Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)

Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)Báo cáo thực hành sinh học vi sinh nhóm 1 (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC  BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC VI SINH Nhóm – Thứ ca Lớp: DH21SHB Giảng viên hướng dẫn: TS Trương Phước Thiên Hoàng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Lan Anh - 21126009 Nguyễn Thị Lan Anh - 21126014 Ngô Ngọc Hải - 21126324 Phạm Thị Mỹ Hạnh - 21126054 Lý Gia Hân - 21126325 Thạch Vinh - 21126259 TP.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2022 MỤC LỤC BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC Bài 1: Các thao tác phịng thí nghiệm vi sinh 1.1 Gói đĩa petri 1.2 Pha chế môi trường: Mơi trường dịch trích khoai tây 1.3 Các phương pháp cấy 1.3.1 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy trang 1.3.2 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy ria 1.3.3 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy móc Bài 4: Quan sát nấm sợi 11 4.1 Tổng quan Trichoderma 11 4.2 Tổng quan Aspergillus 13 Bài 6: Nhuộm Gram 14 6.1 Nhuộm E coli 14 6.2 Nhuộm Bacillus subtilis 15 6.3 Nhuộm Staphylococcus 17 BẢNG PHÂN CƠNG CƠNG VIỆC Tên MSSV Cơng việc Nguyễn Lan Anh - Làm báo cáo 21126009 - Cách gói đĩa petri - Bổ sung phần (Nhóm trưởng) Nguyễn Thị Lan Anh - Cách cấy ria 21126014 - Tổng quan Trichoderma Ngô Ngọc Hải - Cách cấy móc 21126324 - Cách nhuộm Staphylococcus Phạm Thị Mỹ Hạnh - Cách nhuộm E coli Bacillus subtilis 21126054 Lý Gia Hân - Cách pha mơi trường dịch trích khoai tây 21126325 Thạch Vinh - Cách cấy trang 21126259 - Tổng quan Aspergillus Kí tên Bài 1: Các thao tác phịng thí nghiệm vi sinh 1.1 Gói đĩa petri 1.1.1 Chuẩn bị dụng cụ - Đĩa petri (Khoảng đến 10 đĩa) - Một xấp báo - Khăn Lưu ý: Trước tiến hành gói đĩa, đĩa petri phải qua hấp tiệt trùng, rửa lau bắt đầu gói đĩa 1.1.2 Các bước tiến hành Bước 1: Trải báo đặt đĩa petri nằm ngang với mặt bàn Bước 2: Kéo tờ báo lên khoảng hai phần ba, lấy ngón trỏ đẩy đĩa nằm khơng vào Bẻ hai mép giấy hai bên vào trong, dùng hai ngón trỏ ngón giữ lại Bước 3: Cầm nguyên cụm tay, đẩy đĩa lên tí, vuốt mép ba ngón tay ép sát vào vành đĩa (tạo nếp) gấp xéo phần ba đĩa, khơng vng góc Bước 4: Tiếp tục đẩy đĩa lên, gấp thêm nếp ép sát vào vành đĩa nếp gấp trước Bên làm tương tự, tạo nếp gấp xong đẩy đĩa lên tạo tiếp nếp gấp Bước 5: Khi thấy cuộn gói cịn lỏng, ép chặt vào làm tương tự lúc hết 1.1.3 Kết Buổi đầu Buổi sau 1.2 Pha chế môi trường: Môi trường dịch trích khoai tây 1.2.1 Chuẩn bị dụng cụ - Cân, bếp, nồi bình chứa - Khoai tây: 200g - Saccharose: 50g - Pepton: 5g - Yeast extract: 1g - Agar: 20g - H2O đủ 1000ml 1.2.2 Các bước tiến hành Bước 1: Cân 100g khoai tây sau sắc hạt lựu Đem khoai tây sắc đun với nước để sôi 20 phút lúc đun vớt bỏ bọt Nấu cho đủ 500ml nước khoai tây Bước 2: Bỏ vào becker 25g Saccharose; 2,5g Pepton 0,5g Yeast extract Bước 3: Cân 10g Agar chia làm đơi bỏ vào bình chứa Bước 4: Đổ 500ml nước khoai lọc lấy dịch hỗn hợp becker sau khuấy Bước 5: Chia đôi hỗn hợp sau khuấy đổ vào bình chứa bịt kín bơng gịn chống thấm nước buộc giấy báo miệng chai Bước 6: Đem tiệt trùng 121oC 15 phút 1.2.3 Kết Mơi trường dịch trích khoai tây 1.3 Các phương pháp cấy - Các phương pháp cấy: Cấy que cấy trang, cấy móc cấy ria - Mục đích: Phân lập vi khuẩn thành khuẩn lạc đơn phù hợp với mục đích ni cấy vi khuẩn - Mơi trường: Mơi trường dịch trích giá đậu, mơi trường dịch trích khoai tây,… 1.3.1 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy trang 1.3.1.1 Chuẩn bị dụng cụ - Đèn cồn tủ cấy - Bình xịt sát khuẩn tay - Que cấy trang (que cấy tam giác): Là que kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn bề mặt thạch rắn - Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (giá đậu) - Đĩa petri có sẵn vi sinh - Dung dịch có độ pha loãng 1/1000 Lưu ý: - Trước tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy dung dịch cồn, rửa tay dung dịch cồn trước để tay vào tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trình cấy) - Đối với cấy trang: + Cấy đều, nhanh tay + Cấy vào vành đĩa + Cấy khơ 1.3.1.2 Các bước tiến hành Bước 1: Hơ nóng miệng đĩa lửa (không để sát), sau mở nắp đĩa dùng pipet 0,1 ml dịch canh khuẩn lên bề mặt môi trường thạch đĩa petri Bước 2: Nhúng đầu gạt vào cồn hơ qua lửa để khử trùng Bước 3: Mở đĩa petri, đưa gạt chà vào mặt đĩa mơi trường thạch để làm nguội sau nhẹ nhàng gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt trải dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch, trình thực để nắp đĩa hở hơ gần lửa để môi trường mau khô (Chú ý: Không để gần lửa làm chết vi khuẩn) Bước 4: Lật ngược đĩa ủ nhiệt độ, thời gian thích hợp tủ ổn nhiệt 1.3.1.3 Kết a Nếu thực thao tác, không bị tạp nhiễm tạo kết hình sau: => Tạo khuẩn lạc đơn đồng (những khuẩn lạc thuần) b Nếu môi trường chưa khô tạo kết hình đây: Mơi trường chưa khơ - Hình trái: Mơi trường chưa khơ cịn ướt nên tạo mảng sinh vật nên không xuất khuẩn lạc đơn - Hình phải: Mặc dù tạo khuẩn lạc đơn phần chưa khô chưa cấy vào vành đĩa c Nếu môi trường bị tạp nhiễm tạo kết hình đây: Mơi trường bị tạp nhiễm - Hình trái: Tuy khuẩn lạc đơn xảy tình trạng tạp nhiễm (những lớn hơn) - Hình phải: Mơi trường khơ xuất khuẩn lạc đơn chưa cấy vào vành đĩa 1.3.1.4 Khắc phục - Tập luyện thành thạo thao tác bên - Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người 1.3.2 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy ria 1.3.2.1 Chuẩn bị dụng cụ - Đèn cồn tủ cấy - Que cấy vòng: Que cấy kim loại đầu có vịng trịn, thường dùng cấy chủng từ môi trường rắn lỏng lên môi trường rắn, lỏng - Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (giá đậu) - Bình xịt sát khuẩn tay - Đĩa petri có sẵn vi sinh Lưu ý: - Điều quan trọng q trình ni cấy vi sinh vật tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào mơi trường ni cấy Muốn vậy, ngồi thao tác phải tiến hành điều kiện vô trùng, yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến vật dụng cần thiết khác phải khử trùng thích hợp để vô trùng trước sử dụng - Trước tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy dung dịch cồn, rửa tay dung dịch cồn trước để tay vào tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trình cấy) - Thao tác cấy thực không gian vô trùng tạo lửa đèn cồn, lửa đèn cồn có tác dụng oxy hóa khơng khí tạo khơng gian vơ trùng, đồng thời dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm mở, đóng, nút bông, nắp nhựa… - Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay tiến hành sát trùng tay cồn 70° dung dịch diệt khuẩn 1.3.2.2 Các bước tiến hành Bước 1: Dùng que cấy vịng vơ trùng cách đốt lửa đèn cồn, làm nguội nhúng vào dịch mẫu để có vi khuẩn cần phân lập Bước 2: Ria đường đĩa petri chứa mơi trường thạch thích hợp + Cấy vùng 1: Dùng que cấy có vi khuẩn, ria đĩa thạch theo đường ziczac với diện tích chiếm 1/3 diện tích đĩa thạch + Cấy vùng 2: Xoay đĩa 120 độ, tiến hành cấy vùng cách di chuyển que cấy theo đường ziczac thưa so với vùng vùng chiếm 1/3 đĩa + Cấy vùng 3: Xoay đĩa 120 độ cấy tương tự cấy vùng Sao cho đường cấy vùng phải chạm vào vùng đường cấy thưa so với vùng Diện tích cấy 1/3 đĩa thạch cuối Bước 3: Các đường cấy vùng sau phải chạm vào đường cấy vùng trước để đảm bảo vi khuẩn mọc tất vùng tạo khuẩn lạc riêng lẻ Bước 4: Sau kết thúc đường ria, cần đốt tiệt trùng que cấy Bước 5: Lật ngược đĩa, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Bước 6: Theo dõi phát triển vi khuẩn 24-48h 1.3.2.3 Kết a Nếu thực thao tác tạo kết hình sau: => Tạo khuẩn lạc đơn đồng (những khuẩn lạc thuần) b Nếu thực thao tác khơng tạo kết hình sau: - Hình trái: Đường cấy thưa Đường cấy hai chạm vào đường cấy thứ ba nhiên mạnh với sinh khối lớn nên khơng tạo khuẩn lạc đơn - Hình phải: Đường cấy hai ổn đường cấy ba sát nên tạo khuẩn lạc đơn 1.3.2.4 Khắc phục - Tập luyện thành thạo thao tác bên - Trong lúc cấy hạn chế tập trung đông người 1.3.3 Cấy đĩa môi trường thạch que cấy móc 1.3.3.1 Chuẩn bị dụng cụ - Đèn cồn tủ cấy - Bình xịt sát khuẩn tay - Que cấy móc (que cấy đầu vng): Đây que cấy có đầu vng góc, dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty - Đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy phù hợp (PDA) - Đĩa petri có sẵn vi sinh Lưu ý: - Trước tiến hành cấy, cần vệ sinh tủ cấy dung dịch cồn, rửa tay dung dịch cồn trước để tay vào tủ cấy (để hạn chế tạp nhiễm trình cấy) - Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, cần mang găng tay không tập trung nơi đông người 1.3.3.2 Các bước tiến hành Bước 1: Hơ nóng miệng đĩa petri có sẵn vi sinh (khơng để q sát) que cấy lửa để khử trùng Bước 2: Chờ vài giây cho que cấy nguội, sau thử lên bề mặt thạch khơng có vi sinh thạch khơng nóng chảy dùng que cấy qt nhẹ nơi có vi sinh Bước 3: Hơ miệng đĩa petri có mơi trường thạch sau dùng que cấy chấm vào điểm thạch, đóng nắp đĩa hơ miệng đĩa lần Bước 4: Lật ngược đĩa ủ nhiệt độ, thời gian thích hợp tủ ổn nhiệt 1.3.3.3 Kết a Nếu thực thao tác, không bị tạp nhiễm tạo kết hình sau: => Nấm có bào tử, sợi tơ nấm phát triển 10 b Nếu thực không thao tác, bị tạp nhiễm tạo kết hình sau: - Hình trái: Sợi tơ khơng thể phát triển nhiễm khuẩn cạnh tranh dinh dưỡng với nấm - Hình phải: Mặc dù sợi tơ xuất bị nhiễm khuẩn nên sợi tơ không phát triển tiếp tục 1.3.3.4 Khắc phục - Tập luyện thành thạo thao tác bên ngồi - Trong lúc cấy hạn chế tập trung đơng người Bài 4: Quan sát nấm sợi 4.1 Tổng quan Trichoderma 4.1.1 Trichoderma gì? - Đây tên gọi chủng nấm có tên đầy đủ Trichoderma spp, thường sống đất tập trung nhiều khu vực rễ Chủng nấm có đến 33 lồi, hầu hết có lợi cho trồng Một số giúp cố định đạm đất, số khác phân giải lân cơng tiêu diệt lồi nấm bệnh gây hại cho trồng Do tính chất đối kháng với nấm bệnh, nên bà thường nghe tên gọi Trichoderma mà “Nấm đối kháng Trichoderma” 4.1.2 Trichoderma có tác dụng gì? - Nấm Trichoderma tiết enzym có tác dụng phá hủy vỏ tế bào, sau hấp thu dinh dưỡng, tiêu diệt lồi nấm có hại Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii… loài gây bệnh chết nhanh chết chậm 11 tiêu, bệnh lở cổ rễ cà phê, bệnh xì mủ sầu riêng, thối rễ bơ… bệnh tương tự liên quan đến rễ giống trồng khác - Ngoài chế tiêu diệt trực tiếp tiếp xúc, Trichoderma cịn có chế sinh “kháng thể” cấy truyền khắp phận, giúp tiêu diệt nấm hại lá, cành cây, cây, quả… mà không cần tiếp xúc - Trichoderma cịn giúp tạo mơi trường thuận lợi cho vi sinh vật cố định đạm (khuẩn lạc), phân giải lân… Nói chung Trichoderma cộng sinh tốt với tất lồi sinh vật có ích đất, giúp tăng độ tơi xốp cho đất Một số chủng Trichoderma tiết enzym giúp phân hủy mùn, rễ cây, loại phân hữu cơ, giúp chuyển hóa thành dạng chất mà hấp thu Ví dụ enzym cellulase, chitinase, protease, pectinase, amlylase - Trong trình ủ phân chuồng, ủ phân hữu từ xác động thực vật Việc trộn chung Trichoderma vào thành phần ủ giúp giảm mùi hơi, đẩy nhanh tiến trình phân giải, tiết kiệm thời gian ủ phân Đồng thời cịn kết hợp với biolactyl, subtyl… để tổng hợp nên chế phẩm sinh học khác 4.1.3 Ưu điểm + Không gây hại cho người vật nuôi, phát triển nhanh đất + Sử dụng nhiều chế để kháng lại vi sinh vật gây bệnh + Tồn lâu dài đất nhờ khả tự sản sinh bào tử + Đẩy nhanh q trình hấp thu chất dinh dưỡng kích thích tăng trưởng trồng Trichoderma sp 12 4.2 Tổng quan Aspergillus 4.2.1 Aspergillus gì? - Nấm sợi Aspergillus thuộc lớp nấm bất tồn Deuteromycetes, khơng có hình thức sinh sản hữu tính, hệ sợi có vách ngăn, bào tử vơi tính bào tử trần, phần lớn sống hoại sinh đất - Bộ phận sinh bào tử Aspergillus có cấu trúc đặc biệt gồm đính bào đài mọc từ tế bào chân, đỉnh bào đài, tiểu bào đài, tiểu bào đài sinh bào tử có kích thước nhỏ, nhìn trơng giống bơng hoa cúc 4.2.2 Vai trò gây bệnh Aspergillus - Aspergillus gây nhiều bệnh cho người động vật Nấm gây độc (nhiễm độc tố nấm thức ăn ô nhiễm), gây bệnh (dị ứng, nấm phát triển chỗ không xâm nhập bệnh nấm xâm nhập) Aspergillus chủ yếu gây bệnh phổi, đơi gây bệnh ngồi phổi 4.2.3 Điều trị - Thể dị ứng: Điều trị điều trị hen - Bướu nấm: Phẫu thuật điều kiện bệnh nhân cho phép, thường chống định bệnh phổi cũ, thuốc khơng có tác dụng - Nấm xâm nhập: Nấm đáp ứng với thuốc Có thể dùng amphotericin B phối hợp flucytosine rifampicin, nhóm azole dùng itraconazole Hiện hy vọng vào thuốc voriconazole, caspofungin có tác dụng tốt với Aspergillus Aspergillus sp 13 Bài 6: Nhuộm Gram 6.1 Nhuộm E coli 6.1.1 Chuẩn bị dụng cụ + Dung dịch Crystal violet + Dung dịch Lugol + Cồn tẩy 90° + Dung dịch Safranin + Nước, bình tia + Que cấy vịng + Mẫu khuẩn lạc + Đèn cồn + Lame 6.1.2 Các bước tiến hành Bước 1: Nhỏ giọt nước lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy mẫu vi khuẩn chuẩn bị từ trước cho vào giọt nước (Xác định rõ vùng để trải mẫu, ghi tên đánh dấu lên lame cần thiết) Bước 2: Dàn vi khuẩn lên lame que cấy, hơ lửa đèn cồn tới lame khô Bước 3: Nhuộm: - Nhỏ giọt dung dịch Crystal violet trải lên vùng xác định, để khoảng phút Sau rửa vịi nước chảy nhẹ (Lưu ý: Khi rửa khơng để tia nước chiếu thẳng vô vùng chứa mẫu) - Nhỏ dung dịch Lugol trải lên vùng chứa mẫu để cố định màu, để khoảng phút Rửa vòi nước - Tẩy màu cồn 90° rửa lại nhanh nước - Nhỏ dung dịch đỏ Safranin, trải đều, để khoảng phút Rồi tiếp tục rửa vòi nước - Để khô tự nhiên Bước 4: Soi mẫu kính hiển vi 6.1.3 Kết 14 - Vi khuẩn Gram (-): Lớp peptidoglycan mỏng lớp màng lipopolysaccharide nên khơng thể giữ lại màu tím Do sau nhuộm Safranin tế bào bắt màu đỏ (hoặc hồng) E coli => E coli vi khuẩn gram âm nên có màu hồng 6.1.4 Ý nghĩa - Là phương pháp giúp nhận định sơ hình thể, kích thước, tính bắt màu, cách xếp vi khuẩn giúp phân biệt nhanh vi khuẩn gram âm gram dương + Nước: Giúp cố định vi khuẩn + Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất vi khuẩn gram dương thành màu tím + Nhỏ Lugol: Có tác dụng cố định màu + Tẩy cồn 90°: Tẩy màu số vi khuẩn mà dung dịch Lugol không gắn màu tím vào + Nhuộm đỏ Safranin: Nhuộm đỏ trở lại vi khuẩn bị cồn tẩy màu Không có tác dụng vi khuẩn bị nhuộm tím 6.2 Nhuộm Bacillus subtilis 6.2.1 Chuẩn bị dụng cụ + Dung dịch Crystal violet + Dung dịch Lugol + Cồn tẩy 90° 15 + Dung dịch Safranin + Nước, bình tia + Que cấy vòng + Mẫu khuẩn lạc + Đèn cồn + Lame 6.2.2 Các bước tiến hành Bước 1: Nhỏ giọt nước lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy mẫu vi khuẩn chuẩn bị từ trước cho vào giọt nước (Xác định rõ vùng để trải mẫu, ghi tên đánh dấu lên lame cần thiết) Bước 2: Dàn vi khuẩn lên lame que cấy, hơ lửa đèn cồn tới lame khô Bước 3: Nhuộm: - Nhỏ giọt dung dịch Crystal violet trải lên vùng xác định, để khoảng phút Sau rửa vịi nước chảy nhẹ (Lưu ý: Khi rửa không để tia nước chiếu thẳng vô vùng chứa mẫu) - Nhỏ dung dịch Lugol trải lên vùng chứa mẫu để cố định màu, để khoảng phút Rửa vòi nước - Tẩy màu cồn 90° rửa lại nhanh nước - Nhỏ dung dịch đỏ Safranin, trải đều, để khoảng phút Rồi tiếp tục rửa vịi nước - Để khơ tự nhiên Bước 4: Soi mẫu kính hiển vi 6.2.3 Kết - Vi khuẩn Gram (+): Do lớp peptidoglycan dày, sau bắt màu tím thuốc nhuộm Crystal violet cố định màu dung dịch Lugol nên màu tím khơng sau tẩy cồn 16 Bacillus subtilis => Bacillus subtilis vi khuẩn gram dương nên có màu tím 6.2.4 Ý nghĩa - Là phương pháp giúp nhận định sơ hình thể, kích thước, tính bắt màu, cách xếp vi khuẩn giúp phân biệt nhanh vi khuẩn gram âm gram dương + Nước: Giúp cố định vi khuẩn + Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất vi khuẩn gram dương thành màu tím + Nhỏ Lugol: Có tác dụng cố định màu + Tẩy cồn 90°: Tẩy màu số vi khuẩn mà dung dịch Lugol không gắn màu tím vào + Nhuộm đỏ Safranin: Nhuộm đỏ trở lại vi khuẩn bị cồn tẩy màu Không có tác dụng vi khuẩn bị nhuộm tím 6.3 Nhuộm Staphylococcus 6.3.1 Chuẩn bị dụng cụ + Đèn cồn + Que cấy vịng + Lam kính, kính mỏng (lame) + Nước, bình tia + Đĩa peptri có vi khuẩn Staphylococcus 17 + Dung dịch Crystal Violet + Dung dịch Lugol + Dung dịch cồn + Dung dịch Safranin 6.3.2 Các bước tiến hành Bước 1: Đưa que cấy vòng vào lửa đèn cồn để khử trùng, sau dùng que lấy giọt nước, tiếp tục dùng que cấy lấy mẫu vi khuẩn Bước 2: Trải vi khuẩn lên vùng định, cố định vi khuẩn lam kính để khơ tự nhiên Bước 3: Phủ dung dịch Crystal violet vòng phút sau rửa với nước Bước 4: Phủ dung dịch Lugol vịng phút sau rửa Bước 5: Rửa nhanh với dung dịch cồn sau rửa lại với nước Bước 6: Phủ dung dịch Safranin vịng phút sau rửa lại với nước Bước 7: Soi mẫu kính hiển vi 6.3.3 Kết - Vi khuẩn Gram (+): Do lớp peptidoglycan dày, sau bắt màu tím thuốc nhuộm Crystal violet cố định màu dung dịch Lugol nên màu tím khơng sau tẩy cồn Staphylococcus sp => Staphylococcus vi khuẩn gram dương nên có màu tím 18 6.3.4 Ý nghĩa - Là phương pháp giúp nhận định sơ hình thể, kích thước, tính bắt màu, cách xếp vi khuẩn giúp phân biệt nhanh vi khuẩn gram âm gram dương + Nước: Giúp cố định vi khuẩn + Nhuộm Crystal violet: Nhuộm tất vi khuẩn gram dương thành màu tím + Nhỏ Lugol: Có tác dụng cố định màu + Tẩy cồn 90°: Tẩy màu số vi khuẩn mà dung dịch Lugol không gắn màu tím vào + Nhuộm đỏ Safranin: Nhuộm đỏ trở lại vi khuẩn bị cồn tẩy màu Không có tác dụng vi khuẩn bị nhuộm tím 19