Thực hành sinh học phân tử 20

Bài GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ, THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ Mục đích Giúp sinh viên biết cách sử dụng trang thiết bị thông dụng thao tác kỹ thuật phịng thí nghiệm sinh học phân tử Yêu cầu - Sinh viên biết cách sử dụng micropipette, cách vận hành máy li tâm, cân điện tử - Biết cách pha số dung dịch hóa chất thơng dụng dùng thí nghiệm Nội dung 3.1 Một số thiết bị thông dụng  Máy lắc ổn nhiệt: sử dụng cho phản ứng cần nhiệt độ ổn định (phản ứng enzyme, lai,…) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh kèm với phận lắc  Tủ hút khí độc: sử dụng thí nghiệm với hóa chất bay độc hay có mùi khó chịu phenol, chloroform, β-mercaptoethanol…  Nồi hấp tự động (autoclave): dùng để hấp khử trùng dụng cụ hố chất thí nghiệm  Tủ cấy vô trùng (laminar flow): sử dụng cần thao tác điều kiện vô trùng tách chiết, pha hóa chất… Tủ phải ln giữ sạch, bề mặt thí nghiệm khử trùng cồn Trước sau sử dụng phải trùng bên tủ cách bật đèn UV 15 phút  Tủ lạnh: tủ mát (4oC) tủ lạnh sâu (-20 oC, -80oC ) dùng để giữ sinh phẩm, hóa chất mẫu thí nghiệm cần giữ nhiệt độ lạnh Đối với mẫu, hoá chất bảo quản tủ lạnh sâu cần xử lí cách chọn vật chứa phù hợp trước bảo quản  Máy ly tâm: dùng để phân tách thu nhận phần tử khác dung dịch Nguyên tắc: phân tách phần tử khác dung dịch thực dựa vận tốc lắng khác chúng tác dụng lực ly tâm Tùy thuộc vào đặc điểm dùng để phân tách (khối lượng hay tỉ trọng phần tử vật chất) mà người ta chia làm loại: ly tâm phân đoạn (ly tâm vùng) ly tâm đẳng tỉ trọng * Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách phần tử vật chất khác dựa vào khối lượng chúng Vận tốc lắng phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng lực ma sát phần tử với dung dịch ly tâm Để phân tách thành công phần tử có dung dịch cần phải có lực ly tâm thời gian thích hợp * Ly tâm đẳng tỷ trọng: phân tách phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng chúng Phương pháp hiệu quả, cho phân đoạn phân tách khiết Ống ly tâm chứa cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ xuống đáy ống tạo nên gradient tỷ trọng Các phần tử lắng trình ly tâm nằm vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với Saccharose glycerol dùng phân tách bào quan, cesium chloride (CsCl) dùng để phân tách protein nucleic acid Hình 1.4 Máy ly tâm  Máy vortex: giúp làm đồng hóa mẫu dung dịch cách nhanh chóng  Máy luân nhiệt (Thermocycler): thiết bị giúp thay đổi nhiệt độ hỗn hợp dung dịch phản ứng PCR cách tự động theo chương trình cài đặt trước người sử dụng Hình 1.5 Máy luân nhiệt 3.1 Dụng cụ dùng thí nghiệm - Các dụng cụ thủy tinh thông dụng becher, ống nghiệm, pipette, đĩa petri, ống đong, erlen - Ống tube: nhựa polyethylen hay polypropylen chịu nhiệt độ khử trùng (1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) số dung mơi hữu cơ, thường có dung tích 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml 1,5m l 200ul - 2ml Hình 1.1 Các loại ống tube thơng dụng Micropipette (pipetman): dùng hút dung dịch thể tích nhỏ, độ xác cao Điều chỉnh thể tích Piston Cán để tay Giá trị ngưỡng Cần gạt đầu tip Cửa sổ hiển thị giá trị thể tích Ống hút Đầu gắn tip Lưu ý sử dụng: Hình 1.2 Micropipette  Không để pipette tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hố chất  Khơng để gần nguồn nhiệt (đèn cồn, …)  Tuyệt đối không điều chỉnh ngưỡng thể tích tối thiểu ngưỡng thể tích tối đa  Khi sử dụng xong phải điều chỉnh pipette thể tích tối đa - Các đầu tip (cone): Các micropipette sử dụng đầu tip Các đầu tip thường sử dụng lần có nhiều loại tương ứng với nhiều loại micropipette khác Các đầu tip hấp khử trùng điều kiện thơng thường Hình 1.3 Các loại tip thơng dụng Chú ý: ly tâm phải để tube đối xứng roto số tube số chẳn, số tube lẻ phải thêm tube loại thêm vào thể tích nước với thể tích tube thực ly tâm 3.3 Chuẩn bị hóa chất 3.3.1 Một số nguyên tắc pha hóa chất  Hóa chất pha với nước cất hai lần khử trùng điều kiện thông thường Đối với số hóa chất khơng thể hấp khử trùng, việc trùng tiến hành với đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,2µm 0,45µm  Khi đong, cân hóa chất tuyệt đối khơng đổ hố chất thừa trở lại bình chứa ban đầu 3.3.2 Tính tốn hóa chất a Nồng độ Mol: nồng độ phân tử gram theo thể tích hay số mol chất tan lít dung dịch Được dùng để biểu thị nồng độ mol dung dịch Ví dụ: để pha chế 100ml dung dịch 5M NaCl (58,456 g/mol) cần mol/lít x 58,456 g/mol x 0,1 lít = 29,29 g NaCl 100 ml dung dịch b Phần trăm - Phần trăm (w/v): số gram 100 ml dung dịch - Phần trăm (v/v): thể tích (ml) 100 ml dung dịch VD: để tạo dung dịch 0,7% agarose TBE buffer, cân 0,7 gram agarose thêm dung dịch TBE đến 100 ml c Dung dịch đậm đặc: vài dung dịch đệm enzyme chuẩn bị dạng dung dịch đậm đặc 5X 10X (đậm đặc gấp đến 10 lần dung dịch sử dụng), sau pha lỗng đến nồng độ cuối (thường 1X 0,5X) 3.3.3 Chuẩn bị dung dịch làm việc (working solutions) từ dung dịch mẹ (concentrated stock solutions) Một vài dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm với thành phần có dung dịch với nồng độ khác nhau, cần phải chuẩn bị dung dịch đậm đặc (stock solutions) ban đầu để pha lỗng cần Để chuẩn bị 100 ml buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM) bao gồm 1ml Tris 1M 0,2 ml EDTA 0,5M 98,8 ml nước cất Công thức tính tốn sau: C1 x V1 = C2 x V2 C1 : nồng độ ban đầu ( nồng độ dung dịch mẹ) V1 : thể tích ban đầu (thể tích dung dịch) C2 : nồng độ cuối ( nồng độ cần) V2 : thể tích cuối (thể tích cần) 3.3.4 Một số phương pháp bảo quản hóa chất  Các dung dịch thường pha bảo quản dạng đậm đặc (dung dịch mẹ) Dung dịch mẹ pha loãng với nước cất hai lần khử trùng để đạt nồng độ cần cho lần sử dụng  Dung dịch sử dụng bảo quản nhiệt độ phịng thí nghiệm, nhiệt độ oC nhiệt độ lạnh sâu -20 oC theo khuyến cáo cho loại hóa chất Dung dịch bảo quản 20 oC thường phân thành phần nhỏ, lần sử dụng cần giải đông phần Thực hành - Sinh viên quan sát thiết bị, dụng cụ, cách vận hành, thực tập với micropipette - Chú ý đến đơn vị đo lường: thể tích, nồng độ cách pha số dung dịch gốc EDTA 0,5M; NaCl 3M; TE 5X; TBE 10X, dung dịch li trích DNA, tính lượng hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR Kết đạt - Sinh viên biết vận hành thiết bị sử dụng micropipette thục - Sinh viên biết cách tính tốn pha hóa chất, dung dịch thơng dụng Bài LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ THỰC VẬT Mục đích: Giúp sinh viên hiểu phương pháp tách chiết DNA thực vật Yêu cầu: Sinh viên nắm vững thực bước tách chiết DNA theo phương pháp dùng dịch trích SDS Nội dung 3.1 Giới thiệu DNA phân tử có kích thước lớn, trình thao tác cần tránh tác nhân học hay hóa học mạnh làm đứt gãy phân tử Quá trình tách chiết DNA gồm bước sau:  Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA  Loại bỏ thành phần không mong muốn  Thu hồi DNA 3.2 Qui trình li trích DNA tổng số SDS  Dung dịch đồng mẫu (Homogenization Buffer) gồm: Tris 200 mM (pH 8,0), EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0,5% - Bước 1: Nghiền mẫu tube 1,5ml có chứa 400 µl dịch đồng mẫu - Bước 2: Bổ sung vào tube 500 µl PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ phút, li tâm với vận tốc 10.000 vịng/5 phút, sau hút dịch cho vào ống tube - Bước 3: Bổ sung 400 µl chloroform vào, lắc nhẹ phút, li tâm 10.000 vòng/5 phút, hút dịch chuyển qua tube - Bước 4: Thêm 600 µl ethanol 99o, lắc nhẹ phút Ủ -200C 30 phút Sau li tâm 12.000 vòng/5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Phơi tube nhiệt độ phòng - Bước 5: Thêm vào kết tủa DNA 30 µl nước khử ion hấp khử trùng (khơng chứa DNase) 30 µl TE 0,5X, vortex nhẹ bảo quản 40C -200C 3.4 Ly trích DNA plasmid vi khuẩn Giới thiệu Qui trình ly trích plasmid dùng để ly trích DNA plasmid từ huyền phù tế bào vi khuẩn dựa qui trích ly trích kiềm tính phát triển Birnboim Doly (1979) Qui trình ly trích dựa khác biệt hình thái DNA plasmid – phân tử nhỏ, siêu xoắn, DNA nhiễm sắc thể - lớn nhiều xoắn Sự khác biệt giúp phân biệt kết tủa DNA nhiễm sắc thể, protein tế bào với plasmid phân tử RNA Ở điều kiện kiềm, tế bào phân giải, nucleic acid protein bị biến tính Khi dung dịch trung hòa Kali Acetate (CH3COOK), DNA nhiễm sắc thể protein kết tủa phân tử phục hồi lại cấu trúc ban đầu (do kích thước lớn) Các plasmid hồi tính ổn định tồn dung dịch, tách hẳn khỏi DNA nhiễm sắc thể protein Vật liệu – Thiết bị - Hóa Chất Vật liệu, thiết bị Hóa chất ống 1,5 mL Dung dịch I (lạnh) bình tam giác Dung dịch II Máy ly tâm Dung dịch III (lạnh) Máy vortex Isopropanol Bồn ủ Nước (khử ion, tiệt trùng)  Dung dịch I (bảo quản 4oC) 50mM glucose (lọc khử trùng) 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 10mM EDTA (pH 8.0)  Dung dịch II 0.2 N NaOH 1% SDS  Dung dịch III (bảo quản 4oC) 5M potassium acetate (Kali acetate) Glacial acetic acid Qui trình ly trích DNA plasmid (Birnboim Doly, 1979) Vi khuẩn E.coli mang plasmid nuôi cấy môi trường LB lỏng (trypton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%) 37 oC, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 nuôi cấy (nuôi qua đêm) sử dụng để ly trích plasmid theo qui trình gồm bước sau: Lấy ml dịch khuẩn cho vào tube 1,5 ml Ly tâm dịch khuẩn tốc độ 5.000 rpm phút Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa Lập lại bước 1, 2, Thêm 100 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ Thêm 200 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch II Đảo tube để trộn hỗn hợp Không vortex bước Giữ tube đá Thêm 150 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn hỗn hợp Giữ tube đá khoảng phút Ly tâm 10.000 rpm 10 phút Chuyển dịch sang tube (1V) Thêm 2V isopropanol, vortex nhẹ; để yên 20 phút -20oC 10 Ly tâm 10.000 rpm/ phút để thu kết tủa DNA Loại dịch phía Thêm 500 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l ethanol 70%, ly tâm 10.000 rpm/5 phút Loại bỏ dịch phơi ống khơng cịn dung dịch bên ống 11 Thêm 30 μl dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.l nước khử ion (không chứa Dnase) TE Vortex nhẹ bảo quản -20 oC BÀI ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG Mục đích: Giúp sinh viên hiểu cách định lượng nucleic acid phương pháp đo mật độ quang Yêu cầu: Sinh viên đo lượng mẫu tính nồng độ nucleic acid Nội dung 3.1 Nguyên tắc Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng phân tử vật chất mơi trường lỏng người ta tính nồng độ chúng Mỗi phân tử có đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) độ dài sóng định tùy thuộc vào cấu trúc chúng Sự hấp thụ tương tác proton với electron vòng purin pyrimidin Đỉnh hấp thụ nucleotic 260nm vùng tử ngoại Sự hấp thụ tính giá trị OD (Optical Density) Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là: 50µg/ml DNA sợi đơi 40µg/ml DNA sợi đơn hay RNA 20µg/ml oligonucleotide sợi đơn Hay tính cơng thức DNA ng/µl = 62,9*OD 260- 36*OD280 Từ giá trị OD đo được, ta suy nồng độ acid nucleic dung dịch Dung dịch acid nucleic xem tỉ lệ OD260/OD280 nằm khoảng 1,8-2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ thấp phương pháp khơng xác 3.2.Phương pháp Đo OD260 dung dịch DNA mẫu Đo OD280 dung dịch DNA mẫu Tính tỉ lệ OD260/OD280 Đun cách thủy 20 phút dung dịch DNA mẫu, làm lạnh đột ngột nước đá 10 phút Đo OD260 dung dịch biến tính Quan sát giải thích kết kết luận Kết đạt Kết đo OD BÀI KỸ THUẬT ĐIỆN DI Mục đích Giúp sinh viên hiểu phương pháp thu nhận mẫu acid nucleic phân tích, định tính định lượng DNA Yêu cầu - Thực đổ gel agarose 0,8%, nạp mẫu, thực điện di quan sát gel tia UV - Xác định hàm lượng dung dịch acid nucleic phương pháp đo OD 4.1 Điện di acid nucleic Giới thiệu Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di sử dụng phân tích hay phối hợp với kỹ thuật khác, định tính định lượng Những đoạn DNA lớn nhiễm sắc thể phân tách kỹ thuật điện di cải biến pulsed field gel electrophoresis (PFGE), sử dụng thay đổi chiều di chuyển DNA Kỹ thuật điện di đơn giản sử dụng rộng rãi kỹ thuật điện di ngang Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này, thường sử dụng ethidium bromide Chất nhuộm bám vào DNA cách chèn vào cặp base đối diện tạo huỳnh quang cam/đỏ chiếu tia UV Các chất nhuộm thay khác với độ nhạy tương đương nguy nguy hiểm hơn, SYBRGreen hay Gelstar Gel agarose sử dụng để phân tách phân tử lớn khoảng 100 bp Agarose dạng polymer đun hịa tan, đổ khn tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác (thường minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) định hình lược gel (comb) sau đổ gel vào khn Miếng gel đặt ngập chìm dung dịch điện di DNA thêm vào giếng Dòng điện qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm phân tử DNA tích điện âm di chuyển phía cực dương Agarose gel ma trận gồm lỗ phân tử DNA có kích thước nhỏ di chuyển qua dễ dàng phân tử DNA có kích thước lớn Với u cầu độ phân giải cao hay việc tách chiết phân tử DNA ngắn nên sử dụng gel polyacrylamide Hình 4.1 Ethidium bromide (a) ethidium bromide; (b) trình chèn vào phân tử DNA ethidum bromide Vật liệu Thiết bị điện di agarose gồm:  Bộ cung cấp nguồn điện  Bồn điện di  Khay, lược gel  Giá đổ gel (gel caster) Hóa chất  Dung dịch đệm điện di (TAE TBE)  Agarose  Loading dye Cách chuẩn bị dung dịch đệm 1x Tris-Acetate-EDTA (TAE) (được pha loãng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn) gồm Tris 40 mM (pH 7,6), acetic acid 20 mM, EDTA mM 50x TAE Stock (1 L) Hòa tan 600 mL nước hấp khử trùng: 242 g Tris base (FW = 121); 57,1 ml glacial acetic acid; 100 ml EDTA 0,5 M (pH 8.0), thêm nước vào đến thể tích cuối 1L 1x Tris-Boric Acid-EDTA (TBE) (được pha loãng từ dung dịch stock có nồng độ cao hơn) gồm Tris 89 mM (pH 7,6), boric acid 89 mM, EDTA mM 10x Stock (1 liter)— Hòa tan 600 mL nước hấp khử trùng: 108 g Tris base (FW = 121); 55 g boric acid (FW = 61.8) 40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) thêm nước vào đến thể tích cuối 1L DNA and RNA sample Loading Dye Dung dịch đệm chạy mẫu 10X gồm glycerol 50%, bromophenol blue 0,25%, xylene cyanole 0,25% đệm TAE 1X Dung dịch đệm chạy mẫu thường chuẩn bị với thể tích từ 1– 10 m Hình 4.2 Hệ thống điện di gel agarose (a) Nguồn điện; (b) bồn điện di (Mini-Sub Cell GT, Bio-rad) 10 Khay đổ gel Giá đổ gel với ngang di chuyển, thích hợp nhiều cỡ gel khác Bồn điện di Thành cố định Giá đổ gel Hình 4.3 Cách chuẩn bị gel đặt gel vào bồn điện di Các bước thực Chuẩn bị gel Xác định lượng agarose cần dùng để đạt nồng độ agarose thể tích mong muốn Ví dụ, để pha 100 mL agarose 1% cần phải thêm gram agarose vào 100 mL buffer điện di (0,5X hay 1X) Bảng 4.1 Các nồng độ gel dùng phân tách DNA Nồng độ gel (%) 0,5 0,75 1,00 1,25 1,50 2-5 Kích thước DNA (kb) – 30 0,8 -12 0,5 - 10 0,4 - 0,2 - 0,01 – 0,5 Thêm lượng Agarose thích hợp vào bình chứa (ví dụ bình tam giác 250 mL, chai có nắp đậy 100 mL) Thêm vào lượng buffer điện di thích hợp (0,5 X hay X) lắc để phân tán agarose buffer Ghi chú: đánh dấu mực chất lỏng bình Nếu chất lỏng bị bốc hơi, thêm nước vào để đạt thể tích ban đầu Cho dung dịch gel vào lò vi sóng đun sơi hạt agarose tan hoàn toàn Ngưng microwave sau 30 giây lắc làm agarose tan nhanh Lưu ý: mang găng tay, áo blouse chuẩn bị đổ gel Bình chứa agarose nóng gây tiếp xúc trực tiếp với da Ngoài ra, agarose nóng chảy văng lên làm trình lắc 11 Làm nguội agarose xuống khoảng 60oC trước đổ gel vào khay có mang lược gel Lưu ý: thêm vào 0,5 μg/mL ethidium bromide vào agarose nóng chảy.g/mL ethidium bromide vào agarose nóng chảy Chuẩn bị bồn điện di Khi gel nguội đặc lại, khay gel đặt vào bồn điện di, ngập dung dịch đệm điện di Lược gel tháo tạo nên “giếng” rỗng dành mẫu điện di vào Mẫu bơm vào giếng micropipette (xem Chuẩn bị mẫu) Có thể thực điện di với loại dung dịch đệm điện di khác Tris-Acetate-EDTA (TAE) hay Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer TAE tạo di chuyển điện trường nhanh cho DNA mạch thẳng độ phân giải tốt cho DNA siêu xoắn; đệm TBE có khả đệm mạnh cho trình điện di với thời gian dài với hiệu điện cao Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào dạng lược sử dụng (độ dày chiều dài) độ dày gel Khi lượng mẫu sử dụng để chạy gel xác định, thêm loading dye vào với nồng độ cuối 1X Chất nhuộm có tác dụng giữ mẫu đáy giếng điện di giúp theo dõi di chuyển mẫu trình điện di Bơm mẫu vào giếng pipette Ghi chú: giếng gel thường khó nhận biết Để nhìn thấy giếng rõ đặt giấy hay băng keo màu đen bên bồn điện di, vị trí giếng Điện di Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường nắp bồn điện di lắp vào bồn theo hướng dựa vào vị trí đánh dấu điện cực 10 Nguồn điện cung cấp thay đổi tùy theo độ dày, chiều dài nồng độ gel, dạng dung dịch đệm điện di sử dụng Hiệu điện từ 20 – 110 V sử dụng cho hầu hết mục đích 11 Nhuộm gel Có phương pháp để nhuộm quan sát nucleic acid khác sử dụng ethidium bromide (EtBr):  Thêm 0.5 µg/ml trực tiếp vào gel agarose  Thêm 0.4 µg/ml trực tiếp vào mẫu chạy mẫu gel không chứa EtBr  Nhuộm gel sau điện di xong Ngâm gel dung dịch EtBr Ghi chú: EtBr chất gây ung thư cần phải thao tác cẩn thận Ln mang găng tay, mắt kính áo blouse Bỏ dung dịch EtBr sử dụng gel cách QUI TRÌNH NHUỘM ETHIDIUM BROMIDE SAU KHI ĐIỆN DI Đặt gel vào dung dịch EtBr thích hợp (0,5 µg/ml), nhuộm 15 – 30 phút Sử dụng dung dịch nhuộm ngập toàn gel Rửa gel 10 – 30 phút cách ngâm gel nước Ghi chú: Ethidium Bromide bị loại khỏi DNA sau trình rửa Quá trình rửa gel làm giảm độ nhạy trình phát DNA Tuy nhiên, thời gian rửa gel ngắn tạo tín hiệu cao Rửa lại gel nước để loại EtBr bám gel Đặt gel tia UV để quan sát phân tích DNA Phức hợp DNA/EtBr phát sáng tia UV bước sóng 254, 302 366 nm 12