BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VI SINH THỰC PHẨM

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN...................................................................................................... 1 MỤC LỤC............................................................................................................ 2 Bài 1: XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC ............................................................................................... 4 I. Tổng quan: ................................................................................................... 4 1. Vi sinh vật hiếu khí, nấm men, nấm mốc và ảnh hưởng của chúng đến quá trình bảo quản thực phẩm:................................................................. 4 2. Môi trường nuôi cấy: .............................................................................. 4 3. Phương pháp: .......................................................................................... 4 II. Cách tiến hành: .......................................................................................... 5 1. Nguyên liệu: Rau má............................................................................... 5 2. Dụng cụ và thiết bị:................................................................................. 5 3. Chuẩn bị môi trường: ............................................................................. 5 4. Quy trình thực hiện: ............................................................................... 6 BÀI 2: XÁC ĐỊNH COLIFORMS VÀ COLIFORMS CHỊU NHIỆT ........ 13 I. Tổng quan: ................................................................................................. 13 1.1 Coliforms là gì?.................................................................................... 13 1.2 Phương pháp MPN: ............................................................................ 13 1.3 Mục đích: ............................................................................................. 13 1.4 Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB): ...................................... 13 1.5 Môi trường Brilliant Green Bile Broth (BGBL):............................. 14 1.6 Môi trường EC: ................................................................................... 14 II. Cách tiến hành: ........................................................................................ 14 2.1 Mẫu nguyên liệu và thiết bị:............................................................... 14 2.2 Hóa chất và môi trường:..................................................................... 15 2.3 Qui trình............................................................................................... 16 2.4 Tính kết quả:........................................................................................ 18 BÀI 3: XÁC ĐỊNH VÒNG KHÁNG KHUẨN............................................... 21 I. Tổng quan: ................................................................................................. 211. Vòng kháng khuẩn:............................................................................... 21 2. Môi trường ............................................................................................. 21 II. Tiến hành .................................................................................................. 21 1. Mẫu nguyên liệu:................................................................................... 21 2. Dụng cụ và môi trường......................................................................... 21 3. Quy trình và thuyết minh quy trình.................................................... 22 4. Kết quả. .................................................................................................. 24 BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC: .............................................................. 26

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM  BÁO CÁO THỰC HÀNH Môn học: THỰC HÀNH VI SINH THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: Ths Nguyễn Mạnh Cường Nhóm 07, Tổ 04 Sinh viên thực Cù Quốc Bảo Trương Quốc Bửu Phạm Thị Kim Châu Đặng Thị Kim Dung Nguyễn Thị Ngọc Diệu Võ Lê Đông Thi MSSV 20125695 20125334 20125340 20125363 20125357 20125695 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 11 năm 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, chúng em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Mạnh Cường nhiệt tình dạy chúng em để hiểu rõ kiến thức trình cấy, trình bảo quản, cách pha môi trường, kỹ thuật cấy… học lớp, tạo điều kiện tốt để chúng em hoàn thành báo cáo trang bị kiến thức phục vụ cho tương lai Tiếp đến, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Nguyễn Minh Hiền - giảng viên đóng vai trị cung cấp kiến thức cần thiết lớp để giúp chúng em hồn thành buổi thực hành Sau q trình thực hành, nhóm chúng em nỗ lực để hồn thành tốt báo cáo Tuy nhiên, kiến thức chun mơn kinh nghiệm thực tiễn cịn nhiều hạn chế nên khó tránh khỏi sai sót Chúng em mong nhận thơng cảm góp ý tận tình từ thầy, để chúng em có hội hồn thiện thân tích lũy thêm kinh nghiệm cho sau Cuối cùng, niềm kính trọng biết ơn chân thành, nhóm thực hành chúng em lần xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến q thầy, Kính chúc q thầy, ln dồi sức khỏe, hạnh phúc thành công sống Một lần chúng em xin chân thành cảm ơn thầy cô! MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC Bài 1: XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC I Tổng quan: Vi sinh vật hiếu khí, nấm men, nấm mốc ảnh hưởng chúng đến trình bảo quản thực phẩm: Môi trường nuôi cấy: Phương pháp: II Cách tiến hành: Nguyên liệu: Rau má Dụng cụ thiết bị: Chuẩn bị môi trường: Quy trình thực hiện: BÀI 2: XÁC ĐỊNH COLIFORMS VÀ COLIFORMS CHỊU NHIỆT 13 I Tổng quan: 13 1.1 Coliforms gì? 13 1.2 Phương pháp MPN: 13 1.3 Mục đích: 13 1.4 Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB): 13 1.5 Môi trường Brilliant Green Bile Broth (BGBL): 14 1.6 Môi trường EC: 14 II Cách tiến hành: 14 2.1 Mẫu nguyên liệu thiết bị: 14 2.2 Hóa chất mơi trường: 15 2.3 Qui trình 16 2.4 Tính kết quả: 18 BÀI 3: XÁC ĐỊNH VÒNG KHÁNG KHUẨN 21 I Tổng quan: 21 Vòng kháng khuẩn: 21 Môi trường 21 II Tiến hành 21 Mẫu nguyên liệu: 21 Dụng cụ môi trường 21 Quy trình thuyết minh quy trình 22 Kết 24 BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC: 26 Bài 1: XÁC ĐỊNH TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC I Tổng quan: Vi sinh vật hiếu khí, nấm men, nấm mốc ảnh hưởng chúng đến trình bảo quản thực phẩm: - Vi sinh vật hiếu khí: vi sinh vật tồn phát triển mơi trường có oxy chúng cần oxy để sinh trưởng phát triển Do nhu cầu oxy khác biệt vi sinh vật hiếu khí, người ta phân biệt thành vi sinh vật hiếu khí bắt buộc – vi sinh vật sinh trưởng phát triển mơi trường có oxy, vi sinh vật vi hiếu khí – vi sinh vật cần oxy mức độ thấp, khoảng – 10% oxy - Nấm men: chúng vi sinh vật nhân thực đơn bào, sinh sản hình thức nảy chồi, phát triển điều kiện kị khí hiếu khí, phát triển thích hợp nhiệt độ khoảng 32 – 35oC Nấm men có nhiều tự nhiên, trái có nhiều đường, đất, khơng khí… - Nấm mốc: Là vi sinh vật nhân thực, có cấu tạo dạng sợi Sinh sản vơ tính bào tử hình thức sinh sản chủ yều nấm mốc Chất dinh dưỡng quan trọng nấm mốc tinh bột nên ta thường tìm thấy nấm mốc mọc thực phẩm giàu tinh bột cơm, ngũ cốc… bị hư hỏng - Ảnh hưởng nấm men, nấm mốc vi sinh vật hiếu khí đến q trình bảo quản thực phẩm: Các vi sinh vật hiếu khí, nấm men nấm mốc tồn nhiều tự nhiên có mặt loại thực phẩm mà ta ăn hàng ngày Trong trình bảo quản thực phẩm, điều kiện cần thiết cho phát triển thuận lợi, ví dụ pH, nhiệt độ, độ ẩm… Chúng sử dụng chất dinh dưỡng thực phẩm để sinh trưởng, phát triển số lượng, tăng sinh khối, biến đổi tính chất chất dinh dưỡng sinh chất độc làm cho thực phẩm bị hư hỏng Mơi trường ni cấy: - Trong thí nghiệm này, để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ta sử dụng mơi trường ni cấy mơi trường thạch PCA (Plate Count Agar) - Môi trường thạch DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol) sử dụng để phân lập chọn lọc nấm-men nấm mốc có thực phẩm hư hỏng Phương pháp: - Phương pháp sử dụng phương pháp đếm số khuẩn lạc để tính số lượng tế bào vi sinh vật cịn sống (vi sinh vật hiếu khí, nấm men, nấm mốc) có mẫu thực phẩm Nguyên tắc vi sinh vật phát triển môi trường nuôi cấy, khuẩn lạc hình thành từ tế bào vi sinh vật ban đầu Đơn vị tính CFU/ml CFU/g (CFU: Colony Forming Unit) - Đối với tính tổng vi sinh vật hiếu khí sử dụng phương pháp đổ đĩa, sau có kết đếm khuẩn lạc tính số lượng vi sinh vật hiếu khí - Đối với tính số lượng nấm men nấm mốc sử dụng phương pháp cấy trang bề mặt, sau có kết ủ đếm khuẩn lạc tính tổng số nấm men, nấm mốc mẫu II Cách tiến hành: Nguyên liệu: Rau má Dụng cụ thiết bị: - Dụng cụ: bình schott dung tích 250ml 12 dĩa petri ống nghiệm Giá đỡ ống nghiệm ống đong - micropipette đầu tip tiệt trùng que cấy trang cốc thủy tinh đèn cồn Thiết bị: Tủ ủ Tủ sấy Nồi hấp tiệt trùng Máy đồng mẫu Bếp điện từ Máy đếm khuẩn lạc Cân điện tử Máy phát tia UV Chuẩn bị môi trường: - Pha môi trường Plate Count Agar (PCA) + Theo thông tin ghi bao bì, ta hịa tan 23.5g mơi trường PCA 1000ml nước Vì cần pha 200ml mơi trường/bình schott nên ta cần cân 4.7g mơi trường hịa tan vào 200ml nước Do môi trường thạch nên ta bổ sung thêm vào 2g agar + Sau lắc để hịa tan hết agar mơi trường có bình, ta mang hấp tiệt trùng áp suất 1atm, 121oC 15p Để nguội đến 45-50oC trước tiến hành bước Hình 1.1: Môi trường PCA - Pha môi trường Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) + Theo thông tin ghi bao bì, ta hịa tan 31,63g mơi trường DRBC 1000ml nước Vì cần pha 200ml mơi trường/bình schott nên ta cần cân 6.326g mơi trường hịa tan vào 200ml nước + Do môi trường thạch nên ta bổ sung thêm vào 2g agar + Sau lắc để hịa tan hết agar mơi trường có bình, ta mang hấp tiệt trùng áp suất 1atm, 121oC 15p Để nguội đến 45-50oC trước tiến hành bước Hình 1.2: Môi trường DRBC - Chuẩn bị nước muối sinh lý NaCl 0.85%: Nước muối sinh lý dùng để pha lỗng mẫu Quy trình thực hiện: 4.1 Sơ đồ quy trình: Pha lỗng mẫu Đổ mơi trường DRBC vào dĩa petri Dùng micropippepte hút 100𝜇𝑙 cho vào đĩa petri Xoay nhẹ dĩa petri cho dung dịch mẫu lan khắp dĩa Dùng micropippepte hút 100𝜇𝑙 cho vào đĩa petri Xử lý tia UV khoảng 15p Không xử lý tia UV Dùng que cấy trang cấy dịch mẫu lên khắp bề mặt thạch khô Đổ môi trường PCA chuẩn bị vào dĩa petri Ủ 37oC, 24h Quan sát xử lý số liệu 4.2 Giải thích quy trình: - Pha lỗng mẫu: + Dùng micropiptte hút 1ml mẫu (nồng độ 100 ) (nước rau má) cho vào ống nghiệm có chứa 9ml NaCl 0.85%, sau lắc đều, ta thu dung dịch mẫu có nồng độ 10−1 + Tiếp tục, hút 1ml mẫu nồng độ 10−1 cho vào ống nghiệm khác chứa 9ml NaCl 0.85%, lắc ta thu dung dịch mẫu có nồng độ 10−2 + Tiếp tục lặp lại thao tác, ta thu dung dịch mẫu với nồng độ 10−3 , 10−4 , 10−5 - Quy trình xác định tổng vi sinh vật hiếu khí: + Dùng micropipette hút 0.1ml (100𝜇l) dịch mẫu từ nồng độ 10−3 , 10−4 , 10−5 cho lên dĩa petri, nồng độ lấy dĩa petri Xoay nhẹ để dịch mẫu phủ bề mặt dĩa + Sau lấy nồng độ dĩa petri, mang xử lý tia UV 15p, dĩa lại nồng độ không xử lý tia UV + Sau 15p, dĩa xử lý tia UV xử lý xong; lúc ta đổ/cho môi trường PCA chuẩn bị vào dĩa petri, xoay nhẹ dĩa petri thạch đông lại + Úp ngược dĩa petri mang vào tủ ủ 37oC 24 → Sau ủ xong tiến hành quan sát, ghi nhận tượng tính kết tổng số vi sinh vật hiếu khí - Quy trình xác định tổng số nấm men, nấm mốc: + Đổ/Cho môi trường DRBC chuẩn bị sẵn vào đĩa petri, chờ thạch đông tự nhiên + Dùng micropipette hút 0.1ml (100𝜇l) dịch mẫu từ nồng độ 10−3 , 10−4 , 10−5 cho lên dĩa petri chứa môi trường DRBC, nồng độ lấy dĩa petri + Hơ que cấy trang lửa đèn cồn, để nguội ~10 – 15s thực cấy dịch mẫu lên khắp mặt thạch, có khơ cảm giác rít tay + Úp ngược dĩa petri mang vào tủ ủ 37oC 24 => Sau ủ xong tiến hành quan sát, ghi nhận tượng tính kết tổng số nấm men nấm mốc 4.3 Tính kết 4.3.1 Quan sát giải thích - Mơi trường PCA khơng xử lí UV Hình 1.3 đĩa petri mơi trường PCA không xử lý tia UV + Quan sát kết quả: ▪ Các đĩa petri không xử lý tia UV có số lượng khuẩn lạc nhiều, tất đĩa bị loang ▪ Số lượng khuẩn lạc nhiều bị loang nên tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc đĩa để tính số tế bào vi khuẩn mẫu ban đầu + Giải thích: Các đĩa petri không xử lý tia UV nên số lượng khuẩn lạc dày đặc, đĩa bị loang phương pháp cấy đổ đĩa khiến cho vi khuẩn không phân bố đồng - Môi trường PCA xử lí UV: 4.3.3 Cơng thức tính 𝑵= ∑𝑪 𝒏𝟏 × 𝑽 × 𝒅 ⧾ … ⧾ 𝒏𝒊 × 𝑽 × 𝒅𝒊 N: Tổng số tế bào vi khuẩn ban đầu (CFU/g)/(CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc đĩa petri 𝒏𝒊 : Số đĩa petri cấy độ pha loãng thứ i 𝒅𝒊 : Hệ số pha lỗng tương ứng V: Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) Có: 𝑵= 220+123+79+189+145+82 2×0.1×10−3 ⧾2×0.1×10−4 +2×0.1×10−5 = 3774774.775 = 3.8× 106 (CFU/g) 12 BÀI 2: XÁC ĐỊNH COLIFORMS VÀ COLIFORMS CHỊU NHIỆT I Tổng quan: 1.1 Coliforms gì? - Coliform vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram Âm kỵ khí, khơng có bào tử có hình que Chúng nằm bất động chỗ di chuyển Trong vòng 24 - 48 tiếng, vi khuẩn coliform có khả lên men đường lactose sinh hơi, aldehyde acid - Vi khuẩn coliform có mặt nhiều mơi trường khác như: Đất, nước (nước thải, nước sinh hoạt, nước ăn uống), thức ăn, hệ tiêu hóa phân động vật người, - Coliforms tác nhân gây nên chứng nước, tiêu chảy, rối loạn máu, suy thận chí tử vong - Coliforms chịu nhiệt: coliforms có khả lên men đường lactose khoảng thời gian 24h 44 - 45oC; nhóm bao gồm Escherichia loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter 1.2 Phương pháp MPN: MPN viết tắt Most probable number Đây phương pháp sử dụng ước tính nồng độ vi sinh vật khả thi mẫu cách tái tạo tăng trưởng vi sinh nước pha loãng gấp 10 lần 1.3 Mục đích: Xác định tổng số vi khuẩn Coliforms Coliforms chịu nhiệt có mẫu thực phẩm (nước rau má) 1.4 Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB): Môi trường Lauryl Sulphate Broth sử dụng để phát vi khuẩn coliform nước sản phẩm thực phẩm như: bánh kẹo, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm… Lauryl sulphate thúc đẩy sinh trường giải phóng khí vi sinh vật coliform Vi khuẩn gây hiếu khí ức chế hồn tồn Hình 2.1: Môi trường LSB 13 1.5 Môi trường Brilliant Green Bile Broth (BGBL): - Là môi trường nuôi cấy vi sinh sử dụng để định lượng phát hiển vi khuẩn Coliform thực phẩm - Brilliant Green Bile Broth 2% chứa hai chất ức chế vi khuẩn Gram âm, Thuốc nhuộm xanh Oxygall Brilliant - Các vi sinh vật Coliforms có khả chống lại sử hoạt động chất ức chế Quá trình lên mem Lactose Quá trình lên mem phát thơng qua việc sản xuất khí ống Durham vòng 48 ± Đây chứng xác thực lên mem Hình 2.2: Mơi trường BGBL vi khuẩn coliform 1.6 Môi trường EC: - Môi trường canh thang EC broth phát triển hai nhà nghiên cứu Hajna Perry nhằm sử dụng kiểm nghiệm nước, sữa, thân mềm vật liệu khác để tìm chứng nhiễm phân - Mơi trường chứa buffered lactose broth với casein peptones muối mật Hình 2.3: Mơi trường EC II Cách tiến hành: 2.1 Mẫu nguyên liệu thiết bị: - Nguyên liệu: Nước rau má - Các dụng cụ thiết bị sử dụng: 14 Thiết bị Dụng cụ Đầu típ ống đựng đầu típ Cân điện tử Đèn cồn Máy đồng mẫu Giá đỡ ống nghiệm Máy rung lắc ống nghiệm Ống nghiệm có chứa ống Durham Tủ ủ Que cấy vịng Micropipet 2.2 Hóa chất mơi trường: - Nacl 0,85%: 9ml × ống = 81ml - Lauryl Sulfate Broth (LSB): Hòa tan 200∗35.6 1000 = 7.12 gam 200 ml nước cất Sau đó, đun sôi lên từ từ khuấy nhẹ để việc hịa tan hồn tồn Có thể dùng máy khuấy từ gia nhiệt để thực nhanh chóng Đổ 10 ml hòa tan vào ống nghiệm thủy tinh có nắp chứa ống Durham (Úp ngược) Sau mang hấp tiệt trùng 1210C, 1atm vịng 15 phút Sau để nguội đến 45 -500C trước dùng - Brilliant Green Bile Broth (BGBL): Hòa tan 200∗40.01 1000 = 8g 200ml nước cất Gia nhiệt nhẹ từ từ đến sôi, lắc nhẹ khuấy tan hoàn toàn Đổ 10 ml hòa tan vào ống nghiệm thủy tinh có nắp chứa ống Durham (Úp ngược) Sau mang hấp tiệt trùng 1210C, 1atm vịng 15 phút Sau để nguội đến 45 -500C trước dùng Sau tiệt trùng nồi hấp khử trùng 1210C, atm vòng 15 phút phân phối vào ống nghiệm có chứa ống Durham đảo ngược - EC Broth: Hòa tan 200∗37 1000 = 7.4 gam 200ml Sau đó, đun sơi lên từ từ khuấy nhẹ để việc hòa tan hồn tồn Có thể dùng máy khuấy từ gia nhiệt để thực nhanh chóng 15 Đổ 10 ml hòa tan vào ống nghiệm thủy tinh có nắp chứa ống Durham (Úp ngược) Sau mang hấp tiệt trùng 1210C, atm vịng 15 phút Sau để nguội đến 45 -500C trước dùng 2.3 Qui trình 2.3.1 Sơ đồ qui trình: Pha lỗng mẫu Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống LSB Ủ 37˚C 24h Ghi nhận ống LSB (+) Cấy vào ống BGBL Cấy vào ống EC Ủ 37˚C 24h Ủ 42˚C 24h Đọc tính kết 16 2.3.2 Thuyết minh quy trình: - Bước 1: Pha loãng mẫu: cho 1ml nước rau má vào 9ml NaCl 0,85% trộn mẫu máy đồng mẫu - Bước 2: Hút 1ml dịch mẫu 10−3 , 10−4 , 10−5 vào ống nghiệm chứa môi trường LT (mỗi nồng độ ống) - Bước 3: Đem ủ 37˚C 24h - Bước 4: Ghi nhận ống LSB (+) - Bước 5: Lấy 1ml dịch mẫu ống dương tính ứng với nồng độ 10−3 , 10−4 , 10−5 cấy vào môi trường: BGBL: ống (ở nồng độ có ống) EC: ống (ở nồng độ có ống) - Bước 6: Mang ủ: Ở môi trường BGBL - đem ủ 37˚C 24h Ở môi trường EC - đem ủ 42˚C 24h - Bước 7: Ghi nhận số ống LSB (+), tính tổng coliforms, coliforms chịu nhiệt Hình 2.4: Mơi trường LT sau ủ 37 °C, 24h Kết ghi nhận sau ủ: thu 7/9 ống nghiệm dương tính Các dấu hiệu nhận biết ống nghiệm có dương tính: + Mơi trường LT bị đục so với ban đầu + Ống Durham ống nghiệm lên + Xuất bọt khí ống nghiệm 17 Cơ chế: vi khuẩn Coliforms sử dụng đường lactose để phân giải đường lactose thành acid (khí CO2) → Làm cho ống Durham lên ống có bọt khí Giải thích: Sở dĩ ghi nhận ống nghiệm dương tính dù pha lỗng nhiều nồng độ khác mẫu nước mía ban đầu chứa nhiều VK Coliforms Coliforms chịu nhiệt 2.4 Tính kết quả: Cơng thức: A=kết tra bảng*f/10 A: số tế bào vi sinh vật có 1ml mẫu (MPN/ml) f: nồng độ pha loãng thấp (10n) (mol/ml) n: độ pha loãng C= kết tra bảng * 10 n-1 C: Mật độ vi sinh vật mẫu n: nồng độ pha loãng thấp Kết thực nghiệm nồng độ: 10-3 EC (+) BGBL (+) 10-4 3 10-5 1 Hình 2.5: Các ống EC sau ủ 42 °C, 24h 18 Hình 2.6: Các ống BGBL sau ủ 37 °C, 24h Dấu hiệu nhận biết ống dương tính: Mơi trường cấy bị đục so với ban đầu, ống Durham ống nghiệm lên, xuất bọt khí ống nghiệm Giải thích: Trong mơi trường BGBL số ống dương tính độ pha lỗng 10-1 thấp so với nồng độ cịn lại q trình lấy mẫu mẫu khơng trạng thái đồng nhất, lấy mẫu nơi có vi sinh vật, thời gian ủ thực tế chưa đủ để vi sinh vật phát triển môi trường Trong môi trường EC số ống nghiệm dương tính giảm dần độ pha loãng tăng lên mẫu pha lỗng có vi sinh vật nên dẫn đến kết thu nhận * Lập tỉ lệ EC+ - Ống EC nồng độ -3 : ống (+) - Ống EC nồng độ -4 : ống (+) - Ống EC nồng độ -5 : ống (+) MPN=10-3:10-4:10-5 = 3:3:1 = 460 tra bảng Mac Crady, ta có: C = kết tra bảng.10n-1 = 103-1 460 = 46000 (MPN/ml) *Lập tỉ lệ BGBL+ - Ống BGBL nồng độ -3: ống (+) - Ống BGBL nồng độ -4: ống(+) - Ống BGBL nồng độ -5: ống (+) MPN=10-3:10-4:10-5 = 3:3:1 =460 tra bảng Mac Crady C = kết tra bảng.10n-1= 103-1 ×460 = 46000(MPN/ml) 19 Hình 2.7: Bảng Mac Crady Kết quả: - Tổng số Coliforms chịu nhiệt EC 46000 (MPN/ml) => Lớn giới hạn cho phép 10 → Không đạt yêu cầu giới hạn vi sinh vật phép có thực phẩm - Tổng số Coliforms BGBL 46000 (MPN/ml) =>lớn giới hạn cho phép 10 → Không đạt yêu cầu giới hạn vi sinh vật phép có thực phẩm 20 BÀI 3: XÁC ĐỊNH VÒNG KHÁNG KHUẨN I Tổng quan: Vòng kháng khuẩn: - Phương pháp đo vòng kháng khuẩn: phương pháp đo vòng kháng khuẩn hay gọi kháng sinh đồ phương pháp thực nhằm xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh thử nghiệm vi khuẩn gây bệnh, có nghĩa phát đề kháng kháng sinh vi khuẩn thử nghiệm - Chúng ta phải thực kháng sinh đồ kỹ thuật giúp ta lựa chọn kháng sinh phù hợp, nhằm tránh việc lạm dụng kháng sinh, giảm thiểu tình trạng kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Kháng sinh đồ giúp ngăn chặn gia tăng chủng vi khuẩn Khi nghi ngờ nhiễm khuẩn nên làm kháng sinh đồ Môi trường - Nutrient Agar (NA) hay cịn gọi thạch dinh dưỡng mơi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm Nutrient Agar có thành phần gồm Pepton, dịch chiết nấm hay thị bò, thạch Do mơi trường chứa hàm lượng sinh dưỡng cao Chính thạch dinh dưỡng hỗ trợ nhiều loài vi sinh vật khác nhau, đặc biệt lồi khơng có u cầu đặc biệt mặt dinh dưỡng Ngồi mơi trường Nutrient agar sử dụng để lưu trữ chủng vi sinh vật Hình 3.1: Mơi trường NA II Tiến hành Mẫu nguyên liệu: - Kháng sinh penicillin - Dịch ép tỏi Dụng cụ môi trường 2.1 Dụng cụ: bình schott 250ml đĩa petri hộp đĩa giấy vô trùng kẹp gắp 21 que cấy trang hộp đầu tip vô trùng micropipette đèn cồn 2.2 Hóa chất mơi trường Môi trường Nutrient Agar (NA): Theo thông tin ghi bao bì pha 28g mơi trường với 1000ml nước Vì cần pha 300ml mơi trường/bình schott nên ta cần cân 8.4 g mơi trường hịa tan vào 300ml nước Do môi trường thạch nên ta bổ sung thêm vào 3g agar Hấp tuyệt trùng 121oC 15p kết hợp 10g agar Sau giữ nhiệt độ từ 45 đến 50oC Quy trình thuyết minh quy trình 3.1 Quy trình: 22 Mẫu nguyên liệu Đỗ 15ml NA vào đĩa petri Hút 100 µl dịch khuẩn vào đĩa Trải trang dịch khuẩn Đặt đĩa giấy Nhỏ 10µl dung dịch cần xác định tính kháng khuẩn lên đĩa giấy Ủ 37oC, 24h Kết 23 3.2 Thuyết minh quy trình - Bước 1: Chuẩn bị môi trường: Đổ môi trường NA vào đĩa petri (đã hấp tiệt trùng) cách thực thao tác: đốt đèn cồn, sau mở nắp bình schott hơ miệng bình trước đèn cồn tiến hành mở nắp đĩa petri Sau đó, đổ khoảng 15ml NA vào đĩa, cho môi trường phủ mặt đĩa đậy nắp đĩa petri bình schott lại, tắt đèn cồn Đợi cho môi trường NA nguội đông lại - Bước 2: Cấy vi khuẩn lên môi trường: Sau môi trường đông lại, dùng micropipette hút dịch vi khuẩn từ ống nghiệm cho vào môi trường Hơ que cấy trang qua đèn cồn, đợi khoảng 10-15s trang dịch khuẩn bên môi trường khô lại có cảm giác rít tay - Bước 3: Đặt đĩa giấy vô trùng lên thạch: Chia đĩa petri thành phần (bằng cách đánh dấu đáy) ghi đầy đủ thông tin cần thiết Hơ kẹp qua lửa đèn cồn gắp đĩa giấy đặt vào gần thành đĩa - Bước 4: cho dung dịch cần xác định tính kháng khuẩn lên đĩa giấy: Đối với mẫu dung dịch dịch ép tỏi chuẩn bị từ trước, dùng micropipet hút 10 𝜇𝑙 (hoặc vừa đủ vòng que cấy vòng), cho vào đĩa giấy đĩa petri Đối với mẫu dung dịch penicillin, hút 10𝜇𝑙 penicillin pha loãng cho vào đĩa giấy đĩa petri lại - Bước 5: Mang ủ: Sau hoàn thành thao tác, ta mang đĩa petri ủ tủ ủ, ủ nhiệt độ 37oC vòng 24h, quan sát ghi nhận kết Kết 24 Hình 3.3: Đĩa sử dụng Penicilin Hình 3.2: Đĩa sử dung dịch tỏi Như thấy, đĩa thạch có vi khuẩn phát triển mạnh; Và ta khơng thấy xuất rõ ràng vịng kháng khuẩn đĩa (đĩa thử nghiệm dung dịch tỏi) đĩa (đĩa thử nghiệm dung dịch penicillin) có xuất vịng kháng khuẩn → Thí nghiệm bị sai sót nhiều yếu tố ảnh hưởng từ bên ngồi q trình làm thí nghiệm dẫn đến kết bị sai lệch 4.1 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả: Các yếu tố dẫn đến sai sót kết thí nghiệm như: Mơi trường thạch, vi khuẩn, khoanh giấy thấm kháng sinh, dung dịch dùng để thí nghiệm - Các thao tác dàn dịch khuẩn đặt kháng sinh không chuẩn dẫn đến sai lệch kết - Nhiệt độ ủ ấm thời gian dài khiến cho vi khuẩn nhân lên nhiều, làm giảm đường kính vùng ức chế - Độ dày mỏng đĩa thạch ảnh hưởng đến kết - Cấy trang nhiều thời gian khơng - Q trình hút pipet không chuẩn, bị lây nhiễm chéo - Các hợp chất sinh học có dung dịch tỏi bị bay thời gian chuẩn bị mẫu đến tiến hành thí nghiệm, thời gian ghi nhận kết dài 4.2 Kết luận: - Theo lý thuyết Penicillin dịch ép tỏi xuất kháng khuẩn Tuy nhiên có số yếu tố dẫn đến sai lệch kết không xuất vòng kháng khuẩn hay vòng khuẩn khuẩn mờ 25 BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC: Sinh viên thực MSSV Cù Quốc Bảo 20125695 Trương Quốc Bửu Phạm Thị Kim Châu Đặng Thị Kim Dung Nguyễn Thị Ngọc Diệu 20125334 20125340 20125363 20125357 Võ Lê Đông Thi 20125695 Công việc Bài 1: Xác định tổng vi sinh vật hiếu khí tổng nấm men nấm mốc Bài 3: Xác định vòng kháng khuẩn Bài 2: Xác định Coliforms Coliforms chịu nhiệt Bài 2: Xác định Coliforms Coliforms chịu nhiệt Bài 3: Xác định vòng kháng khuẩn Bài 1: Xác định tổng vi sinh vật hiếu khí tổng nấm men nấm mốc 26