Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR, điện di?Đoạn mồi có vai trò khởi động cho quá trình tổng hợp sợi mới khi enzyme DNA polymerase bám vào đầu 3’ tự do.dNTPs deoxynucleotide t
Câu hỏi -2 Vai trò thành phần phản ứng PCR, điện di? Đoạn mồi có vai trị khởi động cho q trình tổng hợp sợi enzyme DNA polymerase bám vào đầu 3’ tự dNTPs (deoxynucleotide triphosphates): cung cấp lương cho phản ứng từ liên kết phosphate giàu lượng Nồng độ dNTP sử dụng phản ứng tùy thuộc vào điều kiện phản ứng chung Enzyme DNA polymerase - Taq polymerase,: sử dụng tổng hợp mạch DNA bổ sung với mạch khuôn nhờ mồi Dung dịch đệm (buffer): có vai trị q trình tạo kết hợp chặt chẽ loại dNTP, kích thích vị trí hoạt động enzyme DNA polymerase Sản phẩm PCR tạo có đặc điểm sử dụng enzyme Taq polymerase? Sản phẩm DNA tổng hợp có đầu so le dư nu đầu 3’ va nu nu A Nhiệt độ bắt cặp primer tính nào? Nhiet bắt cặp Ta tính dựa theo nhiệt độ nóng chảy Tm Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) Ta = Tm - 4°C Câu hỏi Đặc điểm vector pJET 1.2 blunt? - Là vectơ nhân - Vector nối đầu - Có thể chèn đoạn gene mục tiêu cị kích thước từ bp đến 10 kb - Đầu 5' vectơ chứa nhóm photphoryl => khơng cần phải photphoryl hóa mồi PCR - Các DNA đầu nối trực tiếp vào vectơ phút Yêu cầu chuẩn bị đoạn DNA để nối vào vector pJET 1.2 blunt? - Đoạn gene mục tiêu phải có đầu - Kích thước nằm khoảng bp tới 10 bp Hiệu nối đoạn DNA vector phụ thuộc vào yếu tố nào? - Thời gian thực phản ứng - Kích thước đoạn DNA - Tỉ lệ lượng vector nối đoạn DNA Câu hỏi Yêu cầu mật độ vi khuẩn trước xử lý với CaCl2 Mật độ vi khuẩn phải có nồng độ OD 600 đạt khoảng 0,25 - 0,3 Tính khả nạp vi khuẩn phụ thuộc vào yếu tố nào? - Nồng độ vi khuẩn: mức OD 600 khoảng 0,25 - 0,3 - Nồng độ CaCl2 ( Ca 2+): Vi khuẩn DNA mang điện tích âm nên cần sử dụng ion Ca2+ câu nối để vi khuẩn bám vào mang điện tích đương => DNA dễ dàng tiếp cận Yêu cầu trữ vi khuẩn sau xử lý với CaCl2? Giữ vi khuẩn dạng dịch huyền phù ống Eppendorf trữ âm 80 độ C Câu hỏi Tại phải giữ tế bào đá 20 phút sau bổ sung sản phẩm nối? - giữ nhiệt ổn định tránh DNA hồi tính - Tạo lệch nhiệt để thuận lợi cho virv65 sốc nhiệt thời gian ngắn nhằm giúp DNA ngoại lai vào bên tế bào Tại lại tăng sinh dịch khuẩn sau biến nạp môi trường khơng có kháng sinh? Tăng sinh dịch khuẩn sau biến nạp mơi trường khơng có kháng sinh cấn có đủ thời gian để tế bào vi khuẩn tiến hành phiên mã dịch mã để hoạt hóa đoạn gen vừa chuyển vào Từ tạo hoạt chất mục tiêu mong muốn có, thiếu giai đoạn tế bào vi khuẩn chết giai đoạn đầu khơng hoạt hóa đoạn gen mục tiêu chuyển vào Tại lại ủ vi khuẩn mơi trường có kháng sinh? Tiến hành ủ vi khuẩn mơi trường có kháng sinh nhằm chọn lọc tế bào vi khuẩn nhận haot5 hóa đoạn gen mục tiêu chuyển vào đồng thời loại trừ tế bào vi khuẩn biến nạp không thành cơng khơng hoạt hóa đoạn gen mong muốn Câu hỏi Nguyên tắc PCR colony? Tế bào vi khuẩn gặp nhiệt độ cao bị phá vỡ màng phóng thích DNA bao gồm DNA plasmid DNA gene Khi đoạn DNA mục tiêu khuếch đại cặp mồi đặc hiệu kiểm tra thông qua điện di Ưu nhược điểm PCR colony? + Ưu: tốc độ nhanh, tỉ lệ xác cao + Nhược: - Trải qua nhiều giai đoạn: Giai đoạn 1: tạo tế bào vi khuẩn chứa gene mục tiêu Giai đoạn 2: Sàng lọc hệ thống xanh trắng Giai đoạn 3: Tiến hành PCR kiểm tra lại lần kết điện di để khẳng định diện đoạn DNA mục tiêu tạo dòng tế bào vi khuẩn Tế bào mục tiêu gặp nhiệt cao bị phá vỡ màng Lượng đối tượng mẫu cần quan sát lớn => tốn nhiều chi phí Yêu cầu sử dụng primer PCR colony? Lý tưởng đoạn mồi thiết kế để xác minh tích hợp cấu trúc cách tái tổ hợp đồng loại nên bao gồm đoạn mồi chống lại cấu trúc đoạn mồi chống lại gen liền kề với vị trí tích hợp mong muốn