BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử cơ bản COLONY PCR

  ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA ĐIỀU DƯỠNG – KỸ THUẬT Y HỌC BỘ MÔN XÉT NGHIỆM BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN TRẦN HỒNG PHÚC LỚP XN19 – NHĨM GVHD: Nguyễn Hồng Tuyết Minh Nguyễn Thị Trúc Anh   Buổi 1: 03/10/2022 I COLONY PCR  Mục đích: - Phát tế bào vi khuẩn có mang tái tổ hợp gen mong muốn thời gian ngắn, tốn đơn giản II Dụng cụ: - Đĩa thạch chứa khúm khuẩn - Đầu côn, pipette, giấy - Máy ly tâm - Máy Nanodrop - Đầu tube eppendrof  - Dung dịch sát khuẩn - Tăm vơ khuẩn - Hóa chất : KTS5 III - Quy trình: Bước 1: Dùng tăm bơng vơ khuẩn ( đầu côn sạch) lấy khúm khuẩn cho vào đầu tube eppendrof chứa 30 µL dung dịch KTS5 - Bước 2: Trộn hỗn hợp đun cách thủy ( 90-100 oC) vòng phút - Bước 3: Đem mẫu vừa đun cách thủy, quay ly tâm 13000 vòng/phút vòng phút - Bước 4: Dùng pipette hút 20 µL phần dịch cho vào đầu tube khác - Bước 5: Trộn hút µL dịch đem đo máy Nanodrop IV Kết quả: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 54.6 NG/ µL A260: 1,093 A280: 0,561 A260/A280: 1,95 A260/A230: 0,91  Nhận xét: Biểu đồ ch chưa ưa có dạng hình chng chng chuẩn chuẩn,, lỗi kĩ kĩ thuật, thao thao tác chưa chuẩn, dụng cụ chưa đạt độ Đồ thi có đỉnh 260nm -> Có DNA mẫu với tỉ lệ cao Đồ thị có thêm đỉnh 230nm -> có xuất chất hữu cơ  Đồ thị khơng có đỉnh 280 nm -> có ngoại nhiễm protein A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết A260/A230 < 1.8 : Hiện diện lượng đáng kể chất hữu cơ  BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Buổi 2: 04/10/2022 I TÁCH CHIẾT DNA HBV Mục đích: - II Tách chiết DNA HBV Dụng cụ: - III Găng tay ( không bột) Eppendorf tube KTS1: Phenol, Guanin Isothiocynate, KTS2: Chloroform KTS3:Isopropanol Glyco-Blue KTS4: Ethanol 70% KTS5: DEPC Mẫu bệnh phẩm Pipette, đầu côn, lọ đựng dung dịch sát khuẩn Máy ly tâm, máy Nanodrop Quy trình: Gồm 17 bước: Chuẩn Chuẩn bị số lượng lượng eppen eppendorf dorf 1,5 1,5 ml có đánh đánh số tương tương ứng với với số lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 60ºC Vortex Vortex kỹ ống DNA DNA IIC C Ch Choo vào epp µl DNA DNA IC Cho vào eppendorf 900 µl KTS1-R Cho 100 µl huyết thanh vào ống Vortex Vortex mạnh eppendorf eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml  Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Thêm 600 µl KTS3 10 Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 11 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng 12 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   13 Nhẹ nhàng thêm vào 900 µl KTS4 14 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 15 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 16 Làm khô cặn 10 phút 60ºC bồn ủ nhiệt khơ 17 µl KTS5 ng ay phản ứng2-3 phiên mã ngược ngượcRT.Hòa Nếucặn chưa chạy10PCR liền thìThực bảo quản 2-8ºC ngày, 20ºC vịng tháng * Sau đó, đo DNA máy Nanodrop ghi nhận kết IV Kết quả: TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 533,4 ng/ µL A260: 10,669 A280: 5,621 A260/A280: 1.90 A260/A230: 2.4 Nhận xét: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Đồ thị có Đỉnh 260, lệch 270 => có lượng DNA cao xuất lượng Protein đáng kể A260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết A260/A230 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết Kết luận: Mẫu đạt độ tinh Buổi 3: 05/10/2022 KỸ THUẬT PCR  BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   I Mục đích: - II PCR trình tổng hợp sợi DNA dựa DNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác enzyme DNA polumerase Chuẩn bị: Dụng cụ cụ: - Máy Máy P PCR CR + hhệệ thố thống ng máy máy ttín ính h - Găng Găng tay tay khô không ng bột, t, ốn ốngg E Epp ppen endo dorf rf - Đầu Đầu côn, côn, mi micr crop opip ipet ette tes, s, máy máy Vor Vorte texx Hóa chất: - DNA DNA IIC C DNA DNA chứn chứngg nội nội ngoạ ngoạii ssin inh h - Master Mix: o Tris – HCl pH 0.8, KCl, MgCl2 o dATP, dTTP dCTP, dGTP o Taq DNA polymerase - Primobe Mix: o Hệ mồi nhân vùng gene S HBV o TaqMan đặc hiệu cho HBV (FAM) o Hệ mồi nhân DNA IC o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX) III Quy trì trình tth hực hi hiện: Rã đơng mẫu mẫu hồn tồn toàn bằng cách đặt đặt nhiệt nhiệt độ phịng phịng tối đa đa 30 phút phút Sau ly tâm nhẹ 3000-4000 rpm đặt vào rack lạnh Chuẩn bị bị eppe eppendor ndorff 0.2ml, 0.2ml, đánh số thứ thứ tự ghi vào tờ tờ giấy thông thông tin mẫu (ngày làm mẫu, người thực hiện, số) thêm eppendorf 0.2ml để chứa mẫu PC (positive control) Đem mẫu mẫu eppen eppendorf dorf vào vào buồng buồng ATSH ATSH đđểể thực thực hiện Hút 5µl 5µl mẫu mẫu DNA DNA XN vào eppen eppendorf dorf 0.2 0.2ml ml Trộn đều thành thành bọt Lưu Lưu ý: cho mẫu mẫu vào hết sau sau đến PC cuối cuối để để tránh Đem quay qngoại uay lynhiễm tâm 30 3000 00 vòng/ vòng/phút phút trong phút phút Tiến Tiến hhành ành đem mẫu PCR PCR Cách chỉnh chu kỳ nhiệt:   Tạo folder, tạo chương trình cho HBV Chỉnh chu kỳ nhiệt theo kit: chu kỳ 95°C - 15 phút   40 chu kỳ 95°C - 20 giây   IV 60°C - phút (đọc tín hiệu) Kết quả: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR    Nhận xét: Kết Unknow IC mẫu -> tách chiết thất bại, cần thực lại  Nguyên nhân: Do trình thao tác tác người thực BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Buổi 4: 06/10/2022 I KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRÊN GEL Nguyên tắc: Điện di DNA gel agarose kỹ thuật dùng để phân tách phát đoạn DNA (hoặc đại phân tử khác, RNA protein) dựa kích thước điện tích chúng - DNA mang điện tích âm, di chuyển từ cực âm sang cực dương - Các phân tử DNA có trọng lượng, kích thước khác quãng đường khác điện trường thời gian - II Dụng cụ: - Gel agarose 1% - Ethidium bromide - Dung dịch TAE (Tris – Acetate – EDTA) - Glycogen methylene blue -  DNA chuẩn - Mẫu DNA tách chiết -  Nguồn điện điện - Buồng điện di - Khuôn đổ gel - Hệ thống soi chụp ảnh tia UV III Quy trình: Tiến hành đổ gel Agarose nhỏ mẫu: - Bước 1: Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE (TrisAcetate-EDTA) Acetate-ED TA) nhiệt độ phòng, khuấy để yên phút, cho vào lị viba (làm nóng chảy gel không tạo bọt) - Bước 2: Làm nguội gel xuống 50 – 55°C, thêm 3µl ethidium bromide, đổ gel vào khuôn gel lắp lược - Bước 3: Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược đổ buffer  vào khay gel cho buffer ngập gel, cao mặt gel khoảng – mm Pha buffer: 10ml TAE + 490 ml ED - Bước 4: DNA mẫu trộn với 3µl dung dịch nạp mẫu (glycerol,  bromophenoll blue)  bromopheno - Bước 5: Nạp 5µl DNA mẫu 5µl DNA chuẩn vào giếng, đậy nắp cắm điện cực BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   - Bước 6: Điện di khoảng 30 - 40 phút với điện 100 – 120V - Bước 7: Chụp hình ảnh gel ánh sáng UV để xem kết IV Kết quả: - Các vạch sáng màu: điện di đạt hiệu - Khơng có vạch: PCR thất bại, trình tách chiết bị ngoại nhiễm BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Buổi 5: 17/10/2022 I - TÁCH CHIẾT VI KHUẨN H.PYLORI Mục đích: Thực tách chiết vi khuẩn H.Pylori phương pháp cột theo kit  AccuPid H.pylori Detection Kit  Thu Nucleic trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy cáccác tácphân nhântửhóa học học - Loại bỏ thành phần tạp nhiễm để thu sản phẩm tinh - Ưu điểm: Ít tốn thời gian, độ tinh cao độc hại so với phương  pháp tách chiết chiết dung dung môi - Khuyết điểm: Tốn số lượng mẫu làm - II - - Nguyên tắc: Dựa nguyên tắc Acid Nucleic liên kết với pha rắn silica Trong điều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA loại bỏ chất không mong muốn lực ly tâm Sau bướcvàloại cácDNA chất không mong muốn, DNA dung giải khỏi màngcác silica thubỏ tinh III Dụng cụ: Micropipette, đầu côn, máy ly tâm, máy vortex, máy nanodrop, bồn ủ nhiệt khô, eppendorf  - Huyết thanh, nước cất - Hóa chất: o DNA IC ( chứng nội ngoại sinh) o KTC1 : Muối chaotropic nồng độ cao: Ly giải màng tế bào, biến tính  protein, bất bất hoạt nu nuclease clease hỗ hỗ trợ gắn DNA vào ssilic ilic Tris-HCL (pH=8): Giữ DNA hòa tan nước EDTA (pH=8): Bảo vệ DNA tránh khỏi phân hủy enzyme Chất tẩy rửa enzyme: Tăng hiệu hịa tan protein q trình ly giải o KTC2: Ethanol hoăc Isopropanol: Tăng khả gắn DNA vào silic o KTC3: Muối chaotropic nồng độ thấp: Loại bỏ tạp chất o KTC4: Ethanol : loại bỏ muối chaotropic o KTL2: EDTA, Tris-HCL, pH = 8-9: tạo môi trường nồng độ muối thấp,  pH cao làm màng silica silica tích điện âm đẩy DNA khỏi màng màng DNA bảo vệ EDTA -         IV Quy trình: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm eppendorf cho Chứng âm tách chiết Cho tiếp μl DNA IC (DNA IC cung cấp theo kit) Cho 200 μl dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf Cho tiếp 200 μl dịch sinh thiết xử lý vào eppendorf tương ứng Trộn ủ 700C 20 phút Thêm vào 100 μl dung dịch KTC2 trộn Đưa hỗn hợp bước vào cột Ly tâm 8000 vòng / phút phút Chuẩn bị loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Dùng kéo vô trùng cắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp) Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml Cho vào cột 600μl dung dịch KTC3 Ly tâm 8.000 vòng / phút phút ( Sử dụng muối có nồng độ thích hợp để loại bỏ protein thành phần xác tế  bào có trong mẫu) 10 cột sang 2,0 ml Cholọc vào cột 600μl dung dịch KTC4 Ly tâmChuyển 8.000 vòng / phúteppendorf phút Đổmới bỏ dịch ( Sử dụng ethanol để loại bỏ thành phần muối chaotropic có trước đó) 11 Ly tâm 13.000 vịng / phút phút để loại bỏ hết tất dấu vết dung dịch KTC4 ( Ly tâm để loại bỏ hồn tồn ethanol có mẫu để tránh ảnh hưởng đến hiệu suất  phản ứng Real time PCR) PCR) 12 Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml tương tự bước Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml Cho vào 20 μl KTL2 Ủ nhiệt độ 70 0C 20 phút 13 Ly tâm 13.000 vòng / phút phút để thu DNA Lưu mẫu sau tách chiết ở  o -20 C (tối đa tháng) không thực phản ứng PCR   V Kết quả: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   - Sample: NHUNG – PHUC – PHONG A260: 0.705 A280: 0.455 260/280: 1.55 < 1.8 260/230: 1.19 Chứng âm tách chiết ->Mẫu xét nghiệm -> Chứng dương Đậy nắp eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) đặt vào máy Real-time PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   6.1 Cài đặt vị trí mẫu block nhiệt máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM, HEX 6.2 Cài đặt chương trình sau: chu kì 950C – 15 phút 45 chu kì 950C – 20 giây; 570C – phút V Kết quả: Dựa vào tính hiệu huỳnh quan IC mẫu để định tính Cả IC mẫu ngưỡng phát quy trình => Dương tính với DNA HP -  Nồng độ vi vi khuẩn ban ban đầu tỉ lệ lệ nghịch với với chu kỳ khuếch đại của DNA - BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Buổi 8: 20/10/2022  20/10/2022  THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HBV I Mục đích:  - Biết thứ tự xếp DNA virus gây nên HBV II Chuẩn bị: III Quy trình thực - Lapt Laptop op có phần phần mềm mềm B Bio ioed edit it - File File ch chứa ứa đoạn đoạn D DNA NA mạc mạchh đơn đơn (mẫu (mẫu đđãã làm làm PCR) PCR) Bước PCR   Bước Bư ớc Làm Làm sạc sạchh sản sản phẩm phẩm PCR PCR Bước Phản ứng ứng giải giải trình trình tự tự (sequenc (sequencing ing PCR) PCR) với với trong loại ddNT ddNTPs Ps Bước Bư ớc 44 Làm Làm sạch sản sản phẩ phẩm m giải giải trì trình nh tự tự Bướớc Bư Điệ iệnn di di mao mao uảnn Bước Phân tích tích trình trình tự được giải giải bằng phần phần mềm chuyê chuyênn dụng dụng theo theo phương phương  pháp stranger stranger IV Nhận xé xét kế kết qu quả: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   -  bộ Dựagen vàocủa kếtHBV PCR, phương pháp stranger, phần mềm giải mã hình htheo ình - Kết định type vi khuẩn theo bảng sau: BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   BUỔI – NGÀY 1/11/2022 I Mục đích: TÁCH CHIẾT HCV RNA - Xử lý huyết huyết th anh để thu được RNA HCV HCV II Chuẩn bị Dụng cụ: Micropipette (10 µl, 200 µl, 1000 µl) Máy quay ly tâm Máy lắc trộn (votex) Bồn ủ nhiệt khơ Đầu Hóa ch chất: Huyết - III Bộ hóa phần chất tách Thành hóachiến chất:RNA AccuRive pRNA Prepkit – EX –RNA01.1A KTS1: Phenol, Guanin Isothiocynate, KTS2: Chloroform KTS3:Isopropanol Glyco-Blue KTS4: Ethanol 70% KTS5: DEPC Quy tr trình th thực hi hiện: Bước Chuẩn Chuẩn bị một eppendo eppendorf rf 1,5 ml, ghi ghi tên tên mẫu, mẫu, người người thực thực hiện Bậ Bậtt bồn ủ nhiệt khô 60 C Bướcc Bướ Cho ti tiếp ếp vào mỗi epp eppend endor orff 900 900 µl KTS1 – R Lưu ý: cần ý: cần trộn dung dịch trước sử dụng BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Bước Cho 100 µl huyết vào eppendorf Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để n 10 phút Bước Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Bước Ly tâm tâm 13.000 13.000 vòng vòng/phú /phútt tr ong 10 10 phú phútt nhiệt nhiệt độ phòng phòng Bước Chuẩn Chuẩn bị một eppendo eppendorf rf 1,5 ml mới có ghi ghi tên mẫu, người người thực hiện Bước 7 Chuyển 600 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: ý: thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Bước Thêm 60 600 µl KTS3 Lưu ý: ý: cần trộn dung dịch trước sử dụng Bướcc Vortex Bướ Vortex nhẹ nhẹ để trộn trộn đề u Để Để yê yênn 10 phút phút Bước 10 Ly tâm 13 13.000 000 vòng/ vòng/phút phút trong 10 phút nhiệt độ độ phòng Bước 11 11 Cẩn thận thận đổ bỏ dịch nổi, nổi, chỉ giữ lại lại cặn Lưu ý: Tránh ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước Bư ớc 112 Thêm Thêm 9900 00 µl KTS4 (có thể rửa lần) Bước 13 Ly tâm 13 13.000 000 vòng/ vòng/phút phút trong phút nhiệt độ phòng Bước 14 14 Cẩn thận thận đổ bỏ dịch nổi, nổi, chỉ giữ lại lại cặn Lưu ý: ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 15 Làm khô khô cặn trong 10 phút phút 60 60 C bồn ủ nhiệt khô Bướcc 16 Bướ 16 Hịa cặn trong 2200 µl KTS5 Nếu không tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản RNA tách chiết 2-80C vòng 2-3 ngày, 200C vòng tháng IV IV Kiểm Kiểm tr traa độ độ tin tinh h sạc h của mẫu mẫu bằn bằngg máy máy Nano Nanodr drop op:: Khởi động máy tính kết nối với Nanodrop chọn phần đo Acid nucleic Rửa máy: µl nước cất Đo blank: dùng pipette hút – µl dung dịch TE vào vị trí đo, đóng cánh tay máy lại đo blank, sau dùng khăn giấy lau - Điền Sample ID trước đo mẫu - Hút – microllit dung dịch ống tube vào vị trí đo, đóng cánh tay máy, ấn Measure để thực đo mẫu - Đọc kết - BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   V Nhận xét kết quả: - Type RNA : 40 - Conc: 28.6 - A260: 0.715 - A280: 0.498 - 260/280: 1.43 < 1.8 - 260/230: 0.16 < 1.8 - Mẫu tách chiết không tinh - Nguyên nhân: Do thao tác kỹ thuật, không tuân thủ thời gian phản ứng, thuốc thử, dụng cụ tái sử dụng dẫn tới có ngoại nhiễm chất hữu cơ  BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   BUỔI 10 – NGÀY 3/11/2022 CHẠY KẾT QUẢ REAL TIME PCR HCV I - PCR Mụclàđíq ch: trình tổng hợp sợi RNA dựa RNA khuôn nhờ hoạt động xúc tác enzyme RNA polymerase   II Chuẩn bị: Dụng cụ cụ: - Máy PCR + hệ thống máy tính - Găng tay không bột, ống Eppendorf - Đầu côn, micropipettes - Máy Vortex Hóa chất: - DNA IC: DNA chứng nội ngoại sinh - Master Mix:– HCl pH 0.8, KCl, MgCl2 o Tris BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   o o dATP, dTTP dCTP, dGTP Taq DNA polymerase Primobe Mix: o Hệ mồi nhân vùng gene S Hp o TaqMan đặc hiệu cho Hp(FAM) o Hệ mồi nhân DNA IC o Taq Man đặc hiệu DNA IC (HEX) Mẫu: - RNA gene vi khuẩn HCV có mẫu huyết - III Nguyên tắc: Hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica), phụ thuộc vào nồng độ muối  pH dung dung dịch ly giải tế bào bào - DNA dung giải khỏi màng - IV Quy trình thực hiện: Bước Rã đông đông cá cácc ống ống Mas MasterM terMix, ix, PrimobeM PrimobeMix ix và chứng chứng dương dương hoàn toàn5bằng nhiệt nhẹ – 10cách giây đặt đặt vào độ rackphòng lạnh.trong tối đa 30 phút Sau ly tâm Lưu ý:  ý: Thao tác Chứng dương tách biệt với ống MasterMix  PrimobeMix để hạn chế  PrimobeMix chế nguy nhiễm nhiễm Bước Vortex Vortex mạnh mạnh ống ống Primob PrimobeMix eMix hút hút 200 µl µl chuyển chuyển vào ống MasterMix Lưu ý:  ý: Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix q trình vortex, dẫn đến việc khơng đủ thể tích hút  Bước Trộn hỗn hỗn hợp hợp có tron trongg ống ống MAsterMi MAsterMixx bằng microp micropipet ipette te Hút 18 µl hỗn hợp cho vào Eppendorf 0.2 ml Bước Vortex Vortex nhẹ nhẹ từng dun dungg dị dịch ch DNA DNA xét nghiệp, nghiệp, ddung ung dịch chứng chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương Lưu ý: - Không Không đđược ược trộn trộn ống ống Mast MasterM erMix ix bbằng ằng máy máy vo vort rtex ex - Sử dụng dụng eppe eppend ndor orff 0,2 0,2 ml phù hợp với máy Rea Real-t l-time ime PCR PCR - Mỗi Mỗi hhỗn ỗn hợp hợp chu chuẩn ẩn bị đủ cho cho 19 19 pphả hảnn ứn ứng g Bước Cho 10 µl dung dịch RNA xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách chiết, dung dịch chứng dương vào ống Eppendorf 0.2 ml riêng lẻ chuẩn bị  bước Lưu ý: - Phản ứng RealReal-time time PCR phải phải đặt vào máy máy chạy chạy tr ong vòng sau bổ sung dịch RNA BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   - Mỗi lần lần chạy chạy máy máy Re Real-t al-time ime PCR PCR cần cần tối thiểu thiểu phản phản ứng cho cho C Chứng hứng âm tách tách chiết, phản ứng cho ống Chứng dương phản ứng với nước cất lần (hoặc dung dịch KTS5) làm Chứng âm PCR - Thứ tự tự chu chuẩn ẩn bị phản phản ứứng ng phải phải là: là: Chứng Chứng ââm m PCR PCR → Chứng Chứng âm tách tách chiết → Mẫu xét nghiệm → Chứng dương Bước 5.Đậy nắp Eppendorf 0.2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ đặt vào máy Real – time PCR Bước Cài đặt chương trình định dạng vị trí mẫu block nhiệt máy (Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho RNA HCV) HEX (đặc trưng cho RNA chứng nội ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho giếng chứng dương Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương máy sử dụng mẫu chứng dương E3, E5 E7 5x103, 5x105 5x107 copies BUỔI 11 – NGÀY 8/11/2022 THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HCV I Mục đích:  Biết thứ tự xếp RNA virus gây nên HCV II Chuẩn bị: - Lapt Laptop op có phần phần mềm mềm B Bio ioed edit it - File File ch chứa ứa đoạn đoạn R RNA NA mạc mạchh đơn đơn (mẫu (mẫu đđãã làm m PCR) PCR) III Quy trì trình thự thực Bước PCR   Bước Bư ớc Làm Làm sạc sạchh sản sản phẩm phẩm PCR PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR   Bước Phản ứng giải trình trình tự (sequ (sequencin encingg PCR) PCR) với trong loại ddNTPs Bước Bư ớc 44 Làm Làm sạch sản sản phẩ phẩm m giải giải trì trình nh tự tự Bước Bư ớc Điện Điện di mao mao quản quản Bước Phân tích trình trình tự giải giải bằn bằngg phần phần mềm mềm chuyên chuyên dụng theo  phương pháp pháp stranger stranger IV Nhận xét k kếết qu quả: - Dựa vào kết PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm giải mã  bộ gen HCV hình hình Bài tập BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR BAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCRBAO.cao.THUC.HANH.SINH.hoc.PHAN.tu.co.ban.COLONY.PCR