Tài liệu thực hành thực hành sinh học phân tử 2019

ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Năm 2019 TÀI LIỆU THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ Người biên soạn ThS Tôn Bảo Linh KS Nguyễn Phan Thành GIỚI THIỆU MÔN HỌC VÀ YÊU CẦU CỦA MÔN HỌC Giới thiệu Phần thực hành môn Sinh học phân tử giúp sinh viên vận dụng kiến thức lí thuyết mơn học vào q trình thực thí nghiệm sử dụng kỹ thuật phân tử Môn học cung cấp cho sinh viên kiến thức kỹ phịng thí nghiệm sinh học phân tử, gồm kỹ sử dụng vận hành số thiết bị thông dụng, chuẩn bị dung dịch hóa chất, tách chiết nucleic acid, định lượng nucleic acid, điện di gel agarose kỹ thuật PCR Bên cạnh đó, mơn học trang bị cho sinh viên kỹ viết báo cáo trình bày kết thực hành, kiến thức kỹ đảm bảo an tồn phịng thí thiệm Sau kết thúc môn học, sinh viên cần phải đạt yêu cầu kiến thức kỹ sau: - Có khả đọc, hiểu vận dụng tài liệu kỹ thuật liên quan; có khả vận hành an toàn thiết bị phịng thí nghiệm sinh học - Biết cách tính nồng độ pha dung dịch hóa chất liên quan đến kỹ thuật phân tử - Có thể giải thích, mơ tả bước thực quy trình tách chiết DNA tổng số DNA plasmid, định lượng tinh nucleic acid - Có thể giải thích ngun tắc, mơ tả bước chính, cách chuẩn bị vật liệu thực kỹ thuật điện di DNA - Lập kế hoạch thực thí nghiệm sử dụng phương pháp PCR - Có khả viết báo cáo kết thí nghiệm u cầu mơn học - Sinh viên có mặt đầy đủ buổi thực hành - Thực đầy đủ tập cá nhân tập nhóm Hình thức đánh giá - Hiện diện: 10% - Thái độ học tập làm việc nhóm: 10% - Báo cáo thực hành: 60% - Thi thực hành: 20% Bài GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ, THAO TÁC CƠ BẢN PHỊNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ PHẦN I GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ Máy lắc ổn nhiệt (incubator shaker) Được sử dụng cho phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh kèm với phận lắc Tủ hút khí độc (fume hood) Dùng chuẩn bị hay thực thí nghiệm sử dụng hóa chất bay độc, có mùi khó chịu phenol, chloroform, β-mercaptoethanol… Tủ cấy vô trùng (laminar flow hood): Sử dụng cần thao tác điều kiện vơ trùng tách chiết, pha hóa chất… Tủ phải ln giữ sạch, bề mặt thí nghiệm khử trùng cồn Trước sau sử dụng phải trùng bên tủ cách bật đèn UV 15 phút Máy vortex: giúp làm đồng hóa mẫu dung dịch cách nhanh chóng Tủ lạnh (fridge, refrigerator) Tủ mát (4oC) tủ lạnh sâu (-20oC, -80oC ) dùng để giữ sinh phẩm, hóa chất mẫu thí nghiệm cần giữ nhiệt độ thấp Đối với mẫu, hoá chất bảo quản tủ lạnh sâu cần xử lí cách chọn vật chứa phù hợp trước bảo quản Nồi hấp tự động (autoclave) Dùng để hấp khử trùng dụng cụ hoá chất thí nghiệm http://www.amerexinst.com/autoclaves.html Máy ly tâm (centrifuge) Dùng để phân tách thu nhận phần tử dung dịch dựa vào kích thước, hình dạng tỉ trọng, độ nhớt dung dịch tốc độ rotor (Xem phụ lục) (www.thermofisher.com/) Chú ý: ly tâm phải để tube đối xứng roto số tube số chẳn, số tube lẻ phải thêm tube loại thêm vào thể tích nước với thể tích tube thực ly tâm Bồn ủ nhiệt (waterbath) Bồn ủ nhiệt Memmert phụ kiện Máy khuấy từ (magnetic stirrer) 10 Cân kỹ thuật (bechtop scale/balance) 11 Máy luân nhiệt (Thermocycler): thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ hỗn hợp dung dịch phản ứng PCR cách tự động theo chương trình cài đặt trước người sử dụng Máy luân nhiệt Eppendorf 10 Hiệu chỉnh thiết bị kỹ thuật (Calibration) Hiệu chỉnh thiết bị trình xác định độ xác thiết bị thường bao gồm so sánh kết nhận từ thiết bị sử dụng với kết từ thiết bị đạt chuẩn điều chỉnh thiết bị nhằm tăng độ xác chuẩn mực kết Bảng Các thiết bị thường sử dụng phịng thí nghiệm sinh học phân tử cần hiệu chỉnh 12 Dụng cụ dùng thí nghiệm - Các dụng cụ thủy tinh thông dụng becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen Tube: nhựa polyethylen hay polypropylen chịu nhiệt độ khử trùng (1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) số dung mơi hữu cơ, thường có dung tích 0,2 mL; 0,5 mL; 1,5 mL; 2mL Các loại tube thông dụng 11 - Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ xác cao Điều chỉnh thể tích Piston Cán để tay Giá trị ngưỡng Cần gạt đầu tip Cửa sổ hiển thị giá trị thể tích Ống hút Đầu gắn tip Lưu ý sử dụng:  Không để pipette tiếp xúc trực tiếp với dung môi hữu cơ, hố chất  Khơng để gần nguồn nhiệt (đèn cồn, …)  Tuyệt đối không điều chỉnh ngưỡng thể tích tối thiểu ngưỡng thể tích tối đa  Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette thể tích tối đa 12 - Các đầu tip (cone): Các micropipette sử dụng đầu tip Các đầu tip thường sử dụng lần có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác Các đầu tip hấp khử trùng điều kiện thông thường Các loại tip thông dụng Phần II CHUẨN BỊ HÓA CHẤT II.1 Một số ngun tắc pha hóa chất  Kiểm tra dung mơi hịa tan hóa chất Hóa chất thường pha với nước cất hai lần khử trùng điều kiện thơng thường  Đối với số hóa chất khơng thể hấp khử trùng, sử dụng đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,2 µm 0,45 µm để trùng  Khi đong, cân hóa chất tuyệt đối khơng đổ hố chất thừa trở lại bình chứa ban đầu II.2 Tính tốn hóa chất a Nồng độ Mol: nồng độ phân tử gram theo thể tích hay số mol chất tan lít dung dịch Được dùng để biểu thị nồng độ mol dung dịch Ví dụ: để pha chế 100 mL dung dịch 5M NaCl (58,456 g/mol) cần mol/lít x 58,456 g/mol x 0,1 lít = 29,29 g NaCl 100 ml dung dịch b Phần trăm - Phần trăm (w/v): số gram 100 ml dung dịch - Phần trăm (v/v): thể tích (ml) 100 ml dung dịch VD: để chuẩn bị dung dịch 0,7% agarose TBE buffer, cân 0,7 gram agarose thêm dung dịch TBE đến 100 mL c Dung dịch đậm đặc: vài dung dịch đệm enzyme chuẩn bị dạng dung dịch đậm đặc 5X 10X (đậm đặc gấp đến 10 lần dung dịch sử dụng), sau pha loãng đến nồng độ cuối (thường 1X 0,5X) 13 II.3 Chuẩn bị dung dịch làm việc (working solutions) từ dung dịch gốc (concentrated stock solutions) Một vài dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm với thành phần có dung dịch với nồng độ khác nhau, cần phải chuẩn bị dung dịch đậm đặc (stock solutions) ban đầu để pha loãng cần Để chuẩn bị 100 mL buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM) bao gồm mL Tris 1M 0,2 mL EDTA 0,5M 98,8 mL nước cất Cơng thức tính tốn sau: C1 x V1 = C2 x V2 C1 : nồng độ ban đầu ( nồng độ dung dịch gốc) V1 : thể tích cần lấy từ dung dịch nồng độ C1 C2 : nồng độ cần chuẩn bị V2 : thể tích dung dịch nồng độ C2 cần chuẩn bị 3.3.4 Một số phương pháp bảo quản hóa chất  Các dung dịch thường pha bảo quản dạng đậm đặc (dung dịch mẹ) Dung dịch stock pha loãng với nước cất hai lần khử trùng để đạt nồng độ cần cho lần sử dụng  Dung dịch sử dụng bảo quản nhiệt độ phịng thí nghiệm, nhiệt độ oC nhiệt độ lạnh sâu -20 oC theo khuyến cáo cho loại hóa chất Dung dịch bảo quản -20 oC thường phân thành phần nhỏ, lần sử dụng cần giải đông phần Thực hành - Sinh viên quan sát thiết bị, dụng cụ, cách vận hành, thực tập với micropipette - Chú ý đến đơn vị đo lường: thể tích, nồng độ cách pha số dung dịch gốc EDTA 0,5M; NaCl 3M; TE 5X; TBE 10X, dung dịch li trích DNA, tính lượng hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR Kết đạt - Sinh viên biết vận hành thiết bị sử dụng micropipette thục - Sinh viên biết cách tính tốn pha hóa chất, dung dịch thơng dụng 14 Bài LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ THỰC VẬT Mục đích: Giúp sinh viên hiểu phương pháp tách chiết DNA thực vật Yêu cầu: Sinh viên nắm vững thực bước tách chiết DNA theo phương pháp dùng dịch trích SDS Nội dung 3.1 Giới thiệu DNA phân tử có kích thước lớn, q trình thao tác cần tránh tác nhân học hay hóa học mạnh làm đứt gãy phân tử Quá trình tách chiết DNA gồm bước sau:  Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA  Loại bỏ thành phần khơng mong muốn  Thu hồi DNA 3.3 Hóa chất - Dung dịch đồng mẫu (Homogenization Buffer) gồm Tris 200 mM (pH 8,0), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5% - Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, v:v:v) 25:24:1 - Chloroform - Ethanol 99o 3.2 Qui trình li trích DNA tổng số SDS - Bước 1: Nghiền mẫu tube 1,5 mL có chứa 400 µL dịch đồng mẫu - Bước 2: Bổ sung vào tube 500 µL PCI lắc nhẹ phút, li tâm với vận tốc 10.000 rpm phút, sau hút dịch cho vào ống tube - Bước 3: Bổ sung 400 µL chloroform vào, lắc nhẹ phút, li tâm 10.000 rpm/5 phút, hút dịch chuyển qua tube - Bước 4: Thêm 600 µL ethanol 99o, lắc nhẹ phút Ủ -20 oC 30 phút Sau li tâm 12.000 rpm/5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Phơi tube nhiệt độ phòng - Bước 5: Thêm vào kết tủa DNA 30 µL nước khử ion hấp khử trùng (khơng chứa DNase) 30 µL TE 0,5X, vortex nhẹ bảo quản oC -20 oC 3.4 Ly trích DNA plasmid vi khuẩn Giới thiệu Qui trình ly trích plasmid dùng để ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào vi khuẩn dựa qui trích ly trích kiềm tính phát triển Birnboim Doly (1979) Qui trình ly trích dựa khác biệt hình thái DNA plasmid – phân tử DNA có kích thước nhỏ, trạng thái siêu xoắn, DNA nhiễm sắc thể Sự khác biệt giúp phân biệt kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid phân tử RNA Ở điều kiện kiềm, tế bào phân giải, nucleic acid protein bị biến tính Khi dung dịch trung hòa Kali Acetate (CH3COOK), DNA nhiễm sắc thể 15 protein kết tủa phân tử khơng thể phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định tồn dung dịch, tách hẳn khỏi DNA nhiễm sắc thể protein Vật liệu – Thiết bị - Hóa Chất Vật liệu, thiết bị ống 1,5 mL bình tam giác Máy ly tâm Máy vortex Bồn ủ Hóa chất Dung dịch I (lạnh) Dung dịch II Dung dịch III (lạnh) Isopropanol Nước (khử ion, tiệt trùng)  Dung dịch I (bảo quản oC) 50mM glucose (lọc khử trùng) 25mM Tris-HCl (pH 8,0) 10mM EDTA (pH 8,0)  Dung dịch II 0,2 N NaOH 1% SDS  Dung dịch III (bảo quản oC) 5M potassium acetate (Kali acetate) Glacial acetic acid Qui trình ly trích DNA plasmid (Birnboim Doly, 1979) Vi khuẩn E.coli mang plasmid nuôi cấy môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1%) 37 oC, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 nuôi cấy (nuôi qua đêm) sử dụng để ly trích plasmid theo qui trình gồm bước sau: Lấy mL dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL Ly tâm dịch khuẩn tốc độ 5.000 rpm phút Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa Lặp lại bước 1, 2, Thêm 100 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ Thêm 200 μL dung dịch II Đảo tube để trộn hỗn hợp Không vortex bước Giữ tube đá Thêm 150 μL dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn hỗn hợp Giữ tube đá khoảng phút Ly tâm 10.000 rpm 10 phút Chuyển dịch sang tube (1V) Thêm 2V isopropanol, vortex nhẹ; để yên 20 phút -20 oC 16 10 Ly tâm 10.000 rpm/ phút để thu kết tủa DNA Loại dịch phía Thêm 500 μL ethanol 70%, ly tâm 10.000 rpm/5 phút Loại bỏ dịch phơi ống khơng cịn dung dịch bên ống 11 Thêm 30 μL nước khử ion (không chứa Dnase) TE Vortex nhẹ bảo quản 20oC 17 BÀI ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG Mục đích: Giúp sinh viên hiểu cách định lượng nucleic acid phương pháp đo mật độ quang (optical density, OD) Yêu cầu: Sinh viên xác định giá trị OD tính nồng độ mẫu DNA Nội dung 3.1 Nguyên tắc Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng phân tử vật chất môi trường lỏng người ta tính nồng độ chúng Mỗi phân tử có đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) độ dài sóng định tùy thuộc vào cấu trúc chúng Sự hấp thụ tương tác proton với electron vòng purin pyrimidin Đỉnh hấp thụ nucleic acid 260 nm vùng tử ngoại Sự hấp thụ tính giá trị OD (Optical Density) Một đơn vị OD bước sóng 260 nm tương ứng với: - 50 µg/mL DNA sợi đơi 40 µg/mL DNA sợi đơn hay RNA 20 µg/mL oligonucleotide sợi đơn Cơng thức tính hàm lượng DNA: Hàm lượng DNA sợi đơi (µg/mL) = OD 260 * Độ pha lỗng * 50 µg/mL Tổng lượng DNA (µg) = Hàm lượng DNA* thể tích dung dịch DNA Từ giá trị OD đo được, ta suy nồng độ acid nucleic dung dịch Dung dịch acid nucleic xem tỉ lệ OD260/OD280 nằm khoảng 1,8-2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ thấp hơn; diện guanidine làm tăng giá trị OD260 Đối với hai trường hợp tạp nhiễm nêu trên, giá trị OD320 nm sử dụng cơng thức tính hàm lượng nucleic acid (xem Phụ lục 6) 3.2.Phương pháp - Đo OD260 dung dịch DNA mẫu - Đo OD280 dung dịch DNA mẫu - Tính tỉ lệ OD260/OD280 - Đun cách thủy 20 phút dung dịch DNA mẫu, làm lạnh đột ngột nước đá 10 phút Đo OD260 dung dịch biến tính Quan sát giải thích kết kết luận Kết đạt Hàm lượng tổng lượng DNA dịch chiết ban đầu sau biến tính 18 BÀI KỸ THUẬT ĐIỆN DI Mục đích Giúp sinh viên hiểu phương pháp thu nhận mẫu acid nucleic phân tích, định tính định lượng DNA Yêu cầu - Chuẩn bị gel agarose 0,8%, nạp mẫu, thực điện di quan sát gel tia UV - Nhận xét kết Điện di acid nucleic Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di sử dụng phân tích hay phối hợp với kỹ thuật khác, định tính định lượng Những đoạn DNA lớn nhiễm sắc thể phân tách kỹ thuật điện di cải biến pulsed field gel electrophoresis (PFGE), sử dụng thay đổi chiều di chuyển DNA Kỹ thuật điện di đơn giản sử dụng rộng rãi kỹ thuật điện di theo phương ngang Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử Ethidium bromide (EtBr) chất nhuộm DNA phổ biến Phân tử EtBr chèn vào cặp base đối diện phân tử DNA tạo huỳnh quang cam/đỏ chiếu tia UV (~ 300 nm) Các chất nhuộm thay khác với độ nhạy tương đương nguy nguy hiểm hơn, SYBRGreen, GelRed hay Gelstar Gel agarose sử dụng để phân tách phân tử lớn khoảng 100 bp Agarose dạng polymer đun hịa tan, đổ khn tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác (thường minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) định hình lược gel (comb) sau đổ gel vào khn Miếng gel đặt ngập chìm dung dịch điện di DNA thêm vào giếng Dòng điện qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm phân tử DNA tích điện âm di chuyển phía cực dương Agarose gel ma trận gồm lỗ phân tử DNA có kích thước nhỏ di chuyển qua dễ dàng phân tử DNA có kích thước lớn Với yêu cầu độ phân giải cao hay việc tách chiết phân tử DNA ngắn nên sử dụng gel polyacrylamide 19 Hình 4.1 Ethidium bromide (a) ethidium bromide; (b) trình chèn vào phân tử DNA ethidum bromide Vật liệu Thiết bị điện di agarose gồm:  Bộ cung cấp nguồn điện (power source)  Bồn điện di (gel box)  Khay gel (casting tray), lược gel (combs) Hóa chất  Dung dịch đệm điện di (TAE TBE)  Agarose  GelRed (Loading dye + sample dye) Cách chuẩn bị dung dịch đệm 1x Tris-Acetate-EDTA (TAE) (được pha lỗng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn) gồm Tris 40 mM (pH 7,6), acetic acid 20 mM, EDTA mM 50x TAE Stock (1 L) Hòa tan 600 mL nước hấp khử trùng: 242 g Tris base (MW 121,14 g/mole); 57,1 mL glacial acetic acid; 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0), thêm nước vào đến thể tích cuối 1L 1x Tris-Boric Acid-EDTA (TBE) (được pha lỗng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn) gồm Tris 89 mM (pH 7,6), boric acid 89 mM, EDTA mM 10x Stock (1 liter)— Hòa tan 600 mL nước hấp khử trùng: 108 g Tris base (121,14 g/mole); 55 g boric acid (61,8 g/mole) 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0) thêm nước vào đến thể tích cuối L 20 DNA and RNA sample Loading Dye Dung dịch đệm chạy mẫu 10X gồm glycerol 50%, bromophenol blue 0,25%, xylene cyanole 0,25% đệm TAE 1X Dung dịch đệm chạy mẫu thường chuẩn bị với thể tích từ 1–10 mL Hình 4.2 Hệ thống điện di gel agarose (a) Nguồn điện; (b) bồn điện di (Mini-Sub Cell GT, Bio-rad) Khay đổ gel Giá đổ gel với ngang di chuyển, thích hợp nhiều cỡ gel khác Giá đổ gel Bồn điện di Thành cố định Hình 4.3 Cách chuẩn bị gel đặt gel vào bồn điện di Các bước thực Chuẩn bị gel Xác định lượng agarose cần dùng để đạt nồng độ agarose thể tích mong muốn Ví dụ, để pha 100 mL agarose 1% cần phải thêm gram agarose vào 100 mL buffer điện di (0,5X hay 1X) 21 Bảng 4.1 Các nồng độ gel dùng phân tách DNA Nồng độ gel (%) 0,5 0,75 1,00 1,25 1,50 2-5 Kích thước DNA (kb) – 30 0,8 -12 0,5 - 10 0,4 - 0,2 - 0,01 – 0,5 Thêm lượng Agarose thích hợp vào bình chứa (ví dụ bình tam giác 250 mL, chai có nắp đậy 100 mL) Thêm vào lượng buffer điện di thích hợp (0,5 X hay X) lắc để phân tán agarose buffer Ghi chú: đánh dấu mực chất lỏng bình Nếu chất lỏng bị bốc hơi, thêm nước vào để đạt thể tích ban đầu Cho dung dịch gel vào lị vi sóng đun sơi hạt agarose tan hoàn toàn Ngưng microwave sau 30 giây lắc làm agarose tan nhanh Lưu ý: mang găng tay, áo blouse chuẩn bị đổ gel Bình chứa agarose nóng gây tiếp xúc trực tiếp với da Ngồi ra, agarose nóng chảy văng lên làm trình lắc Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước đổ gel vào khay có mang lược gel Lưu ý: thêm vào 0,5 μg/mL ethidium bromide vào agarose nóng chảy Chuẩn bị bồn điện di Khi gel nguội đặc lại, khay gel đặt vào bồn điện di, ngập dung dịch đệm điện di Lược gel tháo tạo nên “giếng” rỗng dành mẫu điện di vào Mẫu bơm vào giếng micropipette (xem Chuẩn bị mẫu) Có thể thực điện di với loại dung dịch đệm điện di khác TrisAcetate-EDTA (TAE) hay Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer TAE tạo di chuyển điện trường nhanh cho DNA mạch thẳng độ phân giải tốt cho DNA siêu xoắn; đệm TBE có khả đệm mạnh cho trình điện di với thời gian dài với hiệu điện cao Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào dạng lược sử dụng (độ dày chiều dài) độ dày gel Khi lượng mẫu sử dụng để chạy gel xác định, thêm loading dye vào với nồng độ cuối 1X Chất nhuộm có tác dụng giữ mẫu đáy giếng điện di giúp theo dõi di chuyển mẫu trình điện di Bơm mẫu vào giếng pipette Ghi chú: giếng gel thường khó nhận biết Để nhìn thấy giếng rõ đặt giấy hay băng keo màu đen bên bồn điện di, vị trí giếng Điện di Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường nắp bồn điện di lắp vào bồn theo hướng dựa vào vị trí đánh dấu điện cực 22 10 Nguồn điện cung cấp thay đổi tùy theo độ dày, chiều dài nồng độ gel, dạng dung dịch đệm điện di sử dụng Hiệu điện từ 20 – 110 V sử dụng cho hầu hết mục đích 11 Nhuộm gel với ethidium bromide Có phương pháp để nhuộm quan sát nucleic acid khác sử dụng ethidium bromide (EtBr):  Thêm 0,5 µg/mL trực tiếp vào gel agarose  Thêm 0,4 µg/mL trực tiếp vào mẫu chạy mẫu gel không chứa EtBr  Nhuộm gel sau điện di xong Ngâm gel dung dịch EtBr Ghi chú: EtBr chất gây ung thư cần phải thao tác cẩn thận Luôn mang găng tay, mắt kính áo blouse Bỏ dung dịch EtBr sử dụng gel cách QUI TRÌNH NHUỘM ETHIDIUM BROMIDE SAU KHI ĐIỆN DI Đặt gel vào dung dịch EtBr thích hợp (0,5 µg/mL), nhuộm 15 – 30 phút Sử dụng dung dịch nhuộm ngập toàn gel Rửa gel 10 – 30 phút cách ngâm gel nước Rửa lại gel nước để loại EtBr bám gel Đặt gel tia UV để quan sát phân tích DNA Phức hợp DNA/EtBr phát sáng tia UV bước sóng 254, 302 366 nm 12 Nhuộm gel với GelRed Thuốc nhuộm GelRed trộn trực tiếp với mẫu DNA trước điện di hay hòa tan vào gel agarose chuẩn bị gel Sau điện di, đặt gel tia UV để quan sát 23