Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.Báo cáo thực tập sinh học phân tử k20. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH Môn học : Thực hành Sinh học Phân tử Giáo viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết Sinh viên thực : Ca thứ Họ tên MSSV Nguyễn Xuân Hồng 20126251 Võ Sông Hương 20126254 Nguyễn Thị Trúc Mai 20126302 Lý Thị Hằng 20126239 Tháng 07 năm 2022 MỤC LỤC CHƯƠNG MỞ ĐẦU Giới thiệu Vào ngày 25 tháng năm 1953, James Watson Francis Crick mô tả đặc tính DNA với báo tạp chí Nature Khám phá họ đánh dấu bước phát triển đỉnh cao thập kỷ nghiên cứu căng thẳng sau chứng minh Oswald T Avery, Colin MacLeod Maclyn McCarty DNA phân tử di truyền, protein người ta nghĩ trước DNA mang thông tin di truyền, bảo quản, bảo tồn thông tin di truyền biến đổi tạo tảng cho tiến hóa DNA phiên mã thành mRNA sau dịch mã thành chuỗi axit amin định cấu trúc ba chiều protein, từ định chức sinh học thân DNA Do đó, DNA cung cấp dẫn để trì chức sinh học coi thiết kế sống Với chức quan trọng đó, nhà khoa học phát minh phương pháp ly trích DNA nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho tiến kiến thức gen người đóng vai trị quan trọng đời nhiều lĩnh vực khác khoa học chỉnh sửa gen y học cá nhân hóa Ly trích acid nucleic điểm khởi đầu nghiên cứu sinh học phân tử coi q trình quan trọng Việc tách chiết DNA thô thực bác sĩ người Thụy Sĩ Friedrich Miescher vào năm 1869 Ơng vơ tình tinh chế DNA từ nhân điều tra protein từ bạch cầu nhận thấy tính chất chất khác với protein, từ ơng đặt thuật ngữ “ nuclein ” DNA chiết xuất từ nguồn đa dạng mẫu lâm sàng kim nhỏ hút dịch thể mẫu sinh thiết; mẫu pháp y vết máu khô, gạc dấu vân tay; đến đất, mô thực vật động vật, côn trùng, động vật nguyên sinh, vi khuẩn nấm men DNA phân lập từ mẫu sinh học khác sử dụng để xác định trình tự DNA, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), PCR định lượng (qPCR), thấm phương nam, khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (RAPD), chuẩn bị cho thư viện gen đa hình độ dài đoạn khuếch đại (AFLP), đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP), đa hình lặp lại song song ngắn (STRP), đa hình nucleotide đơn (SNP) số lượng biến ứng dụng lặp lại song song (VNTR) Trong lĩnh vực y học, ứng dụng dùng làm sở để chẩn đoán bệnh di truyền xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dự đoán hiệu thuốc phản ứng có hại thuốc cách sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo sản phẩm dược phẩm hormone vaccine xét nghiệm di truyền dự đoán để đánh giá nguy sử dụng chiến lược sàng lọc phịng ngừa sớm Ví dụ, phát sớm đột biến gen sinh ung thư RET can thiệp trước triệu chứng sử dụng để ngăn ngừa phát triển đa dạng tân sinh nội tiết loại Trong vi sinh vật học, phân tích axit nucleic sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giúp xác định đột biến làm phát sinh kháng kháng sinh Mục tiêu Cung cấp kỹ sử dụng vận hành số thiết bị thông dụng dùng ly trích DNA, chuẩn bị dung dịch hố chất Ly trích, tách chiết DNA tổng số DNA plasmid, định lượng DNA phương pháp đo mật độ quang (OD) điện di gel agarose nhằm phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI KIỆU Giới thiệu trang thiết bị phòng thí nghiệm Máy lắc ổn nhiệt (incubator shaker) 1.1 Được sử dụng cho phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh kèm với phận lắc nhằm vi khuẩn tương tác với Oxy Tủ hút khí độc (fume hood) 1.2 Dùng chuẩn bị hay thực thí nghiệm sử dụng hóa chất bay độc, có mùi khó chịu phenol, chloroform, β-mercaptoethanol… 1.3 Tủ cấy vô trùng (laminar flow hood) Sử dụng cần thao tác điều kiện vơ trùng tách chiết, pha hóa chất…Tủ phải ln giữ sạch, bề mặt thí nghiệm khử trùng cồn Trước sau sử dụng phải trùng bên tủ cách bật đèn UV 15 phút 1.4 Máy vortex Tạo rung để giúp làm đồng hóa mẫu dung dịch cách nhanh chóng 1.5 Tủ lạnh Tủ mát (4°C) tủ lạnh sâu (-20°C), Tủ âm sâu (-80°C) dùng để giữ sinh phẩm, hóa chất mẫu thí nghiệm cần giữ nhiệt độ thấp Đối với mẫu, hóa chất bảo quản tủ lạnh sâu cần xử lí cách chọn vật chứa phù hợp trước bảo quản Nồi hấp tự động (autoclave) 1.6 Dùng để hấp khử trùng dụng cụ hóa chất thí nghiệm Lưu ý sử dụng: - Khi hấp phải bỏ nước - Khi hấp phải liên tục canh nhiệt độ áp suất để tránh cố áp suất mức gây cháy nổ - Nồi hấp nóng nguy hiểm, nên có phịng riêng để đặt nồi hấp 1.7 Máy ly tâm Dùng để phân tách thu nhận phần tử dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng tỷ trọng, độ nhớt dung dịch tốc độ rotor Chú ý: - Khi ly tâm phải để tube đối xứng cần momen rotor số tube số chẵn, số tube lẻ phải thêm tube loại thêm vào thể tích nước với thể tích tube thực ly tâm 1.8 Cần lưu ý ba thông số: thời gian ly tâm, tốc độ ly tâm nhiệt độ ly tâm Bồn ủ nhiệt (waterbath) Bồn ủ nhiệt hay gọi bể điều hòa nhiệt, bể ổn định nhiệt độ Chúng coi loại thiết bị chun dụng dùng phịng thí nghiệm 1.9 Máy khuấy từ (magnetic stirrer) Máy khuấy từ loại thiết bị phịng thí nghiệm, sử dụng lực từ trường để khuấy dung dịch 1.10 Cân kỹ thuật (bechtop/balance) Là loại cân quan trọng cần thiết, có cơng dụng giúp người thực nhanh chóng đo đạc trọng lượng vật có kích thước nhỏ Nguyên tắc cân: Kiểm tra giọt nước trước cân Nếu lỡ cân bị dư phải bỏ phần cân lại từ đâu Phải để ý giá trị max cân, cân vật mức max làm hư cân 1.11 Máy luân nhiệt (Thermocycler) Là thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ hỗn hợp dung dịch phản ứng PCR cách tự động theo chương trình cài đặt trước người sử dụng Hiệu chỉnh thiết bị kỹ thuật (Calibration): Là q trình xác định độ xác thiết bị thường bao gồm so sánh kết nhận từ thiết bị đạt chuẩn điều chỉnh thiê bị nhằm tăng độ xác chuẩn mực kết 1.12 Dụng cụ dùng thí nghiệm Các dụng cụ thủy tinh thông thường becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen Tube: nhựa polyethylen hay polypropylen chịu nhiệt độ khử trùng (1 atm, 121°C, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20°C) số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2 ml; 0,5ml; 2ml Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ xác cao Lưu ý sử dụng: − Khơng để pipet tiếp xúc với dung mơi hữu cơ, hóa chất − Không để gần nguồn điện (đèn cồn, ) − Tuyết đối khơng điều chỉnh ngưỡng thể tích tối thiểu ngưỡng thể tích tối đa − Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette thể tích tối đa Các đầu tip (cone): Các micropipette sử dụng đầu tip Các đầu tip thường sử dụng lần có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác Các đầu tip hấp khử trùng điều kiện thông thường DNA tổng số thực vật Ageratum conyzoides DNA có cấu trúc dạng sợi đôi với xương sống sugar-phosphate, đường deoxyribose base nitrit liên kết với protein histon DNA tổng số phân tử có kích thước lớn, q trình thao tác cần tránh tác nhân học hay hố học q mạnh làm đứt gãy phân tử Quá trình tách chiết DNA gồm bước sau: − Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA − Loại bỏ thành phần không mong muốn − Thu hồi DNA DNA plasmid vi khuẩn E.coli Plasmid phân tử DNA mạch kép dạng vịng nằm ngồi thể nhiễm sắc, có kích thước nhỏ, có khả tự nhân lên độc lập với tế bào phân sang tế bào nhân lên với tế bào Hình thái DNA plasmid – phân tử DNA có kích thước nhỏ, trạng thái siêu xoắn, DNA nhiễm sắc thể có khác biệt Sự khác biệt giúp phân biệt kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid phân tử RNA Từ người ta nghiên cứu phương pháp ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào vi khuẩn ly trích kiềm tính phát triển Birnboim Doly (1979) CHƯƠNG LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT Vật liệu nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu DNA tổng số thực vật Ageratum conyzoides 1.2 Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: Tube 1,5 mL; bình tam giác; Micropipette Thiết bị: Máy ly tâm, máy votex, bồn ủ, thiết bị điện di 1.3 Hóa chất 1.3.1 Dung dịch đồng mẫu (Homogenization Buffer) gồm: - Tris 200 mM (pH 8,0): chất đệm pH giúp ổn định pH = - EDTA 25 mM: có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase, bảo vệ DNA - NaCl 250 mM: Cân ion muối ngồi mơi trường - SDS 0,5%: chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ màng tế bào, q trình ly trích diễn dễ dàng 1.3.2 Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, v:v:v) 25:24:1 - Phenol: làm biến tính protein - Chloroform: khơng tan nước, bổ sung vào dịch nuôi tế bào làm cho dịch phân thành lớp Hỗn hợp ly tâm để phân tách lớp, protein bị kết tủa nằm pha Hoạt động yếu Phenol - Isoamyl alcohol: ancohol với có mặt cation hóa trị I ( NA+, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA 1.3.3 Ethanol 99° isopropanol: có tác dụng loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA 10% phenol cịn sót lại hỗn hợp DNA 2 Phương pháp thực Phương pháp ly trích DNA dịch trích SDS Phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, hóa chất loại bỏ thành phần không mong muốn, từ thu nhận DNA Quy trình ly trích DNA tổng số SDS Bước 1: Phá vỡ tế bào + Thêm 600 μL dung dịch đồng mẫu vào 0,05g mẫu + Nghiền nát mẫu + Ly tâm 10.000 rpm – phút DNA tan nên lơ lửng dung dịch + Lấy tube, hút 400 μL qua tube Bước 2: Làm DNA + Bổ sung vào tube 400 μL PCI lắc nhẹ phút, ly tâm với vận tốc 12.000 rpm – phút + Hút dịch cho vào ống tube mới, bổ sung 300 μL CI vào, lắc nhẹ, ly tâm 12.000 rpm – phút, hút dịch chuyển qua tube Bước 3: Kết tủa thu hồi DNA + Thêm 120 μL isopropanol, ủ (-20°C) – 15 phút Ly tâm 12.000 rpm – 10 phút + Thêm 500 μL ethanol 70°, ly tâm 12.000 rpm – phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Lặp lại lần + Phơi tube nhiệt độ phòng Bước 4: Bảo quản DNA vừa tách chiết Thêm vào kết tủa DNA 50 μL nước khử ion hấp khử trùng (không chứa DNase) 50 μL TE 0,5X, vortex nhẹ bảo quản 4°C -20°C Kết thảo luận Đem mẫu vừa ly trích điện di thu kết giếng hình 4.1 Hình 4.1 Điện di ly trích DNA tổng số thực vật dịch trích SDS Ở giếng hình, ly trích DNA tổng số thành cơng, chấp nhận được, mẫu có DNA, băng vạch gọn nhỏ, có DNA bị đứt gãy, lượng DNA thu nhiều nên vạch sáng rõ, DNA tương đối tinh CHƯƠNG LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHUẨN Vật liệu nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu DNA plasmid vi khuẩn E.coli 1.2 Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: Tube 1,5 mL, bình tam giác Thiết bị: Máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ thiết bị điện di 1.3 Hoá chất 1.3.1 Dung dịch I - Glucose (lọc khử trùng) 50 mM: Cân áp suất thẩm thấu - Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM: Giúp pH không bị thay đổi đột ngột gây hư mẫu - EDTA (pH 8.0) 10 mM: Hấp thị ion để bảo vệ DNA plasmid 1.3.2 Dung dịch II - NaOH 0,2 N: Tạo mơi trường kiềm - SDS 1%: làm biến tính protein, sau SDS liên kết với protein chìm xuống đáy tube Đồng thời SDS phá vỡ tế bào 1.3.3 Dung dịch III - Potassium acetate (Kali acetate) 5M: cho vào SDS thay K chuyển thành PDS Tác dụng trung hồ dung dịch kiềm, plasmid hồi tính, PDS protein chìm xuống đáy - Glacial acetic acid: tồn dạng tinh thể băng 1.3.4 Isopropanol: có tác dụng loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA 10% phenol cịn sót lại hỗn hợp DNA Phương pháp thực Phương pháp ly trích kiềm tính phát triển Birnboim Doly (1979) Ở điều kiện kiềm, tế bào phân giải, nucleic acid protein bị biến tính Khi dung dịch trung hịa Kali Acetate (CH3COOK), DNA nhiễm sắc thể protein kết tủa phân tử khơng thể phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định tồn dung dịch, tách hẳn khỏi DNA nhiễm sắc thể protein Vi khuẩn E.coli mang plasmid nuôi cấy môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1% ) 37 C, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 nuôi cấy (ni qua đêm) sử dụng để ly trích plasmid Quy trình ly trích DNA plasmid vi khuẩn Bước 1: Lấy mL dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL Ly tâm dịch khuẩn tốc độ 5.000 rpm – phút Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa Lặp lại lần để tặng lượng vi sinh Bước 2: Thêm 100 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ Bước 3: Thêm 200 μL dung dịch II Đảo tube để trộn hỗn hợp Không vortex bước Giữ tube đá Bước 4: Thêm 150 μL dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn hỗn hợp Giữ tube đá khoảng phút Bước 5: Ly tâm 12.000 rpm – 10 phút Chuyển dịch sang tube (1V) Bước 6: Thêm 0,6V isopropanol, vortex nhẹ; để yên 20 phút -20°C Bước 7: Ly tâm 12.000 rpm – 10 phút để thu kết tủa DNA Loại dịch phía Thêm 500 μL ethanol 70%, ly tâm 12.000 rpm – phút Loại bỏ dịch phơi ống khơng cịn dung dịch bên ống Bước 8: Thêm 50 μL nước khử ion (không chứa Dnase) TE Vortex nhẹ bảo quản -20°C Kết thảo luận Đem mẫu vừa ly trích điện di thu kết giếng hình 4.2 Hình 4.2 Điện di ly trích DNA plasmid vi khuẩn E.coli Ở giếng này, , ly trích DNA plasmid khơng thành cơng, mẫu có DNA, DNA bị đứt gãy nhiều nhiễm RNA, có tạp chất dính miệng giếng, DNA có kích thước khoảng 6000-8000 bp Kiến nghị Đối với DNA plasmid bị tạp nhiễm trên, nguyên nhân q trình thực thao tác thí nghiệm khơng đúng, tay nghề cịn Nên muốn DNA tinh cần lưu ý: trình thực thao tác cần ý cẩn thận tránh làm vỡ mẫu, không để mẫu bị nhiễm bẩn, ý hóa chất sử dụng, nâng cao trình độ tay nghề CHƯƠNG ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG Vật liệu − Máy đo OD bước sóng 260 nm 280 nm − Micropippette, đầu tip loại − Cuvet Nguyên tắc Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng phân tử vật chất mơi trường lỏng người ta tính nơng độ chúng Mỗi phân tử có đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) độ dài sóng định tuỳ thuộc vào cấu trúc chúng Sự hấp thụ tương tác proton với electron vòng purin pyrimidin Đỉnh hấp thụ acid nucleid 260 nm vùng tử ngoại Sự hấp thụ tính giá trị OD (Otical Density) Từ giá trị OD đo được, ta suy nồng độ acid nucleid dung dịch Dung dịch acid nucleid xem tỉ lệ OD260/OD280 nằm khoảng 1,8 – 2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ thấp hơn; diện guanidine làm tăng giá trị OD260 Phương pháp Đo OD260, OD280 dung dịch DNA tổng số thực vật Đo OD260, OD280 dung dịch DNA plasmid vi khuẩn Tính tỉ lệ OD260/OD280 Đun cách thuỷ 20 phút dung dịch DNA mẫu, làm lạnh đột ngột nước đá 10 phút Đo OD260 dung dịch biến tính Quy trình thực Kết thảo luận Đo OD260, OD280 DNA tổng số thực vật DNA plasmid vi khuẩn Bảng 5.1 Kết đo OD DNA tổng số thực vật, DNA plasmid vi khuẩn Kết luận CHƯƠNG KỸ THUẬT ĐIỆN DI PHỤ LỤC HÌNH ẢNH TÀI LIỆU THAM KHẢO Dahm, R (2005) Friedrich Miescher and the discovery of DNA Developmental Biology, 278(2), 274-288 https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2004.11.028 Dhaliwal, A (2013) DNA Extractinon and Purification, Materials and Methods p3 https://dx.doi.org/10.13070/mm.en.3.191 Watson, J D., & Crick, F H (1953) Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid Nature, 171(4356), 737-738 Preetha, S J (2020) The Evolution of DNA Extraction Methods 8(1) Biomedical Science & Research AJBSR.MS.ID.001234 https://dx.doi.org/10.34297/AJBSR.2020.08.001234 Telser, A (2002) Molecular Biology of the Cell, 4th Edition Shock, 18 https://doi.org/10.1097/00024382-200209000-00015 Evans, J., Skrzynia, C., & Burke, W (2001) The complexities of predictive genetic testing BMJ (Clinical research ed.), 322, 1052-1056