PHẦN 1: THIẾT KẾ PRIMERS VÀ KIỂM TRA ĐỘ TIN CẬY CỦA PRIMERS Câu hỏi: Thiết kế 3 cặp primers để phát hiện 3 loài vi khuẩn khác nhau có thể gây hư hỏng sản phẩm hoặc gây bệnh cho người. Mỗi loài vi khuẩn 1 cặp. 1. Salmonella enterica (Gây sốt thương hàn) 1 2. Escherichia coli O104:H4 (Sản sinh độc tố Shiga gây đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, sốt nhẹ…) 2 3. Shigella dysenteriae (Dịch bệnh lỵ) 3 Phần 1: Trình bày chi tiết cách làm. Bước 1: Truy cập vào đường dẫn https:www.ncbi.nlm.nih.gov và chọn tài nguyên tìm kiếm là “Nucleotide”. Bước 2: Tiến hành tìm kiếm tên vi sinh vật mong muốn thêm vào “16S rRNA” ở phía trước tên loài VSV đó. Vì để phát hiện sự hiện diện của 1 loài VSV bất kỳ, ta thường trích ly và tìm trên đoạn gene 16S rRNA của chúng.
THIẾT KẾ PRIMERS VÀ KIỂM TRA ĐỘ TIN CẬY CỦA PRIMERS
Câu hỏi: Thiết kế 3 cặp primers để phát hiện 3 loài vi khuẩn khác nhau có thể gây hư hỏng sản phẩm hoặc gây bệnh cho người Mỗi loài vi khuẩn 1 cặp.
1 Salmonella enterica (Gây sốt thương hàn) [ CITATION Pri09 \l 1033 ]
2 Escherichia coli O104:H4 (Sản sinh độc tố Shiga gây đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, sốt nhẹ…) [ CITATION Cen23 \l 1033 ]
3 Shigella dysenteriae (Dịch bệnh lỵ) [ CITATION Ini06 \l 1033 ]
Phần 1: Trình bày chi tiết cách làm.
Bước 1: Truy cập vào đường dẫn https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ và chọn tài nguyên tìm kiếm là “Nucleotide”.
Bước 2: Tiến hành tìm kiếm tên vi sinh vật mong muốn thêm vào “16S rRNA” ở phía trước tên loài VSV đó Vì để phát hiện sự hiện diện của 1 loài VSV bất kỳ, ta thường trích
Bước 3: Sau khi nhấn “Search”, ta sẽ tiến hành tìm kiếm kết quả phù hợp nhất.
Bước 4: Click vào kết quả mong muốn Sau khi click vào kết quả mong muốn, chúng ta sẽ được chuyển đến trang có những thông tin cần thiết về chuỗi nucleotide của vi sinh vật.
Bước 5: Tại trang chi tiết này, chọn tab "Primer-BLAST" ở phía trên cùng bên phải của trang.
Bước 6: Ta sẽ được chuyển sang trang như bên dưới Nhập các thông tin cần thiết để tìm kiếm primer như: chiều dài của primer, độ nhạy của primer, số lượng primer cần tìm, và các thông số khác.
Bước 7: Ta sẽ đổi mục Organism (Loài) thành “Homo sapiens”
- Phần 2: Giải thích từng chức năng của các công cụ
Công cụ: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Ở đầu trang sẽ có hộp tìm kiếm, chúng ta sẽ tìm kiếm các gen hoặc protein của một loài cụ thể nào đó ở mục này. Ở bên trái hộp tìm kiếm là một menu thả xuống với danh sách của tất cả cơ sở dữ liệu tìm kiếm Tùy thuộc vào thứ chúng ta muốn tìm kiếm thì sẽ chọn vào mục cần tìm. Ở phía bên trái của trang web, bạn sẽ tìm thấy danh sách chi tiết các tài nguyên mà bạn được quyền truy cập. Ở bên phải, một số tài nguyên phổ biến nhất được liệt kê: Ở trung tâm của trang web:
“Submit”: Chúng ta có thể gửi thông tin vào cơ sở dữ liệu của NCBI.
“Download”: Chúng ta có thể tải dữ liệu từ NCBI về máy tính.
“Learn”: Mục này chứa các tài liệu hướng dẫn sử dụng, lớp học, hội thảo hướng dẫn cho chúng ta cách sử dụng hiệu quả các chức năng của trang web NCBI.
“Research”: Mục này chứa các dự án nghiên cứu của NCBI để chúng ta có thể khám phá.
“Analyze”: Mục này chứa các công cụ phân tích số liệu như
Amino Acid Explorer: Khám phá các đặc tính, sự thay thế và chức năng của axit amin. COBALT: Thực hiện sắp xếp nhiều chuỗi protein.
CDTree: Phân loại trình tự protein và điều tra các mối quan hệ tiến hóa của chúng
“Develop”: Mục này chứa các thư viện, tài nguyên, dữ liệu dành cho các kỹ sư lập trình.
“NCBI NEW & BLOG”: Mục này sẽ chứa đựng những thông tin và những cập nhật mới nhất của NCBI.
Công cụ thiết kế mồi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi Đầu tiên chúng ta sẽ có 2 lựa chọn tùy vào nhu cầu tìm kiếm của chúng ta:
“Primers for target on one template”: Thiết kế mồi cho mục tiêu trên một mẫu.
“Primers common for a group of sequence”: Thiết kế mồi chung cho một nhóm trình tự.
Tất cả các chấm hỏi màu xanh trong hình đều có chức năng là chỉ dẫn và hướng dẫn chúng ta Khi click vào, chúng sẽ đưa ra gợi ý để chúng ta có thể nhập liệu và thiết kế primer mong muốn.
Nút “clear”: có tác dụng xóa toàn bộ nội dung trong hộp chỉ bằng một cú click.
“Retrieve recent results”: Ở mục này chúng ta có thể tiến hành truy xuất lại những kết quả thiết kế primer gần đây bằng “job id” của chúng.
“Publication”: Mục này chứa tài liệu viết về cách sử dụng của công cụ thiết kế primer
“Tips for fiding specific primers”: Mục này chứa những mẹo để có thể thiết kế primer cụ thể.
Sau khi nhập các thông số tìm kiếm chúng ta có thể nhấn “Get primers” để công cụ bắt đầu thiết kế primer.
Nếu chúng ta có các thông số nâng cao, tiến hành click vào “Advanced parameters” để mở các ô nhập thông số nâng cao.
Thông tin cặp primers của Salmonella enterica
(Trình tự 5’ -> 3’) Forward primer: Reverse primer:
Thúc) 375-394 969-950 Độ dài sản phẩm 595 Độ dài mồi 20 20
Thông tin cặp primers của Escherichia coli O104:H4
(Trình tự 5’ -> 3’) Forward primer: Reverse primer:
Thúc) 240-259 740-721 Độ dài sản phẩm 501 Độ dài mồi 20 20
Thông tin cặp primers của Shigella dysenteriae
(Trình tự 5’ -> 3’) Forward primer: Reverse primer:
247-266 762-743 Độ dài sản phẩm 516 Độ dài mồi 20 20
- Phần 4: Trả lời các câu hỏi bên dưới
4.1 Nhiệt độ tan chảy (melting temperature – Tm) tối ưu của các đoạn mồi chạy PCR là bao nhiêu? Làm sao tăng hay giảm Tm?
Melting temperature (Tm) được định nghĩa là nhiệt độ tại đó 50% DNA sợi kép được biến đổi thành DNA tiêu chuẩn đơn [ CITATION Her19 \l 1033 ]
Tm cũng được hiểu là nhiệt độ nơi mà nửa đường cong trong đồ thị độ hấp thu UV của DNA (hoặc RNA) tăng lên 50% [ CITATION Sil15 \l 1033 ]
Melting temperature (Tm) tối ưu của các đoạn mồi chạy PCR thường nằm trong khoảng từ 50 đến 65 độ C, tránh trên 65 độ C vì có thể gây ra khả năng ủ thứ cấp [ CITATION Nor23 \l 1033 ] Để có thể tăng giảm Tm ta sẽ:
1 Tăng hoặc giảm nồng độ muối trong phản ứng PCR: Muối như KCl hay NaCl có thể giúp tạo ra các tương tác ion giữa các nucleotide của đoạn mồi, giúp tăng Tm [CITATION Owc13 \l 1033 ]
2 Tăng hoặc giảm độ dài của đoạn mồi, Tm=4×(G+C)+2×(A+T), nhìn vào công thức tính Tm ta có thể thấy tỉ lệ thuận giữa Tm và các nucleotide vậy nên để tăng giảm Tm ta cần tăng giảm chiều dài của đoạn mồi [ CITATION Vin01 \l 1033 ] độ phá vỡ liên kết cao hơn, do nó cần nhiều năng lượng hơn để phá vỡ các liên kết hidro mạnh hơn giữa các cặp G-C mà GC% là tỷ lệ phần trăm của các cặp nucleotide Guanine và Cytosine trong một chuỗi nucleotide vậy ta có thể tăm giảm Tm bằng cách thiết kế các đoạn mồi có GC% cao hoặc thấp.[ CITATION Nor23 \l 1033 ]
4.2 Ngoài chỉ số Tm thì khi chọn đoạn mồi chúng ta cần phải chú ý tới thông tin nào? Và ý nghĩa của thông tin đó là gì?
1 Độ dài của primer: Độ dài của primer tốt nhất là trong khoảng 18-25 nucleotide Đoạn mồi càng ngắn thì chúng sẽ liên kết hoặc ủ với mục tiêu càng hiệu quả Các đoạn mồi ngắn có thể có xu hướng tìm thấy một trình tự tương tự làm giảm tính đặc hiệu của nó. Các đoạn mồi dài có thể có xu hướng hình thành nhiều liên kết hydro hơn, gây khó khăn cho việc biến tính và ủ trong các chu kỳ PCR.[ CITATION Nor23 \l 1033 ]
2 Cố gắng tránh các vùng có cấu trúc thứ cấp và có sự phân bố cân bằng giữa các miền giàu GC và giàu AT Tránh tương đồng nội mồi (hơn 3 bazơ bổ sung trong mồi) hoặc tương đồng giữa các mồi (mồi xuôi và ngược có trình tự bổ sung) Tránh chạy 4 lần trở lên của một bazơ hoặc lặp lại dinucleotide (ví dụ: ACCCC hoặc ATATATAT).[ CITATION Nor23 \l 1033 ]
3 GC%: hàm lượng GC nên nằm trong khoảng từ 40 đến 60% với đầu 3’ của mồi nên kết thúc bằng G hoặc C để thúc đẩy sự liên kết Đây được gọi là “Clamp GC” Các bazơ G và
C có liên kết hydro mạnh hơn và giúp ổn định primer Chú ý không nên có quá nhiều G hoặc C lặp lại, vì điều này có thể gây ra sự hình thành primer-dimer (Sản phẩm bất lợi làm giảm độ nhạy và chính xác của phản ứng PCR).[ CITATION Nor23 \l 1033 ]
THỰC HÀNH TRÍCH LY DNA Ở VI KHUẨN
Sử dụng mô hình thực tế ảo từ website: https://www.biointeractive.org/classroom-resources/bacterial-identification-virtual-lab
Mô tả cụ thể 3 bước đầu tiên trong quy trình:
(1) Chuẩn bị mẫu – Trích ly DNA
Bước 1: Đeo bao tay cao su.
Bước 2: Lấy mẫu từ đĩa nuôi cấy.
Bước 3: Dùng que cấy vòng để lấy một trong các khuẩn lạc trong đĩa.
Bước 4: Chuyển khuẩn lạc từ que cấy vòng vào ống Microcentrifuge Tube (ống ly tâm).
Bước 5: Dùng micropipet thêm digestive buffer vào ống ly tâm Sau đó sẽ vứt bỏ đầu hút vào thùng rác.
Bước 6: Đậy nắp ống ly tâm và ủ trong 3h.
Bước 7: Sau khi ủ chúng ta tiến hành vô hiệu hóa enzyme bằng bể điều nhiệt Bỏ ống ly tâm vào bể và đậy nắp bể.
Bước 8: Lấy ống ly tâm từ trong bể ra và cho vào máy ly tâm, để một ống
“Counterbalance” vào phía đối diện ống mẫu để làm cân bằng.
Bước 10: Lấy ống ly tâm ra khỏi máy Lúc này phần cặn không mong muốn đã lắng dưới đáy ống ly tâm, DNA mong muốn nổi phía trên.
Bước 11: Hút dịch từ ống ly tâm cho vào ống PCR màu đỏ
Bước 1: Dùng pipet hút PCR master mix vào cả 3 ống PCR (xanh - đỏ - xanh dương).
Bước 2: Dùng pipet hút dung dịch DNA đối chứng dương cho vào ống màu xanh lá.
Bước 3: Dùng pipet hút nước khử ion để làm ống đối chứng âm.
Bước 4: Mở máy PCR cho 3 ống PCR vào máy Và cho máy hoạt động theo yêu cầu sau: Điều khiển nhiệt độ được thiết lập như sau:
- Bước ủ ban đầu: 95°C trong 10 phút
- 30 chu kỳ của trình tự các bước sau:
- Bước kéo dài cuối cùng: 72°C 10 phút
Bước 5: Sau khi chạy PCR xong lấy cả 3 ống PCR ra Để tiến thành quá trình tinh sạch
(3) Tinh sạch PCR – PCR Purification
Bước 1: Sau khi chèn cột vi cô đặc (microconcentrater column) vào ống thu thập Dùng pipet hỳt 400 àL Buffer Solution vào ống thu thập chứa cột vi cụ đặc Sau đú bỏ đầu pipet vào thùng rác.
Bước 2: Hỳt sản phẩm PCR (~100 àL ) từ ống đỏ sang cột vi cụ đặc Sau đú đúng nắp và bỏ đầu hút vào thùng chứa nguy hiểm sinh học.
Bước 3: 3 Ống PCR được bảo quản lạnh
Bước 4: Microconcentrater column được đặt vào máy ly tâm cùng với Counterbalance
Và tiến hành ly tâm tốc độ 3.000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 5: Sau khi ly tâm xong Đổi cột (thao tác đảo ngược) sang một ống mới.
Bước 6: Dựng micropipet hỳt 50 àL buffer solution cho vào ống cú cột đó đảo ngược và
Bước 7: Dùng ống chứa cột đảo ngược cho vào máy ly tâm cùng với counterbalance Ly với tốc độ 3.000 vòng/phút tâm trong 2p
Bước 8: Sau khi ly tâm xong chúng ta tiến hành bỏ cột vào thùng hiểm họa sinh học và giữ lại ống chứa.
So sánh cụ thể các bước làm với bộ kit trích ly trong phòng LAB sau đó.
(1) Chuẩn bị mẫu – Trích ly DNA (1) Chuẩn bị mẫu – Trích ly DNA
Bước 1: Đeo bao tay cao su Bước 1: Cân 25g mẫu lá lốt
Bước 2: Cắt nhỏ mẫu lá lốt và mang
225ml BPW mang đi tiệt trùng
Bước 3: Để môi trường BPW nguội rồi cho 25g mẫu đã cắt nhỏ vào mẫu
Bước 4: Mang bình đi ủ ở 37 độ C trong
Bước 2: Lấy mẫu từ đĩa nuôi cấy.
Bước 3: Dùng que cấy vòng để lấy một trong các khuẩn lạc trong đĩa.
(2) Sử dụng bộ KIT để ly trích DNA Bước 4: Chuyển khuẩn lạc từ que cấy vòng vào ống Microcentrifuge Tube (ống ly tâm).
Bước 1: Hút 1ml mẫu vào ống Eppendorf
Bước 2: Ly tâm 13000rpm trong 5p Bước 3: Bỏ phần lỏng
Bước 5: Dùng micropipet thêm digestive buffer vào ống ly tâm Sau đó sẽ vứt bỏ đầu hút vào thùng rác.
Bước 4: Thêm vào ống 200μl PBS Buffer và 20 μ l Proteinase K
Bước 6: Đậy nắp ống ly tâm và ủ trong 3h.
Bước 7: Sau khi ủ chúng ta tiến hành vô hiệu hóa enzyme bằng bể điều nhiệt Bỏ ống ly tâm vào bể và đậy nắp bể.
Bước 8: Lấy ống ly tâm từ trong bể ra và cho vào máy ly tâm, để một ống
“Counterbalance” vào phía đối diện ống mẫu để làm cân bằng.
Bước 9: Đóng nắp máy ly tâm Và chờ cho đến khi quá trình ly tâm được thực hiện xong.
Bước 10: Lấy ống ly tâm ra khỏi máy Lúc này phần cặn không mong muốn đã lắng dưới đáy ống ly tâm, DNA mong muốn nổi phía trên.
Bước 11: Hút dịch từ ống ly tâm cho vào ống PCR màu đỏ
Bước 1: Dùng pipet hút PCR master mix vào cả 3 ống PCR (xanh - đỏ - xanh dương).
Bước 2: Dùng pipet hút dung dịch DNA đối chứng dương cho vào ống màu xanh lá.
Bước 3: Dùng pipet hút nước khử ion để làm ống đối chứng âm.
Bước 4: Mở máy PCR cho 3 ống PCR vào máy Và cho máy hoạt động.
Bước 5: Sau khi chạy PCR xong lấy cả 3 ống PCR ra Để tiến thành quá trình tinh sạch PCR.
(3) Tinh sạch PCR – PCR Purification
Bước 1: Sau khi chèn cột vi cô đặc
(microconcentrater column) vào ống thu thập Dựng pipet hỳt 400 àL Buffer Solution vào ống thu thập chứa cột vi cô đặc Sau đó bỏ đầu pipet vào thùng rác.
Bước 9: Hút dịch từ ống Eppendorf sang ống Silica (Eppendorf 2ml + cột Silica)
Bước 10: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 11: Bỏ chất lỏng
Bước 13: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 14: Giữ cột và bỏ chất lỏng.
Bước 16: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 17: Giữ cột và bỏ chất lỏng.
Bước 18: Ly tâm 13000rpm trong 1p
Bước 2: Hỳt sản phẩm PCR (~100 àL ) từ ống đỏ sang cột vi cô đặc Sau đó đóng nắp và bỏ đầu hút vào thùng chứa nguy hiểm sinh học.
Bước 3: 3 Ống PCR được bảo quản lạnh.
Bước 4: Microconcentrater column được đặt vào máy ly tâm cùng với Counterbalance
Và tiến hành ly tâm trong 15 phút
Bước 5: Sau khi ly tâm xong Đổi cột (thao tác đảo ngược) sang một ống mới.
Bước 19: Chuyển cột Silica sang ống
Bước 6: Dựng micropipet hỳt 50 àL Buffer solution cho vào ống có cột đã đảo ngược và đậy nắp Sau đó bỏ đầu hút và ống cũ chứa cột vào thùng mối nguy sinh học.
Bước 7: Dùng ống chứa cột đảo ngược cho Bước 22: Ly tâm 13000rpm trong 1p hành bỏ cột vào thùng hiểm họa sinh học và giữ lại ống chứa.
CHẠY ĐIỆN DI
Analyse PCR products by agarose gel electrophoresis and submit samples for PCR product purification and DNA sequencing
- Take 10μl of the PCR reaction mix and add to 2μl of 6x loading dye.l of the PCR reaction mix and add to 2μl of the PCR reaction mix and add to 2μl of 6x loading dye.l of 6x loading dye.
Loading dye (6x concentrated stock) consists of 30% glycerol with 0.25% bromophenol blue (i.e., 25mg bromophenol blue in 10ml of 30% glycerol)
The glycerol makes the samples denser than the running buffer (so that they sink into the well) and the bromophenol blue is a tracking dye which allows monitoring of the movement of DNA through the gel
- Load the samples into the wells of a 1% agarose gel alongside DNA molecular weight markers to provide an estimate of size
- Apply voltage to the gel at 100V and run for around 1 hour
- Turn off the power supply and remove gel from the tank
- Place gel in the gel doc and take a photograph of the DNA bands We use SYBR safe as choice of stain (therefore ethidium bromide staining isn’t required), which is premixed into the agarose gel (post staining isn’t required).
- Analyse the gel and determine suitable samples which can be purified and sequenced.
1 Dịch nội dung về cách thực hiện phương pháp chạy điện di bên trên ra tiếng việt.
Mô tả về phương pháp điện di agarose: Phân tích các sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di agarose và gửi mẫu để làm sạch sản phẩm PCR và xác định trình tự DNA.
1 Lấy 10μl of the PCR reaction mix and add to 2μl of 6x loading dye.l hỗn hợp phản ứng PCR và thêm vào 2μl of the PCR reaction mix and add to 2μl of 6x loading dye.l dung môi tải mẫu 6x Dung môi tải mẫu (nồng độ 6x) bao gồm 30% glycerol và 0,25% bromophenol blue (tức là, 25mg bromophenol blue trong 10ml glycerol 30%) Glycerol làm cho mẫu trở nên dày hơn so với dung dịch chạy (để chúng chìm vào giếng) và bromophenol blue là chất theo dõi cho phép theo dõi sự di chuyển của DNA qua gel.
2 Đưa các mẫu vào giếng của gel agarose 1% kèm theo các chỉ thị trọng lượng phân tử DNA để đưa ra ước tính về kích thước.
3 Áp dụng điện thế vào gel ở mức 100V và chạy khoảng 1 giờ.
4 Tắt nguồn điện và lấy gel ra khỏi bể.
5 Đặt gel vào thiết bị chụp hình và chụp ảnh các dải DNA Chúng tôi sử dụng SYBR Safe để nhuộm gel (do đó không cần tẩy etidium bromide), có sẵn trong gel agarose (không cần tẩy sau khi nhuộm).
6 Phân tích gel và xác định các mẫu thích hợp để làm sạch và xác định trình tự.
2 Trả lời các câu hỏi sau: a Sẽ ra sao nếu chúng ta sử dụng hiệu điện thế quá lớn hay thời gian điện di quá lâu?
Nếu sử dụng hiệu điện thế quá lớn hoặc thời gian điện di quá lâu, có thể gây ra sự giảm độ phân giải của kích thước DNA và sự mất mát của DNA nhỏ hơn Ngoài ra, nếu điện di quá lâu, các mẫu DNA có thể bị phá hủy hoặc di chuyển quá xa trong gel.[ CITATION Joh88 \ l 1033 ] b Yếu tố nào quyết định thời gian điện di?
Thời gian điện di phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước của gel, nồng độ agarose, loại buffer, điện áp và trở kháng.[ CITATION Joh88 \l 1033 ] c Các thuốc nhuộm nào được sử dụng để nhuộm: (1) DNA và (2) Gel trong chạy điện di?
(1) Để nhuộm DNA, các chất nhuộm thông dụng là Ethidium Bromide (EtBr) và SYBR Green EtBr là chất nhuộm phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm vì nó rẻ và đơn giản để sử dụng Tuy nhiên, EtBr là một chất gây đột biến và gây ung thư, do đó, nhiều phòng thí nghiệm chuyển sang sử dụng SYBR Green tuy nó đắt hơn nhưng ít độc hại hơn.[ CITATION The20 \l 1033 ]
(2) Để nhuộm Gel trong chạy điện di, các chất nhuộm phổ biến nhất là Bromophenol Blue và Xylene Cyanol [ CITATION Ray14 \l 1033 ]
ĐỊNH DANH VSV
Go to the website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi ) and click on “nucleotide BLAST” Cut and paste your DNA sequence in the “Enter query sequence” box and under the “Choose search set” section click on the “Others (nr etc.)” dot (the other dots are for searching against human DNA or mouse DNA sequence databases only) Then click on the light blue “BLAST” button at the bottom of the page to start the search When your results are processed scroll down the page to find the most similar sequence Click on the “accession number” of the most similar sequence to find out more details about its origin.
Exercise 1 Identification of food microbes through DNA sequencing.
You have been given a research project to identify microbes present in cheeses from a variety of manufacturers including specialty cheese companies You have tested some cheese for standard plate count using several different non-selective agars and isolate 4 different colony types You perform Gram-stains on the bacteria and find that there are 2 Gram-positive cocci and 2 Gram-positive rods At this point you decide that obtaining some DNA sequence from the bacteria would be a definitive way to identify the genus and species of the organism You chose to determine the sequence of the 16s ribosomal RNA gene since it is a standard method for identification The sequences of the 4 bacteria are:
>Bacteria1 cttgcaccatttgaagagcagcgaacgggtgagtaacgcgtgg ggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataacaac tttaaacataagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgt tgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgag agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta gggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtt ttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaa gtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgtgcc
>Bacteria2 gattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa cctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaaga accgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcg tattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagag gttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagg gaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggcttt cgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtg acggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgcc
>Bacteria3 agtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggt gcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgaga gactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtag ggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctt tcgggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagttt gacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgcc
>Bacteria4. aagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcag ctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgattttagttgc cagcatttagttgggcactctaaagtgactgccggtgcaagccggaggaaggtggggatg acgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatagtaca aagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggattgt aggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacg gtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacc cgaagtcggtagggtaacctttatggagccagccgccgaaggtgggacagataattggggtgaagtcgtaa
1 Dịch thông tin hướng dẫn bên trên sang tiếng việt.
Hãy truy cập vào trang web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) và nhấp vào
"nucleotide BLAST" Sau đó, sao chép và dán đoạn mã DNA của bạn vào ô "Enter query sequence" và dưới mục "Choose search set", nhấp vào chấm "Others (nr etc.)" (các chấm khác là để tìm kiếm chỉ đối với các cơ sở dữ liệu chuỗi DNA của con người hoặc chuột) Sau đó, nhấp vào nút "BLAST" màu xanh nhạt ở dưới cùng trang để bắt đầu tìm kiếm Khi kết quả của bạn được xử lý, cuộn xuống trang để tìm chuỗi tương tự nhất Nhấp vào
"accession number" của chuỗi tương tự nhất để tìm hiểu thêm chi tiết về nguồn gốc của nó.
BÀI TẬP THỰC HÀNH Bài tập 1 Xác định vi khuẩn trong thực phẩm thông qua việc xây dựng chuỗi DNA Bạn được giao một dự án nghiên cứu để xác định vi khuẩn có mặt trong pho mát từ nhiều nhà sản xuất bao gồm các công ty sản xuất pho mát đặc biệt Bạn đã kiểm tra một số loại pho mát cho chỉ số bảng chuẩn bằng một số loại agar không lựa chọn và thu được 4 loại vi khuẩn khác nhau Bạn thực hiện phản ứng Gram trên vi khuẩn và tìm thấy rằng có 2 loại cầu Gram dương và 2 loại que Gram dương Ở điểm này, bạn quyết định lấy một số đoạn mã DNA từ vi khuẩn để xác định chi và loài của vi sinh vật Bạn quyết định xác định chuỗi của gene ribonucleic acid (RNA) 16s ribosomal vì đây là một phương pháp tiêu chuẩn cho việc xác định Các đoạn mã của 4 loại vi khuẩn là:
>Vi khuẩn 1 cttgcaccatttgaagagcagcgaacgggtgagtaacgcgtgg ggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataacaac tttaaacataagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgt tgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgag agggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta gggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggtt ttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaa
>Vi khuẩn 2 gattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa cctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaaga accgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcg tattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagag gttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagg gaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggcttt cgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtg acggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgcc
>Vi khuẩn 3 gaaaggtgcttgcacctttcaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgga caacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaactt agtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggt gcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgaga gactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtag ggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctt tcgggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagttt gacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgcc
>Vi khuẩn 4. aagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcag ctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgattttagttgc cagcatttagttgggcactctaaagtgactgccggtgcaagccggaggaaggtggggatg acgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatagtaca aagggtcgcgaagccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggattgt aggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgtggatcagcatgccacg gtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacc cgaagtcggtagggtaacctttatggagccagccgccgaaggtgggacagataattggggtgaagtcgtaa
2 Trả lời các câu hỏi sau: i Theo kết quả định danh trên BLAST, 4 loài Vi khuẩn kia là?
4 Listeria monocytogenes ii Kết quả % cao nhất mô tả sự giống nhau giữa đoạn DNA và loài VSV tìm ra được là bao nhiêu?
3 Leuconostoc mesenteroides: 100% iii Các loài vi khuẩn tìm ra được theo phần trăm cao nhất này thường hiện diện ở loại sản phẩm nào?
1 Lactococcus cremoris: thường được sử dụng trong quá trình lên men sản xuất sữa chua và nhiều loại sản phẩm sữa chua khác Vậy nên chúng thường hiện diện ở sữa chua.
2 Lacticaseibacillus paracasei: Chúng thường có thể tìm thấy trong nhiều sản phẩm sữa chua, nước giải khát [ CITATION Orl12 \l 1033 ]
3 Leuconostoc mesenteroides: thường được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm lên men như váng sữa, dưa chua, sữa chua…[ CITATION Dol97 \l 1033 ]
4 Listeria monocytogenes: thường được tìm thấy trong sản phẩm như sữa, rau hỏng…
[ CITATION CỤC15 \l 1033 ] iv Nếu kết quả định danh của bạn chỉ có 50% mức độ giống với 1 loài nào đó thì có đang tin cậy không? Tại sao?
Mức độ giống nhau 50% trong kết quả định danh của một mẫu với một loài vi khuẩn cụ thể thì không đáng tin cậy Mức độ giống nhau trong phân tích chuỗi DNA được sử dụng để xác định loài vi khuẩn là từ 97% trở lên hoặc 99% trở lên [ CITATION Rel07 \l 1033 ]
Mức độ giống nhau 50% có thể chỉ ra rằng mẫu có sự tương đồng về DNA với nhiều loài vi khuẩn, và cần phải tiếp tục phân tích và xác định các yếu tố khác như đặc điểm sinh học và hóa học để có thể xác định loài vi khuẩn một cách chính xác.
THỰC HÀNH TRÍCH LY DNA Ở VI KHUẨN BẰNG TopPURE®
TopPURE® GENOMIC DNA EXTRACTION KIT
I Giới thiệu về bộ KIT
Bộ kit được thiết kế dùng cho tách chiết đa dạng mẫu đầu vào, bao gồm: mẫu mô động vật, vi khuẩn hoặc tế bào nuôi cấy, huyễn dịch (huyền phù), mẫu quét bề mặt, mẫu dịch phết (y tế), virus từ mẫu mô và các mẫu sinh thiết dễ nghiền Kết quả thu nhận nucleic acid tinh sạch có thể được ứng dụng trong các thí nghiệm: Real-time PCR, giải trình tự, Southern blot, SNP.
- Mẫu đầu vào: mẫu mô động vật, vi khuẩn, huyễn dịch (huyền phù), mẫu quét bề mặt, mẫu dịch phết (y tế).
- Lượng mẫu đầu vào: 2g mẫu mụ; 1mL tế bào nuụi cấy; 200àL mẫu dịch.
- Điều kiện lưu trữ: Nhiệt độ phòng (riêng Proteinase K lưu trữ ở 2-8 o C).
- Hạn sử dụng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất
3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.
- Hộp chứa các đầu tip micro-pippet.
3.2 Môi trường và hóa chất
- Các hoát chất trong bộ TopPURE® GENOMIC DNA EXTRACTION KIT
II Quy trình thực hiện
Bước 1: Cân 25g mẫu lá lốt
Bước 2: Cắt nhỏ mẫu lá lốt và mang 225ml BPW mang đi tiệt trùng
Hình ảnh 2: Lá lốt đã được cắt nhỏHình ảnh 1: Lá lốt tươi
Hình ảnh 3: Hỗn hợp giữa lá lốt và BPW
Bước 4: Mang bình đi ủ ở 37 độ C trong 48h.
Bước 1: Hút 1ml mẫu vào ống
Bước 2: Ly tâm 13000rpm trong 5p
Bước 4: Thêm vào ống 200 μ l PBS
Bước 6: Dùng máy Vortex để đồng nhất dung dịch
Bước 9: Hút dịch từ ống Eppendorf sang ống Silica (Eppendorf 2ml + cột Silica)
Bước 10: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 11: Bỏ chất lỏng
Bước 13: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 14: Giữ cột và bỏ chất lỏng.
Bước 16: Ly tâm 13000rpm trong 1p
Bước 17: Giữ cột và bỏ chất lỏng.
Bước 18: Ly tâm 13000rpm trong 1p
Bước 19: Chuyển cột Silica sang ống
Bước 21: Ủ 1p ở nhiệt độ phòng Bước 22: Ly tâm 13000rpm trong 1p Bước 23: Giữ dịch, bỏ ống Silica Bước 24: Quan sát DNA
3 Thành phẩm sau khi ly trích
DNA thu được sẽ được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ -20℃.
4 Sơ đồ quy trình ly trích DNA bằng bộ KIT.
Hình ảnh 4: Ống ly tâm chứaDNA đã ly trích.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hút 1 ml mẫu vào ống Eppendorf
Hút dịch từ ống Eppendorf sang ống Silica.
Chuyển cột Silica sang ống 1.5 mới. Ủ 1p ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 13000rpm trong 1p Ống chứa DNA
[1] Prior, K and Hautefort, I and Hinton, JCD and Richardson, DJ and Rowley, G, "All stressed out Salmonella pathogenesis and reactive nitrogen species," Advances in microbial physiology, vol 56, pp 1-28, 2009
[2] Centers for Disease Control and Prevention, "E coli (Escherichia coli)," [Online] Available: https:// www.cdc.gov/ecoli/general/index.html [Accessed 14 5 2023].
[3] Initiative for Vaccine Research of the Department of Immunization, Vaccines and Biologicals,
"State of the art of new vaccine research and development," World Health Organization, 2006.
[4] Hershell, George., " Re: Melting temperature (Tm) value meaning.," 2019 [Online] Available: https://www.researchgate.net/post/Melting_temperature_Tm_value_meaning/
5d4aa3ff4921eea4c604dea3/citation/download.
[5] Silvia Fontenete, Nuno M Guimaraes, Jesper Wengel and Nuno F Azevedo, "Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models,"
Critical Reviews in Biotechnology, vol 36, no 3, 2015
[6] Nora Aljebrin – Emtenan Alkhudair, "Designing PCR Primers using Primer3, UCSC in-Silico PCR and primer-BLAST," [Online] Available: https://faculty.ksu.edu.sa/sites/default/files/4_lab- manual_.pdf [Accessed 14 05 2023].
[7] Richard Owczarzy, "Understanding melting temperature (Tm)," Integrated DNA Technologies, Inc.,
21 10 2013 [Online] Available: https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/understanding-melting-temperature-(t-sub-m- sub-) [Accessed 14 05 2023].
[8] Vinay K Singh and Anil Kumar, "PCR Primer Design," Molecular Biology Today, vol 2, no 2, pp 27-32, 2001
[9] Wojciech Rychlik , "Selection of primers for polymerase chain reaction," Molecular Biotechnology, vol 3, pp 129-134, 1995
[10] W.Rychlik, W.J.Spencer and R.E.Rhoads, "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro," Nucleic Acids Research, , vol 18, no 21, 1990
[11] John M Walker, "Electrophoresis Theory, techniques, and biochemical and clinical applications (second edition): by A T Andrews pp 452 Oxford Science Publications Clarendon Press, Oxford
[12] Theresa Phillips, "5 Common Dyes for Visualizing and Staining DNA," ThoughtCo, 09 01 2020 [Online] Available: https://www.thoughtco.com/visualizing-dna-375499 [Accessed 14 05 2023].