Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 4 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC VI SINH  GV hướng dẫn: TS Trương Phước Thiên Hồng  Nhóm: 04 TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022 BẢNG ĐÁNH GIÁ THÀNH VIÊN NHĨM 04 MSSV Họ tên Đóng góp Mức độ 21126546 Châu Nguyên Huyền Trân Làm Word 100% 21126548 Nguyễn Thị Bảo Trân 21126557 Nguyễn Quốc Trọng Nội dung 100% 21126559 Cao Minh Trực Nội dung 100% 21126562 Phạm Nhật Trường Nội dung 100% Nội dung 100% Nôi dung + Tổng hợp 21126593 Nguyễn Dương Phương Yến 100% Kí tên Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH Ngun tắc pha chế môi trường: Nguyên tắc để pha chế môi trường phải đảm bảo nhu cầu vi sinh vật (nguồn C, N khống) Ngồi cịn có số ngun tắc sau: a Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp: - Nếu muốn ni cấy vi sinh vật để quan sát hình thái phải ni cấy mơi trường đặc - Nếu muốn tìm hiểu trao đổi chất vi sinh vật thi dùng môi trường lỏng - Môi trường chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh b Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt vi sinh vật để bổ sung thành phần khác đó: - Cần ni cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi trường - Cần ni cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung hợp chất chứa N vào môitrường - Hay bổ sung kháng sinh vào môi trường nhằm ni cấy vi sinh vật có khả kháng lại kháng sinh1.3 Phân loại môi trường Dựa vào thành phần - Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường hợp chất tự nhiên như: khoai tây, cám gạo, bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữa…thành phần môi trường thường phức tạp không ổn định - Môi trường tổng hợp: sử dụng loại hóa chất hữu vơ tinh khiết để pha chế mơi trường với tỷ lệ xác - Môi trường bán tổng hợp: sử dụng hóa chất tinh khiết lẫn thành phần tự nhiên Dựa vào tính chất vật lý - Mơi trường lỏng - Mơi trường rắn: thường có từ 1,5-2% agar gelatine - Mơi trường bán lỏng: có khoảng 0,3-0,7% agar Dựa vào công dụng: - Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: mơi trường có chứa thành phần đặc biệt phù hợp với nhóm vi sinh vật Ví dụ mơi trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân… - Mơi trường kiểm định: dùng để xác định tính chất vi sinh vật Người ta thương bổ sung hợp chất đặc biệt có biến đổi nhìn thấy q trình ni cấy vi sinh vật chất thị màu Cách pha chế môi trường Pha chế môi trường khâu quan trọng cần phải xác Gồm bước sau: - Cân thành phần môi trường - Nếu môi trường lỏng: pha thành phần vào nước, ý thứ tự pha chế - Nếu môi trường đặc: hòa tan thành phần vào nước thêm 1,5-2% agar đun đến agar tan chảy - Lọc: thường lọc môi trường qua vải - Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật yêu cầu nghiên cứu, thường điều chỉnh pH phù hợp Thường dùng loại hóa chất như: H2SO4, H3PO4, KOH, NaOH… - Phân phối vào dụng cụ chứa: bình chứa cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, làm mơi trường thạch dĩa cho vào khoảng 10 - 15ml/dĩa, làm thạch nghiêng cho vào 1/4 - 1/5 chiều cao ống nghiệm - Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC, atm) nhằm tiêu diệt tất bào tử vi sinh vật khơng mong muốn có sẵn mơi trường  Thực pha chế mơi trường dịch trích khoai tây: + Khoai tây: 100g + Saccharose: 25g + Pepton: 2.5g + Yeast extract: 0.5g + Agar: 10g + H2O: đủ 1000 ml Cách thực hiện: Chia agar thành phần bỏ trước vào bình đựng Khoai tây đun với H2O để sôi 20 phút, lọc lấy dịch trong, bổ sung thành phần lại Phân phối vào bình chứa đem tiệt trùng 121oC 15 phút  Thực đổ thạch vào đĩa petri: Tồn q trình phải thực tủ cấy vô trùng gồm thao tác sau: Bước 1: Mở bao giấy gói hộp petri Bước 2: Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường Bước 3: Tay trái lấy nút bơng hơ miệng bình đèn cồn Bước 4: Nghiêng bình rót nhẹ chút môi trường vào đĩa petri sau tay trái mở nắp hộp Bước 5: Đậy nắp lại, xoay trịn hộp petri để mơi trường phân phối mặt đĩa Bước 6: Để yên cho môi trường nguội đông đặc Lật ngược hộp petri để nước bốc khô dần Chú ý: Thao tác đổ thạch phải nhanh khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn Các bước gói đĩa petri: Bước 1: Trải bao giấy gói đĩa mặt phẳng Bước 2: Lấy 10 đĩa petri đặt thành hàng đầu bao giấy Bước 3: Cuốn từ từ đầu bao lấy 10 đĩa petri Bước 4: Thực thao tác gấp xéo bên đầu nằm ngang bao giấy Bước 5: Tiếp tục thực thao tác bao, gấp xéo đầu hết giấy cố định đầu bao giấy Bài 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỀN VI SINH VẬT - Chuẩn bị:  Đĩa petri đổ môi trường giá đỗ (1 đĩa/người, ghi tên môi trường bề mặt đĩa)  Đèn cồn  Micro pipet 1000  Dung dịch chứa vi khuẩn pha lỗng có nồng độ 10-5 Thao tác cấy ria: Bước 1: Lau tủ cấy, sát khuẩn dụng cụ, tay cồn 70 độ Bước 2: Hơ que cấy móc lửa đèn cồn (đỏ đầu giây) Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa) Bước 4: Mở nắm đĩa, dùng que cấy chạm vào nơi khơng có vi khuẩn (để kiểm tra nhiệt độ khơng q nóng) Bước 5: Quét nhẹ đầu cấy để lấy vi khuẩn Bước 6: Đóng đĩa mẫu chứa vi khuẩn (hơ đĩa) Bước 7: Hơ đĩa petri cần cấy Bước 8: Cấy ria (Đường thứ cấy dày, đường thứ cấy thưa đường thứ bắt từ đường thứ nhất, đường thứ cấy thưa bắt từ đường thứ bắt từ đường thứ 3) Bước 9: Hơ đĩa petri, tắt đèn cồn  Kết quả: Đợi sau 2-3 ngày khuẩn lạc lên Đĩa petri cấy vi khuẩn môi trường giá đỗ Thao tác cấy trang: Bước 1: Lau tủ cấy , sát khuẩn dụng cụ , tay 70 độ Bước 2: Lấy que cấy thủy tinh từ cốc chứa 70 độ hơ qua lửa đèn cồn Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa) Bước 4: Sử dụng micro pipet lấy 100ml dụng dịch chứa vi khuẩn pha loãng nồng nồng độ 10-5 cho vào đĩa petri Bước 5: Sử dụng que cấy thủy tinh trang dung dịch khắp bề mặt đĩa petri có mơi trường PDA đến bề mặt khơ khơng cịn dịch Bước 6: Đậy nắp xoay đĩa petri đèn cịn để khử khuẩn Hình vi khuẩn cấy trang sau 24h Thao tác cấy móc: Bước 1: Lau tủ cấy, sát khuẩn dụng cụ, tay cồn 70 độ Bước 2: Hơ que cấy móc lửa đèn cồn (đỏ đầu giây) Bước 3: Hơ đĩa petri gần đèn cồn (xoay đĩa) Bước 4: Mở nắm đĩa, dùng que cấy chạm vào nơi vi khuẩn (để kiểm tra nhiệt độ khơng q nóng) Bước 5: Quét nhẹ đầu cấy để lấy vi khuẩn Bước 6: Đóng đĩa mẫu chứa vi khuẩn (hơ đĩa) Bước 7: Hơ đĩa petri cần cấy Bước 8: Cấy móc vi khuẩn từ đĩa mẩu sang đĩa cấy, móc điểm điểm tuỳ ý cho có thẩm mỹ Bước 9: Hơ đĩa petri, tắt đèn cồn Hình ảnh cấy móc Bài 3: QUAN SÁT NẤM SỢI Nấm sợi (nấm mốc) thường nhận diện đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát kính hiển vi Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi khuẩn ty thể Sợi nấm có khơng có vách ngăn Khuẩn ty mọc lên bề mặt chất thường cấu trúc mang bào tử Cuống mang bào tử phân nhánh khơng phân nhánh Bào tử vơ tính nấm sợi thường tập trung hai nhóm: bào tử kín bào tử trần Hai giống nấm sợi Aspergillus Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, khơng có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn Bào tử vơi tính bào tử trần Mucor Rhizopus thuộc nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes Hệ sợi khơng có vách ngăn có rễ giả Bào tử vơ tính bào tử kín Bào tử hữu tính bào tử tiếp hợp Rhizopus có cuống mang bào tử khơng phân nhánh Mucor có cuống mang bào tử phân nhánh - Giới thiệu nấm Aspergillus Aspergillus mộtchibao gồm hàng trăm nấm mốc tìm thấy nhiều vùng khí hậu khác tồn giới Nấm Aspergillus kính hiển vi Aspergillus lần đưa vào danh mục vào năm 1729 linh mục nhà sinh vật học người Ý Pier Antonio Micheli Khi quan sát loại nấm kính hiển vi, Micheli liên tưởng đến hình dạng aspergillum (vịi phun nước thánh), từ tiếng Latin spargere (để rắc), đặt tên chi cho phù hợp Aspergillum cấu trúc hình thành bào tử vơ tính phổ biến cho tất loài Aspergillus ; khoảng phần ba số loài biết có giai đoạn hữu tính Trong số loài Aspergillus biết gây nhiễm nấm, lồi khác có tầm quan trọng mặt thương mại - Tầm quan trọng thương mại Các loài Aspergillus quan trọng mặt y tế thương mại Một số lồi gây nhiễm trùng cho người động vật khác Một số bệnh nhiễm trùng tìm thấy động vật nghiên cứu nhiều năm, lồi khác tìm thấy động vật mô tả cụ thể bệnh điều tra, loài khác biết đến với tên gọi sử dụng cho sinh vật hoại sinh Hơn 60 loài Aspergillus mầm bệnh liên quan đến y tế Đối với người, loạt bệnh nhiễm trùng tai ngoài, tổn thương da loét phân loại mycetomas Các loài khác quan trọng trình lên men vi sinh vật thương mại Ví dụ, đồ uống có cồn rượu sake Nhật Bản thường làm từ gạo thành phần có tinh bột khác (như sắn), thay từ nho lúa mạch mạch nha Các vi sinh vật điển hình sử dụng để làm rượu, chẳng hạn nấm men thuộc giống Saccharomyces, lên men loại tinh bột Do đó, nấm mốc koji Aspergillus oryzae sử dụng để phân hủy tinh bột thành đường đơn giản - Sơ lược nấm tricodema Trichoderma bao gồm số lượng lớn thân rễ dạng sợi chủng nấm tìm thấy loạt hệ sinh thái Những loại nấm hầu hết phân lập từ rừng đất nông nghiệp vĩ độ dễ dàng ni cấy ống nghiệm, số loài tạo mùi mùi ‘dừa’ đặc trưng hoạt tính sinh học dễ bay hợp chất (6-pentyl-α-pyrone) Nấm Trichoderma gồm khoảng 33 lồi, có đặc tính sinh sản vơ tính Chúng nhân từ cá thể gốc thành nhiều cá thể khác theo cấp số nhân Nhiệt độ phù hợp cho chúng sinh trưởng khoảng 25-30 độ C Nấm tồn điều kiện lý tưởng khoảng năm rưỡi Chúng bị tiêu diệt ánh nắng gắt mưa q lâu Trichoderma lồi nấm hiếu khí sống phụ sinh xác bã hữu thực vật đất Chúng phân hủy cellulose xác bã thực vật tạo thành chất mùn cung cấp dinh dưỡng cho tăng độ phì nhiêu cho đất - Lợi ích mà tricodema mang lại : Trong trình sinh sống, nấm trichoderma ức chế sinh trưởng nhiều loài nấm gây bệnh như: Nấm Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium … Sợi nấm trichoderma quấn chặt sợi nấm khác Đồng thời tiết chất kháng sinh tiêu diệt nấm bệnh Trichoderma coi loài nấm đối kháng quan trọng với loài nấm bệnh đất Bản chất mycoparasitic (khả công loại nấm khác sử dụng chất dinh dưỡng chúng) Trichoderma việc sử dụng tiềm chúng tác nhân kiểm soát sinh học nấm gây bệnh thực vật biết đến sáu thập kỷ qua Nấm Tricodema kính hiển vi Bài 4: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN Tiêu giọt ép đem lại nhiều thơng tin chúng có nhược điểm định Vi sinh vật di chuyển dịch lỏng chuyển động Brown hay tự chuyển động nên khó khăn việc quan sát Chúng ta thấy hình dạng hoạt động vi sinh vật khơng thể xác định xác hình thái chúng (đặc biệt nhóm vi khuẩn) Do vậy, để xác định xác hình thái vi sinh vật người ta thường sử dụng phương pháp nhuộm màu (quan sát vi sinh vật chết) Vi khuẩn có thành tế bào vững để trì hình dạng Vì vậy, phân loại vi khuẩn theo hình dạng chúng Vi khuẩn có ba dạng bản: hình cầu (spherical, round), hình que (hình gậy, rod) hình xoắn (spiraled) Vi khuẩn hình cầu gọi coccus (số nhiều cocci) Vi khuẩn hình que gọi bacillus (số nhiều bacilli) hay đơn giản gọi rod Vi khuẩn có dạng xoắn có tối thiểu hai đến ba đường cong tế bào gọi spirillum (số nhiều spirilla) Các vi khuẩn có tế bào dài ngoằn ngoèo với vòng xoắn (lỏng chặt) gọi spirochetes Cách thức mà tế bào tạo thành nhóm đặc trưng cho giống loài vi khuẩn Các tế bào đứng thành cặp (diplococci), đứng thành chuỗi (streptococci), đứng thành cụm (staphylococci), đứng thành cụm bốn tế bào (tetrads), chúng đứng thành tế bào riêng lẻ Các vi khuẩn hình que (bacilli) thường dạng tế bào riêng lẻ, có khixuất dạng cặp nối tiếp (diplobacilli) hay đứng thành chuỗi dài (streptobacilli) Một số lồi có khuynh hướng đứng thành cụm tế bào hình que song song (palisade) tạo thành hình chữ V, X, Y chúng nhân đôi phân chia Một số lồi tạo thành nhiều hình dáng kích thước khác (đa hình thể, pleomorphism) Các xoắn khuẩn thường xuất dạng tế bào đứng riêng lẻ thường khơng kết thành nhóm Tạo vết bơi làm tiêu nhuộm đơn Tạo vết bôi vi khuẩn (bacterial smear) làm khô tế bào vi khuẩn phiến kính Các bước thực (1) vi khuẩn trải lên phiến kính cho tế bào nằm thành lớp mỏng, (2) tế bào vi khuẩn khơng bị rửa trơi q trình nhuộm (3) vi khuẩn không bị biến dạng Sử dụng phương pháp nhuộm đơn tạo tương phản vi khuẩn cảnh Phương pháp dùng để thu thập thơng tin hình dạng, kích thước xếp tế bào Bước đặt phiến kính lên giá, phủ lên vết bơi phẩm nhuộm, chờ vài giây Các phẩm nhuộm thường dùng crystal violet (thời gian nhuộm 20 – 30 giây), carbolfuchsin (thời gian nhuộm – 10 giây) methylene blue (thời gian nhuộm phút) Tạo vết bôi Tạo vết bôi vi khuẩn làm khô tế bào vi khuẩn phiến kính ⁕ Quy trình : Bước 1: Dùng bút lông (không xoay cho lớn vi khuẩn đầu phiến kính Dùng que cấy tròn hơ đèn cồn để trùng để nguội Bước 2: Dùng que cấy vòng lấy giọt nước để phiến kính , sau trùng que cấy lấy khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển hai vòng cấy vi khuẩn vào phiến kính Trải diện tích khoảng ½ inch Bước 3: Hơ nhẹ phiến kính đèn cồn dùng que cấy vòng trải tế bào vi khuẩn tế bào vi khuẩn cố định chết vi khuẩn để bám vào phiến kính ( việc giúp vi khuẩn khơng bị rửa trơi q trình nhuộm vi khuẩn không bị biến dạng) Nhuộm đơn ⁕ Quy trình : Bước : Đặt phiến kính lên giá Bước : Nhuộm vi khuẩn với giọt phẩm nhuộm Crystal violet để vòng phút Bước : Rửa trôi phẩm nhuộm nước vài giây Bước : Tiếp tục nhỏ giọt Lugol để phút, rửa cồn trán nhanh với nước Bước : Nhỏ dung dịch alcohol 90% để vài giây rửa lại với nước Bước : Nhỏ giọt dung dịch Safranin để phút, rửa nước để khơ Quan sát kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 100X với vật kính dầu 10 Bài 5: NHUỘM GRAM Vào năm 1884, Christian Gram, nhà nghiên cứu bệnh học người Đan Mạch, khám phá phương pháp nhuộm vi sinh vật phẩm nhuộm pararosaniline Thông qua việc sử dụng theo trình tự hai loại phẩm nhuộm, có màu khác nhau, ông ta nhận thấy vi khuẩn chia thành nhóm Nhóm thứ giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet (nhóm vi khuẩn gram dương) Nhóm thứ hai bị màu phẩm nhuộm sau rửa dung dịch tẩy màu tiếp tục nhuộm phẩm nhuộm thứ hai safranin hay carbon fuchsin (nhóm vi khuẩn gram âm) Dung dịch iodine dùng chất cẩn màu (mordant) (có nhiệm vụ gắn phẩmnhuộm lên/vào chất cách kết hợp với phẩm nhuộm để tạo phức không tan) sau lần nhuộm Cơ chế kỹ thuật nhuộm chưa hiểu cách tường tận Tuy nhiên, người ta cho có khác biệt thành phần hóa sinh thành tế bào vi khuẩn Thành tế bào vi khuẩn Gram dương có nhiều peptidoglycan (phức chất protein- đường) peptidoglycan liên kết chặt chẽ với từ giúp chotế bào kháng lại chất tẩy màu Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid nồng độ cao chúng hịa tan chất khử màu (alcohol,acetone,…) bị rửa trôi với crystal violet Nhuộm Gram số cơng cụ hữu dụng phịng thí nghiệm vi sinh sử dụng thường xuyên Phương pháp nhuộm Gram cải biên cách thay đổi nồng độ phẩm nhuộm, thời gian nhuộm thành phần chất tẩy màu Phương pháp cải biên Hucker, sử dụng thí nghiệm này, sử dụng rộng rãi Việc lựa chọn chất tẩy màu tùy thuộc vào thời gian mong muốn hoàn thành bước nhuộm Sử dụng ethyl alcohol 95%, dùng thí nghiệm này, cho phép sinh viên tập làm quen với chất tẩy màu có tác dụng chậm Acetone chất tẩy màu có tác dụng nhanh hỗn hợp (50:50) ethyl alcohol 95% acetone mức trung bình Hỗn hợp acetone-alcohol thường dùng phịng thí nghiệm Vật liệu hóa chất Dung dịch Crystal violet + g Crystal violet hòa tan 20 ml ethanol 95% + 0.8 g Ammoni oxalate hòa tan 80 ml nước cất + Trộn dung dịch lại với nhau, giữ 48 lọc Bảo quản lọ sẫm màu, sử dụng vài tháng Dung dịch Iodine Hòa tan g Iodine ~ ml nước cất, thêm 2g KI Khuấy cho tan hoàn toàn, thêm nước cất cho đủ 300 ml Bảo quản lọ sẫm màu Dung dịch tẩy màu + Ethanol 95% hỗn hợp gồm 70ml ethanol 95% 30 ml aceton 11 Dung dịch Safranin + Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2.5%, trước dùng pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 (v/v) để có dung dịch 0.5% Qui trình Sử dụng vi sinh vật sau để thí nghiệm - Staphylococcus sp - Bacillus subtilis - E coli Bước 1: Chuẩn bị vết bôi cố định vi sinh vật Bước 2: Dùng dung dịch crystal violet phủ lên vết bôi Để yên phút Bước 3: Để nghiêng phiến kính 45o, rửa vịi nước cho trơi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối chảy khỏi phiến kính khơng cịn màu) Bước 4: Phủ lên vết bôi dung dịch iodine Để yên phút Bước 5: Để nghiêng phiến kính 45o, tẩy màu dung dịch alcohol 95% giọt cuối chảy khỏi phiến kính khơng cịn màu (thông thường khoảng 10 – 20 giây) Đây bước quan trọng Nếu bị tẩy màu mức, số vi khuẩn Gram dương bị màu tím trở thành Gram âm sau nhuộm màu lần thứ Bước 6: Ngay rửa phiến kính vịi nước Bước 7: Phủ lên vết bôi dung dịch Safranin Để yên phút Bước 8: Rửa vòi nước Bước 9: Thấm nhẹ giấy thấm Hơ khơ phiến kính trước quan sát kính hiển Bước 10: Sử dụng dầu soi kính vật kính dầu để quan sát Lưu ý:  Ln dùng giống vi khuẩn “trẻ” số giống vi khuẩn Gram dương “già” khả giữ màu phức chất violet-iodine trở thành Gram âm quan sát  Vì vậy, nên sử dụng tế bào ni cấy vịng 24  Ngồi ra, có số chủng vi khuẩn Gram dương yếu  Các tế bào vi khuẩn Gram dương xuất dạng Gram âm, tế bào vi khuẩn Gram âm khơng xuất dương dạng Gram dương  Không làm vết bôi vi khuẩn dày Vết bôi dày địi hịi thời gian tẩy màu lâu vết bơi mỏng  Tẩy màu giọt dung dịch cuối chảy khỏi phiến kính khơng  Vi khuẩn Gram dương xuất dạng Gram âm khử màu ethanol 95% mức, cần đảm bảo thời gian rửa ethanol từ 10 – 20 giây 12  Một số sai sót khác là: (a) que cấy nóng, (b) hơ nóng mức cố định vi sinh vật phiến kính Hơ q nóng cố định vi khuẩn lên phiến kính làm vỡ tế bào, từ màu tế bào Gram (+) bị rửa trôi làm cho tế bào Gram (+) trở thành Gram (-)  Nếu vết bôi vi khuẩn dày, thuốc nhuộm thấm vào tế bào không đồng  Có thể thay Safranin thuốc nhuộm khác dễ phân biệt với màu tím  Dung dịch Iod bị phân hủy để lâu  Có sai lầm phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng vi khuẩn Gram âm, là: + Phết vi khuẩn lứa cấy già (trên 24h), cấu trúc vách vi khuẩn gram dương khơng cịn bền chặt lứa cấy trẻ, khả ngăn cản tẩy màu alcohol + Dung dịch Lugol khơng cịn tốt, pha lâu iod Trường hợp nhận biết dung dịch Lugol khơng cịn sậm màu + Tẩy màu Alcohol q lâu làm cho vi khuẩn Gram dương bị tẩy màu - Có sai lầm phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím vi khuẩn Gram dương, là: + Phết vi khuẩn dầy làm cho alcohol tẩy màu toàn vi khuẩn phết nhuộm + Tẩy màu Alcohol ngắn hay dung dịch Alcohol bị pha q lỗng làm cho màu Gram khơng tẩy khỏi tế bào vi khuẩn Đọc kết : Vi khuẩn Gram dương (Bacillus) bắt màu tím (do màu tím Crystal violet) cịn vi khuẩn Gram âm (E coli) bắt màu hồng (màu hồng Safranin) Giải thích tính bắt màu Gram vi khuẩn: - Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo peptidoglycan Chất có khả giữ phức hợp tím Crystal violet Trong đó, lớp vách tế bào peptidoglycan vi khuẩn Gram âm mỏng thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên Sau nhuộm với phức hợp Crystal violet, mẫu xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm nước lớp peptidoglycan vách tế bào Gram dương, từ làm giảm khoảng trống phân tử khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp Crystal violet bên tế bào Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trị chất hồ tan lipit làm tan màng vách tế bào Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10nm) giữ lại phức hợp Crystal violet tế bào Gram âm bị khử màu bắt màu thuốc nhuộm bổ sung 13 Hình 1: Nhuộm Bacillus Hình 2: Nhuộm E coli Hình 3: Nhuộm khuẩn khơng bắt màu 14 Hình 4: Nhuộm Staphylococcus sp Bài 6: NHUỘM BÀO TỬ Một số vi khuẩn (Clostridium botulinum, Bacillus subtilis…) có khả tạo bào tử (spore, endospore) Bào tử thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục hình thành bên tế bào vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển Vì tế bào sinh bào tử nên khơng phải loại bào tử có chức sinh sản nấm sợi Bào tử tạo thành mơi trường khơng thích hợp cho sinh trưởng phát triển, thiếu chất dinh dưỡng, độ ẩm thấp… Khi mơi trường trở nên thích hợp bào tử lại hồi sinh tế bào lại tiếp tục phân chia Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu Bào tử tồn môi trường thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, hóa chất mà tế bào sinh dưỡng khơng thể tồn Trong thời kỳ nghỉ không thấy bào tử vi khuẩn thể trao đổi chất nào, trạng thái sống ẩn (cryptobiosis) Chỉ có số chi vi khuẩn có khả sinh bào tử: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina (G+), Deusulfotomaculum (G-)… Bào tử khó nhuộm đa số thuốc nhuộm màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu chứa nhiều lipid Vì thế, cần thiết phải có phương pháp nhuộm đặc biệt bào tử Với phương pháp nào, tế bào phải xử lý nhiệt – acid để tế bào chất bào tử dễ bắt màu Sau nhuộm tế bào chất bào tử tế bào với thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh tẩy màu tế bào chất nhuộm với thuốc nhuộm phân biệt khác Khi đó, tế bào chất mang màu, bào tử mang màu khác Đôi bào tử nhìn thấy bên tế bào Hình thái tế bào kích thước bề ngang tế bào mang Bào tử thường nằm tế bào sinh dưỡng theo ba vị trí: + Nằm tâm tế bào: gọi bào tử kiểu Bacillus + Nằm lệch tâm: gọi bào tử kiểu Clostridium + Nếu nằm cực tế bào: gọi bào tử kiểu Plectidium + Các bào tử tồn tự do tế bào xung quanh tan rã Nhuộm phương pháp Carbolic Fuchsin Hóa chất Dung dịch A + 10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hòa ethanol (khoảng 10%) + 100 ml dung dịch acid carbolic (phenol 5% nước) + Trộn với (chuẩn bị trước dùng)Dung dịch B + 100 ml Ethanol 95% + ml HCl đậm đặc Dung dịch C + 30 ml Methylen blue bão hòa ethanol (khoảng 2%) + 100 ml dung dịch KOH 0.01% nước 15 + Trộn với nhau, để lâu tốt Qui trình nhuộm bào tử Bước 1: Làm vết bơi phiến kính Bước 2: Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nhẹ bên phiến kính để làm bay hơi, tránh để sơi Thêm thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ phút Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm Bước 3: Dùng dung dịch B rửa lại thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước Bước 4: Nhuộm lại dung dịch C ~ phút, rửa nước, thấm khơ Bước 5: Soi kính: dùng vật kính dầu x100 Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh Nhuộm phương pháp Malachite green (phương pháp Schaeffer-Fulton phương pháp Wirtz-Conklin) Hoá chất - Dung dịch Malachite green bão hòa (khoảng 7.6%) - Dung dịch Safranin 0.5% Qui trình nhuộm Bước 1: Làm vết bôi cố định tế bào nhiệt Bước 2: Đặt phiến kính lên cốc nước sơi Phiến kính đậy tờ giấy thấm có kích thước Bước 3: Tẩm ướt tờ giấy thấm dung dịch Malachite green Để yên 5~6 phút Đừng để tờ giấy thấm bị khơ Bước 4: Bóc tờ giấy thấm ra, phiến kính nguội hồn tồn Rửa phiến kính nước 30 giây Bước 5: Nhuộm với Safranin 90 giây Bước 6: Rửa phiến kính nước 30 giây Nhuộm bào tử Bacillus 16