BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

1.2. Môi trường nuôi cấy VSV 1.2.1. Khái niệm: Là môi trường được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng các yêu cầu sinh trưởng và phát triển cho vi sinh vật. 1.2.2. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV Có đầy đủ các chất dinh dưỡng và đủ lượng ( Chủ yếu là Cacbon và Nitơ). Phải vô trùng. Có pH thích hợp. 1.2.3. Phân loại 1.2.3.1. Phân loại môi trường theo công dụng Môi trường nuôi cấy cơ bản (nuôi được hầu hết các loại vi khuẩn). Môi trường tăng sinh và chọn lọc (ngăn chặn vi khuẩn không mong muốn phát triển). Môi trường đặc trưng. Môi trường vận chuyển. Môi trường kị khí (nuôi cấy vi khuẩn kị khí). Môi trường phân tích (xét nghiệm các vitamin, axit amin…).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG Cù Quốc Bảo-DH20VT MSSV: 20125327 Nhóm Biên soạn: Th.S Nguyễn Minh Hiền BÀI MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1.1 Các thiết bị PTN Vi sinh Trong buổi học, yêu cầu sinh viên quan sát tìm hiểu (tên thiết bị, mục đích sử dụng, cách sử dụng ) liệt kê thiết bị có PTN Vi sinh vào Bảng Bảng Một số thiết bị PTN vi sinh Thiết bị Mục đích Phóng đại quan sát vi sinh vật thấy mắt Kính Hiển Vi thường Nồi hấp tiệt trùng Tiệt trùng, khử khuẩn môi trường nuôi cấy vi sinh vật Cân điện tử Cân trọng lượng với độ xác cao Tủ Ủ Ni cấy vi sinh vật điều kiện nhiệt mong muốn Đảm bảo vơ trùng q trình cấy, khử trùng bề mặt tránh tạp Tủ sấy nhiễm dung để làm khô mẫu thí nghiệm Máy li tâm Tách phần lỏng phần cặn Máy lắc Vontex Để đồng dung dịch 1.2 Môi trường nuôi cấy VSV 1.2.1 Khái niệm: Là môi trường pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng yêu cầu sinh trưởng phát triển cho vi sinh vật 1.2.2 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng ni cấy VSV Có đầy đủ chất dinh dưỡng đủ lượng ( Chủ yếu Cacbon Nitơ) Phải vơ trùng Có pH thích hợp 1.2.3 Phân loại 1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng Môi trường nuôi cấy (nuôi hầu hết loại vi khuẩn) Môi trường tăng sinh chọn lọc (ngăn chặn vi khuẩn không mong muốn phát triển) Môi trường đặc trưng Mơi trường vận chuyển Mơi trường kị khí (ni cấy vi khuẩn kị khí) Mơi trường phân tích (xét nghiệm vitamin, axit amin…) 1.2.3.2 Phân loại mơi trường theo thành phần hố học Mơi trường ni cấy tự nhiên: Là môi trường phức tạp chứa nhiều chất hữu khác không rõ thành phần Môi trường nuôi cấy tổng hợp: Là môi trường biết rõ thành phần Môi trường bán tổng hợp: Là môi trường tự nhiên biết rõ thành phần hóa học 1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý Bảng Ảnh hưởng agar tới trạng thái vật lý môi trường Trạng thái vật lý Hàm lượng agar/lit Công dụng môi trường Lỏng (Broth) 0g/L Nhân giống vi sinh vật Thạch cứng 15-20g/L Phân lập cấy truyền vi sinh vật 1.2.4 Công thức môi trường Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc Khoai tây: 200 g Dextrose: 40 g Agar: 20 g H2O: L p H : 4.5-5 °C /15’/ 0.1 Mpa Các thông tin có cơng thức mơi trường: Tên: Potato Dextrose Agar (PDA) Công dụng: nuôi cấy nấm men nấm mốc Thành phần số lượng: 200g khoai tây, 40g dextrose, 20g agar pH: 4.5-5 Chế độ khử trùng môi trường: 121℃/15p/0.1 Mpa/15p/0.1 Mpa 1.2.5 Các bước để nấu môi trường (GV hướng dẫn cách làm, SV thực theo tổ) Cân đong hóa chất Đun cần Kiểm tra pH Phân phối môi trường vào dụng cụ thủy tinh Khử trùng theo yêu cầu 1.3 Phương pháp khử trùng 1.3.1 Khử trùng môi trường Phương pháp khử trùng môi trường: nhiệt ẩm, lọc, dùng tia U.V Bảng Khử trùng môi trường phương pháp nhiệt ẩm Phương pháp Nhiệt độ/ thời gian Khử trùng nồi hấp áp lực(Autoclave) 121˚C/15p/0.1Mpa 15lbs 1atm Thanh trùng Pastuer 80-100 ˚C /15-30p Tiệt trùng Tyldan 90-100 ˚C /15p/3 ngày liên tiếp Nguyên lý khả diệt VSV Dùng nước bão hòa nhiệt độ cao, áp xuất cao để tiêu diệt vi sinh vật Diệt bào tử tế bào sinh dưỡng Lặp lại trình nhiều lần để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng vi sinh vật, không tiêu diệt bào tử thực nhiều lần tiêu diệt Tiêu diệt tế bào sinh dưỡng bào tử vi sinh vật 1.3.1 Khử trùng dụng cụ ● Dụng cụ thuỷ tinh: dụng cụ thủy tinh khử trùng phương pháp nhiệt ẩm (Autoclave), nhiệt khô (160ºC/2 tiếng, 180ºC/30p) ● Dụng cụ nhựa: Nhiệt ẩm (Autoclave) ● Khử trùng PTN: Tia UV BÀI PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 3.1 Quan sát đại thể Quan sát khuẩn lạc mắt để thấy đặc điểm khuẩn lạc màu sắc, hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi Việc quan sát đại thể khuẩn lạc điển hình mơi trường phân lập chọn lọc giúp dự đốn VSV (phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm người quan sát) Sinh viên mơ tả khuẩn lạc cuả VSV phân lập Bài 2: Khuẩn lạc của: Saccharomyces cerevisiae mơi trường: PDA Hình dạng: Trịn Bờ, mép khuẩn lạc: Trịn Đường kính: 1mm Màu sắc: Trắng đục 3.2 Quan sát vi thể Làm tiêu quan sát tiêu kính hiển vi (KHV) để thấy được: ● Hình dạng ● Kích thước ● Cách xếp 3.2.1 Làm tiêu nấm mốc (phương pháp giọt ép) 3.2.2 Làm tiêu phương pháp nhuộm đơn Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ lửa đèn cồn đến vết bôi khô Bước 3: Nhuộm màu (sử dụng loại thuốc nhuộm sau: Gentiant violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton ) Nhỏ thuốc nhuộm vào vết bôi cố định, để phút, rửa nước Bước 4: Quan sát tiêu KHV Khi thực thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu tế bào bắt màu Phương pháp nhuộm đơn: thường áp dụng cho nấm men Khi sử dụng phương pháp để nhuộm màu vi khuẩn lúc quan sát KHV thấy được: Hình dạng tế bào 3.2.3 Làm tiêu phương pháp nhuộm kép (GV hướng dẫn thao tác) Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ lửa đèn cồn đến vết bơi khơ Mục đích cố định vết bơi: + Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Gắn chặt VSV lame + Giúp VSV không bị trôi rửa nước Bước 3: Nhuộm màu Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Để phút Rửa nước Nhỏ Lugol Để phút Rửa nước Tấy cồn Rửa nước Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin) Để 30 giây Rửa nước Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu) Vẽ hình quan sát Miêu tả hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, tế bào bắt màu thuôc nhuộm Nấm Mốc( 10x) Nấm men( 100x) Vk Staphylococcus( 100x) Vk E.Coli( 100x) Vi khuẩn Bacillus(100x) Vk Salmonella( 100x) Lưu ý: tiêu quan sát phải có đầy đủ thơng tin sau: Tên VSV, vật kính quan sát, hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, màu sắc tế bào (nếu vi khuẩn phải ghi rõ vi khuẩn Gram + hay VK Gram -) Bài tập nhà: (SV làm sau học thực hành) So sánh phương pháp nhuộm đơn nhuộm kép Nhuộm đơn Nhuộm kép Đều dùng để nhuộm màu VK Giống Khác Quy trình Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ lựa đèn cồn đến vết bôi khô Bước 3: Nhuộm màu (sử dụng loại thuốc nhuộm sau: Gentiant Violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh coton,…) Nhỏ thuốc nhuộm vào vết bôi cố định để phút, rửa nước Bước 4: Quan sát tiêu kính hiển vi Khi thực thao tác, sử dụng thuốc nhuộm màu tế bào bắt màu thuốc nhuộm màu Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi Bước 2: Cố định vết bôi: hơ lửa đèn cồn đến vết bơi khơ Mục đích cố định vết bơi: + Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm + Gắn chặt VSV lame + Giúp VSV không bị trôi màu rửa nước Bước 3: Nhuộm màu Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal Violet) Để phút Rửa nước Nhỏ Lugol Để phút Rửa nước Tẩy cồn Rửa nước Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Saframin) Để 30 giây Rửa nước Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu) Mục đích Nhuộm màu VK gram (+) gram (-) Phân biệt VK gram (+) gram (-) Tại phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu quan sát KHV vật kính 100? ● Một số tia sáng từ mẫu, qua lamen mơi trường khơng khí bị khúc xạ ngồi khơng lọt vào vật kính Nhưng dùng dầu xem kính, tia sáng qua mẫu vật, qua môi trường đồng lamen dầu soi kính, khơng bị khúc xạ chúng rời khỏi lamen Giải thích chế bắt màu tím VK Gram + mắt màu hồng VK Gram● Khi nhuộm tím tinh thể (crystal violet) phút G+ G– có màu tím màu thấm vào lớp peptidoglycan G+ màng G– ● Khi thêm dung dịch Lugol, để phút G+ G- có màu tím đậm tạo phức chất màu tím với tinh thể cố định màu ● Khi tẩy cồn 30s: ▪ G+: cồn làm cho lỗ peptidoglycan co lại phức chất tím tinh thể - iot bị giữ lại tế bào ▪ G-: cồn làm tan lớp màng ngồi có màu, chất lipid dẫn đến rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot, giai đoạn G- màu ● Khi nhuộm tiếp Safranin hay Fuchsin Ziehl G+ giữ màu tím khơng bắt màu Safranin hay Fuchsin Ziehl G- bắt màu hồng