Thực hành sinh học phân tử

Trang 8 2Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng trên dùng làm cơ sở để chẩn đoán các bệnhdi truyền hoặc xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dựđoán hiệu quả của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHĨM Niên khoá : 2021 – 2025 Tháng 05 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN LAN ANH 21126009 NGUYỄN THỊ LAN ANH 21126014 ĐỖ NGỌC BẢO CHÂN 21126287 NGÔ NGỌC HẢI 21126324 Tháng 05 năm 2023 MSSV MỤC LỤC MỤC LỤCC LỤC LỤCC DANH SÁCH CÁC HÌNH Chươngng MỞ ĐẦU ĐẦUU 1.1 Giớii thiệuu 1.2 Mục tiêuc tiêu Chươngng TỔNG QUAN TÀI LIỆUNG QUAN TÀI LIỆUU 2.1 Giớii thiệuu trang thiết bị trang thiết bị t bị phịng thí nghiệum 2.1.1 Máy lắc ổn nhiệt (incubatorc ổn nhiệt (incubatorn nhiệut (incubator shaker) 2.1.2 Tủ hút khí độc (fume hood) hút khí độc (fume hood)c (fume hood) 2.1.3 Tủ hút khí độc (fume hood) cấy vô trùng (laminar y vô trùng (laminar flow hood) 2.1.4 Máy vortex 2.1.5 Tủ hút khí độc (fume hood) lạnhnh 2.1.6 Nồi hấp tự động i hấy vô trùng (laminar p tự động độc (fume hood)ng (autoclave) 2.1.7 Máy ly tâm 2.1.8 Bồi hấp tự động n ủ hút khí độc (fume hood) nhiệut (waterbath) 2.1.9 Máy khuấy vô trùng (laminar y từ (magnetic (magnetic stirrer) 2.1.10 Cân kỹ thuật t (bechtop/balance) 2.1.11 Máy luân nhiệut (thermocycler) 2.1.12 Dục tiêung cục tiêu dùng thí nghiệum Chươngng LY TRÍCH DNA TỔNG QUAN TÀI LIỆUNG SỐ TỪ THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT TỪ THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬTC VẬT/ ĐỘNG VẬTT/ ĐỘNG VẬTNG VẬT/ ĐỘNG VẬTT 3.1 Vật t liệuu nghiên cứuu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứui tượng nghiên cứung nghiên cứuu i 3.1.2 Dục tiêung cục tiêu thiết bị t bị 6.3 Vật t liệuu nghiên cứuu 3.1.3 Hóa chấy vơ trùng (laminar t 6.3.1 Đối tượng nghiên cứui tượng nghiên cứung nghiên cứuu 3.2 Phươngng pháp thự động c hiệun 6.3.2 Thiết bị t bị điệun di agarose 3.3 Quy trình ly trích DNA tổn nhiệt (incubatorng sối tượng nghiên cứu SDSng SDS 6.3.3 Hóa chấy vơ trùng (laminar t 6.4 Các bướic thự động c hiệun 3.4 Kết bị t thảo luận thả thảo luậno luật n 3.4.1 Kết bị t thảo luận 3.4.2 Thả thảo luậno luật n 3.5 Kiết bị n nghị Chươngng LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHUẨNN 4.1 Vật t liệuu nghiên cứuu 4.1.1 Đối tượng nghiên cứui tượng nghiên cứung nghiên cứuu 4.1.2 Dục tiêung cục tiêu thiết bị t bị 4.1.3 Hố chấy vơ trùng (laminar t 4.2 Phươngng pháp thự động c hiệun 4.3 Quy trình ly trích DNA plasmid vi khuẩnn 4.4 Kết bị t thảo luận thả thảo luậno luật n 4.4.1 Kết bị t thảo luận 4.4.2 Thả thảo luậno luật n 4.5 Kiết bị n nghị Chươngng ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ NH LƯỢNG DNA BẰNG KỸ NG DNA BẰNG KỸ NG KỸ THUẬT/ ĐỘNG VẬTT ĐO MẬT/ ĐỘNG VẬTT ĐỘNG VẬT QUANG 5.1 Vật t liệuu 5.2 Nguyên tắc ổn nhiệt (incubatorc 5.3 Phươngng pháp 5.4 Kết bị t thảo luận thả thảo luậno luật n 5.4.1 Đị nh lượng nghiên cứung DNA tổn nhiệt (incubatorng sối tượng nghiên cứu 5.4.2 Đị nh lượng nghiên cứung DNA plasmid Chươngng KỸ THUẬT/ ĐỘNG VẬTT ĐIỆUN DI 6.1 Mục tiêuc đích 6.2 Điệun di acid nucleic ii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Máy lắc ổn nhiệt Hình 2.2 Tủ hút khí độc Hình 2.3 Tủ cấy vô trùng Hình 2.4 Máy vortex Hình 2.5 Tủ mát Hình 2.6 Nồi hấp Hình 2.7 Máy ly tâm Hình 2.8 Bồn ủ nhiệt phịng thí nghiệm Hình 2.9 Máy khuấy từ .6 Hình 2.10 Cân kỹ thuật .7 Hình 2.11 Máy luận nhiệt Hình 2.12 PCR tube Hình 2.13 Micropipette Hình 2.14 Các đầu tip Hình 3.1 Các loại hóa chất Hình 3.2 Quy trình bước 10 Hình 3.3 Quy trình bước 10 Hình 3.4 Quy trình bước 11 Hình 3.5 Quy trình bước 11 Hình 3.6 Quy trình bước 11 Hình 3.7 Quy trình bước 12 Hình 3.8 Quy trình bước 12 Hình 3.9 Quy trình bước 12 Hình 3.10 Quy trình bước 12 Hình 3.11 Điện di ly trích DNA tổng số động vật 13 Hình 4.1 Quy trình bước 15 Hình 4.2 Quy trình bước 15 Hình 4.3 Quy trình bước 15 Hình 4.4 Quy trình bước 16 Hình 4.5 Quy trình bước 16 Hình 4.6 Quy trình bước 16 Hình 4.7 Điện di ly trích DNA plasmid vi khuẩn E coli 17 Hình 5.1 Định tính DNA tổng số 19 Hình 5.2 Định tính DNA plasmid .19 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu Vào ngày 25 tháng năm 1953, James Watson Francis Crick mơ tả đặc tính DNA với báo tạp chí Nature Khám phá họ đánh dấu bước phát triển đỉnh cao thập kỷ nghiên cứu căng thẳng sau chứng minh Oswald T Avery, Colin MacLeod Maclyn McCarty DNA phân tử di truyền, protein người ta nghĩ trước DNA mang thông tin di truyền, bảo quản, bảo tồn thông tin di truyền biến đổi tạo tảng cho tiến hóa DNA phiên mã thành mRNA sau dịch mã thành chuỗi axit amin định cấu trúc ba chiều protein, từ định chức sinh học thân DNA Do đó, DNA cung cấp dẫn để trì chức sinh học coi thiết kế sống Với chức quan trọng đó, nhà khoa học phát minh phương pháp ly trích DNA nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho tiến kiến thức gen người đóng vai trò quan trọng đời nhiều lĩnh vực khác khoa học chỉnh sửa gen y học cá nhân hóa Ly trích acid nucleic điểm khởi đầu nghiên cứu sinh học phân tử coi trình quan trọng Việc tách chiết DNA thơ thực bác sĩ người Thụy Sĩ Friedrich Miescher vào năm 1869 Ơng vơ tình tinh chế DNA từ nhân điều tra protein từ bạch cầu nhận thấy tính chất chất khác với protein, từ ơng đặt thuật ngữ “nuclein” DNA chiết xuất từ nguồn đa dạng mẫu lâm sàng kim nhỏ hút dịch thể mẫu sinh thiết, mẫu pháp y vết máu khô, gạc dấu vân tay, đến đất, mô thực vật động vật, côn trùng, động vật nguyên sinh, vi khuẩn nấm men DNA phân lập từ mẫu sinh học khác sử dụng để xác định trình tự DNA, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), PCR định lượng (qPCR), thấm phương nam, khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (RAPD), chuẩn bị cho thư viện gen đa hình độ dài đoạn khuếch đại (AFLP), đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP), đa hình lặp lại song song ngắn (STRP), đa hình nucleotide đơn (SNP) số lượng biến ứng dụng lặp lại song song (VNTR) Trong lĩnh vực y học, ứng dụng dùng làm sở để chẩn đoán bệnh di truyền xác định tình trạng người mang gen, liệu pháp gen, dược lý học để dự đốn hiệu thuốc phản ứng có hại thuốc cách sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo sản phẩm dược phẩm hormone vaccine xét nghiệm di truyền dự đoán để đánh giá nguy sử dụng chiến lược sàng lọc phịng ngừa sớm Ví dụ, phát sớm đột biến gen sinh ung thư RET can thiệp trước triệu chứng sử dụng để ngăn ngừa phát triển đa dạng tân sinh nội tiết loại Trong vi sinh vật học, phân tích axit nucleic sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài giúp xác định đột biến làm phát sinh kháng kháng sinh 1.2 Mục tiêu Cung cấp kỹ sử dụng vận hành số thiết bị thơng dụng dùng ly trích DNA, chuẩn bị dung dịch hố chất Ly trích, tách chiết DNA tổng số DNA plasmid, định lượng DNA phương pháp đo mật độ quang (OD) điện di gel agarose nhằm phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu trang thiết bị phịng thí nghiệm 2.1.1 Máy lắc ổn nhiệt (incubator shaker)c ổn nhiệt (incubator shaker)n nhiệt (incubator shaker)t (incubator shaker) Được sử dụng cho phản ứng cần nhiệt ổn định (phản ứng enzyme, tăng sinh vi sinh vật) Máy bao gồm buồng có nhiệt độ điều chỉnh kèm với phận lắc Hình 2.1 Máy lắc ổn nhiệt 2.1.2 Tủ hút khí độc (fume hood) hút khí độc (fume hood)c (fume hood) Dùng chuẩn bị hay thực thí nghiệm sử dụng hóa chất bay độc, có mùi khó chịu phenol, chloroform, Hình 2.2 Tủ hút khí độc 2.1.3 Tủ hút khí độc (fume hood) cấy vô trùng (laminar flow hood)y vô trùng (laminar flow hood) Tủ cấy vơ trùng hay cịn gọi tủ cấy vi sinh loại tủ an tồn sinh học sử dụng phịng thí nghiệm sinh học Thiết bị tạo điều kiện vô trùng khoang làm việc, phục vụ cho ngành công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào, công nghệ vô sinh, thực phẩm, dược phẩm, y tế, thao tác PCR,… Tủ sử dụng với tác nhân mẫu vật không gây hại cho người sử dụng hay mơi trường Hơn nữa, tủ cịn đáp ứng độ khơng khí theo tiêu chuẩn ISO Class Hình 2.3 Tủ cấy vơ trùng 2.1.4 Máy vortex Máy lắc vortex phịng thí nghiệm thiết bị sử dụng phịng thí nghiệm để trộn khuấy chất, mẫu, dung dịch ống bình cách lắc chúng Máy trộn cách nhanh chóng, đồng mẫu dạng chất lỏng, chất lỏng rắn, rắn hợp chất mong muốn Hình 2.4 Máy vortex 2.1.5 Tủ hút khí độc (fume hood) lạnhnh Tủ mát (4°C) tủ lạnh sâu (-20°C, -80°C) dùng để giữ sinh phẩm, hóa chất mẫu thí nghiệm cần giữ nhiệt độ thấp Đối với mẫu, hoá chất bảo quản tủ lạnh sâu cần xử lí cách chọn vật chứa phù hợp trước bảo quản Hình 2.10 Cân kỹ thuật 2.1.11 Máy luân nhiệt (incubator shaker)t (thermocycler) Máy luân nhiệt (máy PCR) dụng cụ phịng thí nghiệm thiết yếu lĩnh vực công nghệ sinh học, nhân bản, kiểu gen, đột biến giúp tối ưu hóa dễ dàng xét nghiệm PCR với kết có độ xác cao B A Hình 2.11 Máy luận nhiệt A Bên máy luận nhiệt, B Bên máy luận nhiệt 2.1.12 Dụng cụ dùng thí nghiệmng cụng cụ dùng thí nghiệm dùng thí nghiệt (incubator shaker)m Tube: ống sử dụng trình ly tâm, tách chiết, bảo quản mẫu… Có khóa nắp an tồn Làm từ nhựa ngun sinh khơng có hóa chất thơi từ nhựa gây ảnh hưởng kết thí nghiệm Chịu lực ly tâm lên đến 30.000 xg Hình 2.12 PCR tube Micropipette (pipetman): dụng cụ phòng thí nghiệm dùng để hút xả lượng mẫu xác từ nơi đến nơi khác với độ xác khác nhau, tùy vào hãng sản xuất, công nghệ sản xuất thao tác người sử dụng Nguyên lý hoạt động micropipet tạo khoảng chân khơng phù hợp phía khoang giữ chất lỏng xả để phân phối chất lỏng Hình 2.13 Micropipette Các đầu tip (cone): vật tư sử dụng pipet hút mẫu tự động hay cịn có tên gọi khác micropipet Chúng có tác dụng hút xác dung dịch với thể tích định thí nghiệm nghiên cứu sinh sử dụng micropipet dụng cụ hút mẫu tự động, canh xác dung tích cần hút sau lần nhấp Vì mẫu nhỏ thường sử dụng, đầu tip cần gắn chặt vào đầu hút micropipette Hình 2.14 Các đầu tip Chương LY TRÍCH DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT/ ĐỘNG VẬT 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứui tượng nghiên cứung nghiên cứuu - DNA tổng số mẫu tôm 3.1.2 Dụng cụ dùng thí nghiệmng cụng cụ dùng thí nghiệm thiết bịt bị - Dụng cụ: tube 1,5 mL, bình tam giác, micropipette - Thiết bị: máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ, thiết bị điện di 3.1.3 Hóa chấy vơ trùng (laminar flow hood)t Hình 3.1 Các loại hóa chất 3.1.3.1 Dung dịch đồi hấp tự động (autoclave)ng nhấy vô trùng (laminar flow hood)t mẫu (Homogenization Buffer)u (Homogenization Buffer) - Tris 200 mM (pH 8,0): chất đệm pH giúp ổn định pH = - EDTA 25 mM: có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase, bảo vệ DNA - NaCl 250 mM: cân ion muối ngồi mơi trường - SDS 0,5%: chất hoạt động bề mặt có tác dụng phá vỡ màng tế bào, q trình ly trích diễn dễ dàng 3.1.3.2 Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) 25:24:1n hợng nghiên cứup phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) 25:24:1 - Phenol: làm biến tính protein - Chloroform: khơng tan nước, bổ sung vào dịch ni tế bào làm cho dịch phân thành hai lớp Hỗn hợp ly tâm để phân tách lớp, protein bị kết tủa nằm pha Hoạt động yếu Phenol - Isoamyl alcohol: ancohol với có mặt cation hóa trị I ( Na +, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA 3.1.3.3 Ethanol 99° isopropano c isopropano Có tác dụng loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA 10% phenol cịn sót lại hỗn hợp DNA 3.2 Phương pháp thực Phương pháp ly trích DNA dịch trích SDS Phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền mẫu thịt cắt thành mảnh nhỏ 0,05 cm dùng hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng ống eppendorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, hóa chất loại bỏ thành phần khơng mong muốn, từ thu nhận DNA bảo quản 4°C -20°C 3.3 Quy trình ly trích DNA tổng số SDS Bước 1: nghiền mẫu tube có chứa 700 µl dịch đồng mẫu, li tâm với vận tốc 10.000 rpm/ phút, sau hút dịch cho vào ống tube Hình 3.2 Quy trình bước Bước 2: bổ sung vào tube 600 µl (1V) PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) lắc đều, li tâm với vận tốc 10.000 rpm/ phút, sau hút dịch cho vào ống tube Hình 3.3 Quy trình bước 10 Bước 3: bổ sung 300 µl (1V) CI (chloroform/isoamyl alcohol) tỉ lệ (24:1) vào, lắc đều, li tâm 10.000 rpm/ phút, hút dịch chuyển qua tube Hình 3.4 Quy trình bước Bước 4: thêm 180 µl (0,6V) isopropanol, lắc nhẹ, để yên 30 phút -20oC Hình 3.5 Quy trình bước Bước 5: ly tâm 12.000 rpm/ 10 phút để thu kết tủa DNA Loại dịch phía Hình 3.6 Quy trình bước Bước 6: thêm 500 μl ethanol 70%, ly tâm 12.000 rpm/ phút Loại bỏ dịch nổi.l ethanol 70%, ly tâm 12.000 rpm/ phút Loại bỏ dịch 11 Hình 3.7 Quy trình bước Bước 7: lặp lại bước thêm lần Hình 3.8 Quy trình bước Bước 8: phơi ống không cịn dung dịch bên ống Hình 3.9 Quy trình bước Bước 9: thêm vào kết tủa DNA 50 µl TE 1X, trộn bảo quản -20oC Hình 3.10 Quy trình bước 12 3.4 Kết thảo luận 3.4.1 Kết bịt Hình 3.11 Điện di ly trích DNA tổng số động vật 3.4.2 Thảo luật (bechtop/balance)n Ở giếng này, ly trích DNA tổng số không thành công, mẫu nhiễm protein nặng nên không thấy xuất DNA sau điện di 3.5 Kiến nghị Đối với DNA tổng số bị tạp nhiễm trên, nguyên nhân q trình thực thao tác thí nghiệm khơng đúng, tay nghề cịn kém, thể tích lấy sai Nên muốn DNA tinh cần lưu ý: trình thực thao tác cần ý cẩn thận tránh làm vỡ mẫu, không để mẫu bị nhiễm bẩn, ý hóa chất sử dụng, nâng cao trình độ tay nghề 13 Chương LY TRÍCH DNA PLASMID VI KHUẨN 4.1 Vật liệu nghiên cứu 4.1.1 Đối tượng nghiên cứui tượng nghiên cứung nghiên cứuu - DNA plasmid vi khuẩn E coli 4.1.2 Dụng cụ dùng thí nghiệmng cụng cụ dùng thí nghiệm thiết bịt bị - Dụng cụ: tube 1,5 mL, bình tam giác - Thiết bị: máy ly tâm, máy vortex, bồn ủ thiết bị điện di 4.1.3 Hoá chấy vô trùng (laminar flow hood)t 4.1.3.1 Dung dịch I - Glucose (lọc khử trùng) 50 mM: cân áp suất thẩm thấu - Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM: giúp pH không bị thay đổi đột ngột gây hư mẫu - EDTA (pH 8.0) 10 mM: hấp thị ion để bảo vệ DNA plasmid 4.1.3.2 Dung dịch II - NaOH 0,2 N: tạo mơi trường kiềm, biến tính DNA - SDS 1%: làm biến tính protein, sau SDS liên kết với protein chìm xuống đáy tube Đồng thời SDS phá vỡ tế bào (nhũ tương hóa màng tế bào) 4.1.3.3 Dung dịch III - Potassium acetate (Kali acetate) 5M: cho vào SDS thay K chuyển thành PDS Tác dụng trung hồ dung dịch kiềm, plasmid hồi tính, PDS protein chìm xuống đáy - Glacial acetic acid: tồn dạng tinh thể băng, hồi tính DNA 4.1.3.4 Isopropanol Có tác dụng loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA 10% phenol cịn sót lại hỗn hợp DNA Đồng thời có tác dụng làm biến tính DNA 4.2 Phương pháp thực Vi khuẩn E coli mang plasmid nuôi cấy môi trường LB lỏng (Tryton 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%) 37°C, tốc độ lắc 200rpm Dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 nuôi cấy (nuôi cấy đêm) sử dụng để ly trích plasmid 4.3 Quy trình ly trích DNA plasmid vi khuẩn 14