < 1.8 -Mẫu tách chiết không tinh - Nguyên nhân: Do thao tác kỹ thuật, không tuân thủ thời gian phản ứng, thuốc thử, dụng cụ tái sử dụng dẫn tới có ngoại nhiễm chất hữu BUỔI 10 – NGÀY 3/11/2022 CHẠY KẾT QUẢ REAL TIME PCR HCV I Mục đíícch: - PCR trình tổng hợp sợi RNA dựa RNA khn nhờ hoạt động xúc tác enzyme RNA polymerase II Chhuuẩẩn bịị: Dụụnng cụụ: - Máy PCR + hệ thống máy tính - Găng tay khơng bột, ống Eppendorf - Đầu cơn, micropipettes - Máy Vortex Hóóa chhấấtt: - DNA IC: DNA chứng nội ngoại sinh Master Mix: - o Tris – HCl pH 0.8, KCl, MgCl2 o o dATP, dTTP dCTP, dGTP Taq DNA polymerase - Primobe Mix: Hệ mồi nhân vùng gene S Hp o TaqMan đặc hiệu cho Hp(FAM) o Hệ mồi nhân DNA IC o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX) Mẫẫuu: o - RNA gene vi khuẩn HCV có mẫu huyết IIII Ngguuyyêên tắắcc: - Hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica), phụ thuộc vào nồng độ muối pH dung dịch ly giải tế bào - DNA dung giải khỏi màng IV Quuy trrììnnh thhựực hiiệệnn: Bước Rã đông ống MasterMix, PrimobeMix chứng dương hồn tồn nhẹ5bằng– 10cáchgiây đặtvà đặtởnhiệtvào độrackphịlạnhg tối đa 30 phút Sau ly tâm Lưu ý: Thao tác Chứng dương tách biệt với ống MasterMix PrimobeMix để hạn chế nguy nhiễm Bước Vortex mạnh ống PrimobeMix hút 200 µl chuyển vào ống MasterMix Lưu ý: Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix trình vortex, dẫn đến việc khơng đủ thể tích hút Bước Trộn hỗn hợp có ống MAsterMix micropipette Hút 18 µl hỗn hợp cho vào Eppendorf 0.2 ml Bước Vortex nhẹ dung dịch DNA xét nghiệp, dung dịch chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương Lưu ý: -Không trộn ống MasterMix máy vortex -Sử dụng eppendororf 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR -Mỗi hỗn hợp chuẩn bị đủ cho 19 phản ứng Bước Cho 10 µl dung dịch RNA xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương vào ống Eppendorf 0.2 ml riêng lẻ chuẩn bị bước Lưu ý: -Phản ứng Real-time PCR phải đặt vào máy chạy vòng sau bổ sung dịch RNA - Mỗi lần chạy máy Real-time PCR cần tối thiểu phản ứng cho Chứng âm tách chiết, phản ứng cho ống Chứng dương phản ứng với nước cất lần (hoặc dung dịch KTS5) làm Chứng âm PCR - Thứ tự chuẩn bị phản ứng phải là: Chứng âm PCR → Chứng âm tách chiết → Mẫu xét nghiệm → Chứng dương Bước 5.Đậy nắp Eppendorf 0.2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ đặt vào máy Real – time PCR Bước Cài đặt chương trình định dạng vị trí mẫu block nhiệt máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho RNA HCV) HEX (đặc trưng cho RNA chứng nội ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho giếng chứng dương Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương máy sử dụng mẫu chứng dương E3, E5 E7 5x103, 5x105 5x107 copies BUỔI 11 – NGÀY 8/11/2022 THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HCV I Mục đíícchh: Biết thứ tự xếp RNA virus gây nên HCV II Chhuuẩẩn bịị: -Laptop có phần mềm Bioioededit -File chứa đoạn RNA mạch đơn (mẫu làm PCR) IIII Quuy trììnnh thực hiiệện Bưướớc Bước PCCR Làm sạcạch sản phẩm PCR Bước Phản ứng giải trình tự (sequencing PCR) với loại ddNTPs Bước Làm sản phẩhẩm giải trình tự Bước Điện di mao quản Bước Phân tích trình tự giải phần mềm chuyên dụng theo phương pháp stranger IV Nhhậận xéét kết quuảả: -Dựa vào kết PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm giải mã gen HCV hình Bài tập Bài tập Bài tập Bài tập Bài tập ... theo - kit AccuPid H.pylori Detection Kit Thu phân tử Nucleic trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân - hủy tác nhân hóa học học - Loại bỏ thành phần tạp nhiễm để thu sản phẩm tinh - Ưu điểm:... ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho giếng chứng dương Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương máy sử dụng mẫu chứng dương E3, E5 E7 5x103, 5x105 5x107 copies BUỔI 11 – NGÀY 8/11/2022 THỰC HÀNH... REAL TIME PCR DNA H.PYLORI I Mục đíícchh: Là kỹ thuật dùng để khuyếch đại DNA thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên lượng tùy ý - Theo dõi khuếch đại phân tử DNA nhắm mục tiêu trình PCR (nghĩa