Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR, điện di?Đoạn mồi có vai trò khởi động cho quá trình tổng hợp sợi mới khi enzyme DNA polymerase bám vào đầu 3’ tự do.dNTPs deoxynucleotide t
Trang 1Câu hỏi bài 1 -2
1 Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR, điện di?
Đoạn mồi có vai trò khởi động cho quá trình tổng hợp sợi mới khi enzyme DNA polymerase bám vào
đầu 3’ tự do
dNTPs (deoxynucleotide triphosphates): cung cấp năng lương cho phản ứng từ các liên kết
phosphate giàu năng lượng Nồng độ dNTP được sử dụng trong phản ứng tùy thuộc vào điều kiện phản ứng chung
Enzyme DNA polymerase - Taq polymerase,: sử dụng tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với mạch
khuôn nhờ các mồi
Dung dịch đệm (buffer): có vai trò trong quá trình tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các loại dNTP, kích
thích vị trí hoạt động của enzyme DNA polymerase
2 Sản phẩm PCR tạo ra có đặc điểm gì khi sử dụng enzyme Taq polymerase?
Sản phẩm DNA được tổng hợp có đầu so le do dư 1 nu ở đầu 3’ va nu đó là nu A
3 Nhiệt độ bắt cặp của primer được tính như thế nào?
Nhiet do bắt cặp Ta được tính dựa theo nhiệt độ nóng chảy Tm
Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)
Ta = Tm - 4°C
Câu hỏi bài 3
1 Đặc điểm của vector pJET 1.2 blunt?
- Là một vectơ nhân bản
- Vector nối đầu bằng
- Có thể chèn đoạn gene mục tiêu cò kích thước từ 6 bp đến 10 kb
- Đầu 5' của vectơ chứa các nhóm photphoryl => không cần phải photphoryl hóa mồi PCR
- Các DNA đầu bằng có thể được nối trực tiếp vào vectơ chỉ trong 5 phút
2 Yêu cầu chuẩn bị đoạn DNA để nối vào vector pJET 1.2 blunt?
- Đoạn gene mục tiêu phải có đầu bằng
- Kích thước nằm trong khoảng 6 bp tới 10 bp
3 Hiệu quả nối đoạn DNA và vector phụ thuộc vào các yếu tố nào?
- Thời gian thực hiện phản ứng
- Kích thước đoạn DNA
Trang 2- Tỉ lệ giữa lượng vector nối và đoạn DNA
Câu hỏi bài 4
1 Yêu cầu về mật độ vi khuẩn trước khi xử lý với CaCl2
Mật độ vi khuẩn phải có nồng độ OD 600 đạt khoảng 0,25 - 0,3
2 Tính khả nạp của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố nào?
- Nồng độ vi khuẩn: mức OD 600 khoảng 0,25 - 0,3
- Nồng độ CaCl2 ( Ca 2+): Vi khuẩn và DNA đều mang điện tích âm nên cần sử dụng ion Ca2+ như một câu nối để vi khuẩn bám vào và mang điện tích đương => DNA dễ dàng tiếp cận
3 Yêu cầu trữ vi khuẩn sau khi xử lý với CaCl2?
Giữ vi khuẩn ở dạng dịch huyền phù ở trong các ống Eppendorf và trữ ở âm 80 độ C
Câu hỏi bài 5
1 Tại sao phải giữ tế bào trên đá trong 20 phút sau khi bổ sung sản phẩm nối?
- giữ nhiệt đô ổn định tránh DNA hồi tính
- Tạo sự trên lệch nhiệt để thuận lợi cho virv65 sốc nhiệt trong thời gian ngắn nhằm giúp DNA ngoại lai vào bên trong tế bào
2 Tại sao lại tăng sinh dịch khuẩn sau biến nạp trên môi trường không có kháng sinh?
Tăng sinh dịch khuẩn sau biến nạp trên môi trường không có kháng sinh tại vì cấn có đủ thời gian để
tế bào vi khuẩn tiến hành phiên mã và dịch mã để hoạt hóa đoạn gen vừa được chuyển vào Từ đó tạo ra hoạt chất mục tiêu mong muốn có, nếu thiếu giai đoạn này tế bào vi khuẩn sẽ chết ngay giai đoạn đầu và không hoạt hóa được đoạn gen mục tiêu đã chuyển vào
3 Tại sao lại ủ vi khuẩn trên môi trường có kháng sinh?
Tiến hành ủ vi khuẩn trên môi trường có kháng sinh nhằm chọn lọc tế bào vi khuẩn đã nhận và haot5 hóa được đoạn gen mục tiêu chuyển vào đồng thời loại trừ các tế bào vi khuẩn biến nạp không thành công hoặc không hoạt hóa được đoạn gen mong muốn
Câu hỏi bài 6.
1 Nguyên tắc của PCR colony?
Tế bào vi khuẩn khi gặp nhiệt độ cao sẽ bị phá vỡ màng và phóng thích DNA bao gồm DNA plasmid
và DNA bộ gene Khi đó đoạn DNA mục tiêu sẽ được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu và được kiểm tra thông qua điện di
2 Ưu và nhược điểm của PCR colony?
+ Ưu: tốc độ nhanh, tỉ lệ chính xác cao
+ Nhược:
Trang 3- Trải qua nhiều giai đoạn:
Giai đoạn 1: tạo tế bào vi khuẩn chứa gene mục tiêu
Giai đoạn 2: Sàng lọc bằng hệ thống xanh trắng
Giai đoạn 3: Tiến hành PCR và kiểm tra lại lần 2 bằng kết quả điện di để khẳng định sự hiện diện của đoạn DNA mục tiêu được tạo dòng trong tế bào vi khuẩn
- Tế bào mục tiêu gặp nhiệt cao và bị phá vỡ màng
- Lượng đối tượng mẫu cần quan sát lớn => tốn nhiều chi phí
3 Yêu cầu sử dụng primer trong PCR colony?
Lý tưởng nhất là các đoạn mồi được thiết kế để xác minh sự tích hợp của một cấu trúc bằng cách tái
tổ hợp đồng loại nên bao gồm một đoạn mồi chống lại cấu trúc và một đoạn mồi chống lại bộ gen liền kề với vị trí tích hợp mong muốn