Thực hành sinh học phân tử

Trang 8 2Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng trên dùng làm cơ sở để chẩn đoán các bệnhdi truyền hoặc xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dựđoán hiệu quả của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH HỌC PHÂN TỬ

TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN LAN ANH 21126009

NGUYỄN THỊ LAN ANH 21126014

ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN 21126287NGÔ NGỌC HẢI 21126324

Tháng 05 năm 2023

MỤC LỤC

M C L CỤC LỤC ỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Chương 1 M Đ Ung Ở ĐẦU ẦU

1.1 Gi iới thi uệu

1.2 M c tiêuục tiêu

Chươngng 2 T NG QUAN TÀI LI UỔNG QUAN TÀI LIỆU ỆU

2.1 Gi i thi u v trang thi t b ới ệu ề trang thiết bị ết bị ị trong phòng thí nghi mệu

2.1.1 Máy l c n nhi t (incubatorắc ổn nhiệt (incubator ổn nhiệt (incubator ệu shaker)

2.1.2 T hút khí đ c (fume hood)ủ hút khí độc (fume hood) ộc (fume hood)

2.1.3 T c y vô trùng (laminar ủ hút khí độc (fume hood) ấy vô trùng (laminar flow hood)

2.1.4 Máy vortex

2.1.5 T l nhủ hút khí độc (fume hood) ạnh

2.1.6 N i h p t đ ng ồi hấp tự động ấy vô trùng (laminar ự động ộc (fume hood) (autoclave)

2.1.7 Máy ly tâm

2.1.8 B n nhi t (waterbath)ồi hấp tự động ủ hút khí độc (fume hood) ệu

2.1.9 Máy khu y t (magnetic ấy vô trùng (laminar ừ (magnetic stirrer)

2.1.10 Cân kỹ thu t ật (bechtop/balance)

2.1.11 Máy luân nhi t ệu (thermocycler)

2.1.12 D ng c dùng trong thí ục tiêu ục tiêu nghi mệu

Chươngng 3 LY TRÍCH DNA T NG ỔNG QUAN TÀI LIỆU S T TH C V T/ Đ NG V TỐ TỪ THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT Ừ THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT ỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT ẬT/ ĐỘNG VẬT ỘNG VẬT ẬT/ ĐỘNG VẬT

3.1 V t li u nghiên c uật ệu ứu

3.1.1 Đ i tối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứung nghiên c uứu

3.1.2 D ng c và thi t bục tiêu ục tiêu ết bị ị

3.1.3 Hóa ch tấy vô trùng (laminar

3.2 Phươngng pháp th c hi nự động ệu

3.3 Quy trình ly trích DNA t ng s b ng SDSổn nhiệt (incubator ối tượng nghiên cứu ằng SDS

3.4 K t qu và th o lu nết bị ả và thảo luận ả và thảo luận ật

3.4.1 K t quết bị ả và thảo luận

3.4.2 Th o lu nả và thảo luận ật

3.5 Ki n nghết bị ị

Chươngng 4 LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHU NẨN

4.1 V t li u nghiên c uật ệu ứu

4.1.1 Đ i tối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứung nghiên c uứu

4.1.2 D ng c và thi t bục tiêu ục tiêu ết bị ị

4.1.3 Hoá ch tấy vô trùng (laminar

4.2 Phươngng pháp th c hi nự động ệu

4.3 Quy trình ly trích DNA plasmid vi khu nẩn

4.4 K t qu và th o lu nết bị ả và thảo luận ả và thảo luận ật

4.4.1 K t quết bị ả và thảo luận

4.4.2 Th o lu nả và thảo luận ật

4.5 Ki n nghết bị ị

Chươngng 5 Đ NH LỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ ƯỢNG DNA BẰNG KỸ NG DNA B NG KỸ ẰNG KỸ THU T ĐO M T Đ QUANGẬT/ ĐỘNG VẬT ẬT/ ĐỘNG VẬT ỘNG VẬT

5.1 V t li uật ệu

5.2 Nguyên t cắc ổn nhiệt (incubator

5.3 Phươngng pháp

5.4 K t qu và th o lu nết bị ả và thảo luận ả và thảo luận ật

5.4.1 Đ nh lị ượng nghiên cứung DNA t ng sổn nhiệt (incubator ối tượng nghiên cứu

5.4.2 Đ nh lị ượng nghiên cứung DNA plasmid

Chương 6 KỸ THU T ĐI N DIng ẬT/ ĐỘNG VẬT ỆU

6.1 M c đíchục tiêu

6.2 Đi n di acid nucleicệu

6.3 V t li u nghiên c uật ệu ứu

6.3.1 Đ i tối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứung nghiên c uứu

6.3.2 Thi t b đi n di agaroseết bị ị ệu

6.3.3 Hóa ch tấy vô trùng (laminar

6.4 Các bướic th c hi nự động ệu

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Máy lắc ổn nhiệt 3

Hình 2.2 Tủ hút khí độc 3

Hình 2.3 Tủ cấy vô trùng 4

Hình 2.4 Máy vortex 4

Hình 2.5 Tủ mát 5

Hình 2.6 Nồi hấp 5

Hình 2.7 Máy ly tâm 5

Hình 2.8 Bồn ủ nhiệt trong phòng thí nghiệm 6

Hình 2.9 Máy khuấy từ 6

Hình 2.10 Cân kỹ thuật 7

Hình 2.11 Máy luận nhiệt 7

Hình 2.12 PCR tube 7

Hình 2.13 Micropipette 8

Hình 2.14 Các đầu tip 8

Hình 3.1 Các loại hóa chất 9

Hình 3.2 Quy trình bước 1 10

Hình 3.3 Quy trình bước 2 10

Hình 3.4 Quy trình bước 3 11

Hình 3.5 Quy trình bước 4 11

Hình 3.6 Quy trình bước 5 11

Hình 3.7 Quy trình bước 6 12

Hình 3.8 Quy trình bước 7 12

Hình 3.9 Quy trình bước 8 12

Hình 3.10 Quy trình bước 9 12

Hình 3.11 Điện di ly trích DNA tổng số của động vật 13

Hình 4.1 Quy trình bước 1 15

Hình 4.2 Quy trình bước 2 15

Hình 4.3 Quy trình bước 3 15

Hình 4.5 Quy trình bước 5 16

Hình 4.6 Quy trình bước 6 16

Hình 4.7 Điện di ly trích DNA plasmid vi khuẩn E coli 17

Hình 5.1 Định tính DNA tổng số 19

Hình 5.2 Định tính DNA plasmid 19

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Giới thiệu

Vào ngày 25 tháng 4 năm 1953, James Watson và Francis Crick đã mô tả đặctính DNA với một bài báo trên tạp chí Nature Khám phá của họ đã đánh dấu mộtbước phát triển đỉnh cao của cả một thập kỷ nghiên cứu căng thẳng sau sự chứng minhcủa Oswald T Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty rằng DNA là phân tử ditruyền, không phải protein như người ta vẫn nghĩ trước đây

DNA mang thông tin di truyền, bảo quản, bảo tồn thông tin di truyền và biếnđổi tạo nền tảng cho sự tiến hóa DNA được phiên mã thành mRNA và sau đó dịch mãthành một chuỗi các axit amin quyết định cấu trúc ba chiều của protein, từ đó quyếtđịnh chức năng sinh học của bản thân DNA Do đó, DNA cung cấp các chỉ dẫn để duytrì chức năng sinh học và được coi là bản thiết kế của sự sống Với những chức năngquan trọng đó, nhà khoa học đã phát minh phương pháp ly trích DNA nhằm tạo điềukiện thuận lợi cho sự tiến bộ trong kiến thức về bộ gen người và đóng một vai trò quantrọng trong sự ra đời của nhiều lĩnh vực khác nhau trong khoa học như chỉnh sửa gen

và y học cá nhân hóa

Ly trích acid nucleic là điểm khởi đầu trong bất kỳ nghiên cứu sinh học phân tử

do đó được coi là một quá trình quan trọng Việc tách chiết DNA thô đầu tiên đã đượcthực hiện bởi bác sĩ người Thụy Sĩ Friedrich Miescher vào năm 1869 Ông đã vô tìnhtinh chế DNA từ nhân trong khi điều tra protein từ bạch cầu và nhận thấy rằng tínhchất của chất này về cơ bản khác với protein, từ đó ông đặt ra thuật ngữ “nuclein”.DNA có thể được chiết xuất từ các nguồn đa dạng như các mẫu lâm sàng như kim nhỏhút dịch cơ thể và mẫu sinh thiết, các mẫu pháp y như vết máu khô, gạc và dấu vântay, đến đất, mô thực vật và động vật, côn trùng, động vật nguyên sinh, vi khuẩn vànấm men

DNA được phân lập từ các mẫu sinh học khác nhau được sử dụng để xác địnhtrình tự DNA, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), PCR định lượng (qPCR), thấmphương nam, khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (RAPD), chuẩn bị cho thư viện bộgen cũng như đa hình độ dài đoạn khuếch đại (AFLP), đa hình độ dài đoạn giới hạn(RFLP), đa hình lặp lại song song ngắn (STRP), đa hình nucleotide đơn (SNP) và sốlượng biến ứng dụng lặp lại song song (VNTR)

Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng trên dùng làm cơ sở để chẩn đoán các bệnh

di truyền hoặc xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dựđoán hiệu quả của thuốc hoặc phản ứng có hại của thuốc bằng cách sử dụng công nghệDNA tái tổ hợp để tạo ra các sản phẩm dược phẩm như hormone và vaccine cũng nhưxét nghiệm di truyền dự đoán để đánh giá nguy cơ và sử dụng các chiến lược sàng lọc

và phòng ngừa sớm Ví dụ, phát hiện sớm các đột biến trong gen sinh ung thư RET vàcan thiệp trước triệu chứng được sử dụng để ngăn ngừa sự phát triển của đa dạng tânsinh nội tiết loại 2 Trong vi sinh vật học, phân tích axit nucleic có thể được sử dụng

để nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài và giúp xác định các đột biến làm phátsinh kháng kháng sinh

1.2 Mục tiêu

Cung cấp kỹ năng sử dụng và vận hành một số thiết bị thông dụng dùng trong

ly trích DNA, chuẩn bị các dung dịch hoá chất Ly trích, tách chiết được DNA tổng số

và DNA plasmid, định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) và điện

di trên gel agarose nhằm phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học phân tử

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về trang thiết bị trong phòng thí nghiệm

2.1.1 Máy l c n nhi t (incubator shaker) ắc ổn nhiệt (incubator shaker) ổn nhiệt (incubator shaker) ệt (incubator shaker)

Được sử dụng cho các phản ứng cần nhiệt ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh

vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc

Hình 2.1 Máy lắc ổn nhiệt

2.1.2 T hút khí đ c (fume hood) ủ hút khí độc (fume hood) ộc (fume hood)

Dùng chuẩn bị hay thực hiện thí nghiệm sử dụng các hóa chất bay hơi độc, cómùi khó chịu như phenol, chloroform,

Hình 2.2 Tủ hút khí độc

2.1.3 T c y vô trùng (laminar flow hood) ủ hút khí độc (fume hood) ấy vô trùng (laminar flow hood)

Tủ cấy vô trùng hay còn gọi là tủ cấy vi sinh là một loại tủ an toàn sinh họcđược sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học Thiết bị này tạo ra các điều kiện vôtrùng trong khoang làm việc, phục vụ cho ngành công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế

bào, các công nghệ vô sinh, thực phẩm, dược phẩm, y tế, thao tác PCR,… Tủ được sửdụng với các tác nhân mẫu vật không gây hại cho người sử dụng hay môi trường Hơnnữa, tủ còn đáp ứng độ sạch không khí theo tiêu chuẩn ISO Class 5

Hình 2.3 Tủ cấy vô trùng

2.1.4 Máy vortex

Máy lắc vortex phòng thí nghiệm là một thiết bị sử dụng trong phòng thínghiệm để trộn hoặc khuấy các chất, mẫu, dung dịch trong ống hoặc bình bằng cáchlắc chúng Máy có thể trộn một cách nhanh chóng, đồng nhất các mẫu dạng chất lỏng,chất lỏng rắn, rắn hoặc bất kì hợp chất mong muốn nào

Hình 2.4 Máy vortex

2.1.5 T l nh ủ hút khí độc (fume hood) ạnh

Tủ mát (4°C) hoặc tủ lạnh sâu (-20°C, -80°C) dùng để giữ các sinh phẩm, hóachất và mẫu thí nghiệm cần giữ ở nhiệt độ thấp Đối với mẫu, hoá chất bảo quản ở tủlạnh sâu cần xử lí đúng cách và chọn vật chứa phù hợp trước khi bảo quản

2.1.8 B n nhi t (waterbath) ồi hấp tự động (autoclave) ủ hút khí độc (fume hood) ệt (incubator shaker)

Bể ủ nhiệt là thiết bị được sử dụng để duy trì nhiệt độ của nước ở một mức nhấtđịnh Bể ủ nhiệt có thể cấp nhiệt cho mẫu lỏng với lượng nhỏ trong khoảng thời gian.Ngoài ra, bể ủ nhiệt còn sử dụng để làm nóng thuốc thử, nuôi cấy tế bào ủ cũng như hỗtrợ cho các phản ứng hóa học xảy ra ở nhiệt độ cao Một ứng dụng khác của bể ủ nhiệtnhư: sử dụng để làm ấm túi máu, kiểm tra APTT, gia nhiệt các chất dễ cháy như dungmôi…

Hình 2.8 Bồn ủ nhiệt trong phòng thí nghiệm

2.1.9 Máy khu y t (magnetic stirrer) ấy vô trùng (laminar flow hood) ừ (magnetic stirrer)

Máy khuấy từ là một trong những loại thiết bị thường có trong các phòng thínghiệm Chúng sử dụng lực từ trường để tiến hành hoạt động đảo, khuấy dung dịch thínghiệm

Hình 2.9 Máy khuấy từ

2.1.10 Cân kỹ thu t (bechtop/balance) ật (bechtop/balance)

Là loại cân rất quan trọng và cần thiết, có công dụng giúp người thực hiệnnhanh chóng đo đạc được trọng lượng của những vật có kích thước nhỏ Đây chính làloại cân điện tử có độ chính xác từ 0.1g – 0.001g (1 đến 3 số lẻ)

Hình 2.10 Cân kỹ thuật

2.1.11 Máy luân nhi t (thermocycler) ệt (incubator shaker)

Máy luân nhiệt (máy PCR) là dụng cụ phòng thí nghiệm thiết yếu trong các lĩnhvực công nghệ sinh học, nhân bản, kiểu gen, đột biến giúp tối ưu hóa dễ dàng các xétnghiệm PCR với kết quả có độ chính xác cao

Hình 2.11 Máy luận nhiệt A Bên trong máy luận nhiệt, B Bên ngoài máy luận nhiệt.

2.1.12 D ng c dùng trong thí nghi m ụng cụ dùng trong thí nghiệm ụng cụ dùng trong thí nghiệm ệt (incubator shaker)

Tube: ống sử dụng trong quá trình ly tâm, tách chiết, bảo quản mẫu… Có khóanắp an toàn Làm từ nhựa nguyên sinh không có các hóa chất thôi ra từ nhựa gây ảnhhưởng kết quả thí nghiệm Chịu lực ly tâm lên đến 30.000 xg

Hình 2.12 PCR tube

Micropipette (pipetman): là dụng cụ phòng thí nghiệm dùng để hút xả mộtlượng mẫu chính xác từ nơi này đến nơi khác với độ chính xác rất khác nhau, tùy vàohãng sản xuất, công nghệ sản xuất và thao tác của người sử dụng Nguyên lý hoạt độngcủa micropipet là tạo ra một khoảng chân không phù hợp ở phía trên của khoang giữchất lỏng rồi xả ra để phân phối chất lỏng

Hình 2.13 Micropipette

Các đầu tip (cone): là vật tư được sử dụng trong pipet hút mẫu tự động hay còn

có tên gọi khác là micropipet Chúng có tác dụng hút chính xác dung dịch với một thểtích nhất định trong thí nghiệm và các nghiên cứu sinh sử dụng micropipet hoặc dụng

cụ hút mẫu tự động, có thể canh chính xác dung tích cần hút sau một lần nhấp Vì cácmẫu rất nhỏ thường được sử dụng, các đầu tip cần được gắn chặt vào các đầu hút củamicropipette

Hình 2.14 Các đầu tip

Chương 3 LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT/

ĐỘNG VẬT

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đ i t ối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứu ng nghiên c u ứu

- DNA tổng số của mẫu tôm

3.1.2 D ng c và thi t b ụng cụ dùng trong thí nghiệm ụng cụ dùng trong thí nghiệm ết bị ị

- Dụng cụ: tube 1,5 mL, bình tam giác, micropipette

- Thiết bị: máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ, thiết bị điện di

3.1.3 Hóa ch t ấy vô trùng (laminar flow hood)

- NaCl 250 mM: cân bằng ion muối trong và ngoài môi trường

- SDS 0,5%: là chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ màng tế bào, quátrình ly trích diễn ra dễ dàng hơn

3.1.3.2 H n h p phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) 25:24:1 ỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) 25:24:1 ợng nghiên cứu

- Phenol: làm biến tính protein

- Chloroform: không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽlàm cho dịch này phân thành hai lớp Hỗn hợp ly tâm để phân tách lớp, protein bị kếttủa sẽ nằm ở pha giữa Hoạt động yếu hơn Phenol

- Isoamyl alcohol: là một ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( Na+, K+,

NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA

3.1.3.3 Ethanol 99° ho c isopropano ặc isopropano

Có tác dụng loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch mà chúng kết tủa theoDNA và 10% phenol còn sót lại trong hỗn hợp DNA

3.2 Phương pháp thực hiện

Phương pháp ly trích DNA bằng dịch trích SDS Phương pháp này dựa trên cơ

sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền mẫu thịt đã cắt thành mảnh nhỏ 0,05 cm và dùngcác hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trongcác ống eppendorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa chất và loại bỏ nhữngthành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA và bảo quản ở 4°C hoặc -20°C

Hình 3.3 Quy trình bước 2

Bước 3: bổ sung 300 µl (1V) CI (chloroform/isoamyl alcohol) tỉ lệ (24:1) vào,lắc đều, li tâm 10.000 rpm/ 5 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới.

3.4 Kết quả và thảo luận

3.4.1 K t qu ết bị ả

Hình 3.11 Điện di ly trích DNA tổng số của động vật

Chương 4 LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHUẨN

4.1 Vật liệu nghiên cứu

4.1.1 Đ i t ối tượng nghiên cứu ượng nghiên cứu ng nghiên c u ứu

- DNA plasmid của vi khuẩn E coli.

4.1.2 D ng c và thi t b ụng cụ dùng trong thí nghiệm ụng cụ dùng trong thí nghiệm ết bị ị

- Dụng cụ: tube 1,5 mL, bình tam giác

- Thiết bị: máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ và thiết bị điện di

4.1.3 Hoá ch t ấy vô trùng (laminar flow hood)

4.1.3.1 Dung d ch I ị

- Glucose (lọc khử trùng) 50 mM: cân bằng áp suất thẩm thấu

- Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM: giúp pH không bị thay đổi đột ngột gây hư mẫu

- EDTA (pH 8.0) 10 mM: hấp thị ion để bảo vệ DNA plasmid

4.1.3.2 Dung d ch II ị

- NaOH 0,2 N: tạo môi trường kiềm, biến tính DNA

- SDS 1%: làm biến tính protein, sau đó SDS liên kết với protein chìm xuốngđáy tube Đồng thời SDS cũng phá vỡ tế bào (nhũ tương hóa màng tế bào)

4.1.3.3 Dung d ch III ị

- Potassium acetate (Kali acetate) 5M: khi cho vào SDS thay bằng K chuyểnthành PDS Tác dụng trung hoà dung dịch kiềm, plasmid hồi tính, PDS và proteinchìm xuống đáy

- Glacial acetic acid: tồn tại dưới dạng tinh thể băng, hồi tính DNA

4.1.3.4 Isopropanol

Có tác dụng loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch mà chúng kết tủa theoDNA và 10% phenol còn sót lại trong hỗn hợp DNA Đồng thời có tác dụng làm biếntính DNA

4.2 Phương pháp thực hiện

Vi khuẩn E coli mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng

(Tryton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%) ở 37°C, tốc độ lắc 200rpm Dịch huyềnphù vi khuẩn sau 16 giờ nuôi cấy (nuôi cấy đêm) được sử dụng để ly trích plasmid

4.3 Quy trình ly trích DNA plasmid vi khuẩn