Bài 1 Một số thiết bị và thao tác cơ bản Khối lượng (m) g,mg,ug,ng Thể tích (V) L mL, uL Hoạt độ enzyme U ( unit) Nồng độ mol ( CM) M, mM, uM, nM, pM Nồng độ % ( C%) % (Wv), % (vv) Một số công thức thông dụng Venzyme=110 v tổng C% (wv)= (m(g) 100)v(mL) khối lượng trên thể tích ( hóa chất gốc là bột) C%(vv)=(V(mL)100)V(mL) Thể tích trên thể tích ( hóa chất gốc ở dạng lỏng) C1V1=C2V2 ( pha hóa chất từ 1 dung dịch mẹ ( vế đầu) , xuống 1 dung dịch có nồng độ thấp hơn) → đổi đơn vị sao cho t.
Bài 1: Một số thiết bị thao tác Khối lượng (m): g,mg,ug,ng Thể tích (V): L mL, uL Hoạt độ enzyme: U ( unit) Nồng độ mol ( CM): M, mM, uM, nM, pM Nồng độ % ( C%): % (W/v), % (v/v) Một số công thức thông dụng: - Venzyme=1/10 v tổng - C% (w/v)= (m(g) *100)/v(mL) : khối lượng thể tích ( hóa chất gốc bột) - C%(v/v)=(V(mL)*100)/V(mL) : Thể tích thể tích ( hóa chất gốc dạng lỏng) - C1V1=C2V2 ( pha hóa chất từ dung dịch mẹ ( vế đầu) , xuống dung dịch có nồng độ thấp hơn)-→ đổi đơn vị cho trái phải đồng đơn vị Vd: Trình bày cách pha 200ml sodium acetate 1% ( w/v) C%= (m*100)/v -→ tìm m + Từ dd mẹ Tris 1M pha 1ml dd Tris 0.1M C1V1=C2V2-→ 1V1=0.1*1 + Trình bày cách pha 1ml ( V2) dd TE gồm Tris 10mM (C2), EDTA 1mM Tris 1M (C1), EDTA 0.5 M ( 1M=1000mM)(0.5M=500mM) -→ C1V1=C2V2-→ 10*1/1000=0.01 ( Tris) ml -→ C1V1=C2V2-→ 1/500= 0.002 ( EDTA) ml Lưu ý: Thay pha dd mẹ riêng ta pha chung vs stock cao hơn, đậm đặc so với chất , X số lần đậm đặc lần so với dung dịch ban đầu cần dung, vd 10X đậm đặc dd mẹ ban đầu gấp 10 lần, 10mM thành 100mM, có cách tiếp cận, pha dd mẹ riêng thành phần, pha dd mẹ chung với đậm đặc dd lần Mơ tả phận micropipette cho biết chức phận ( xem kĩ giáo trình prelab) Mơ tả bước để lấy thể tích hóa chất định: ví dụ , mơ tả bước thực hành để láy 500 ul nước ( xem kĩ giáo trình prelab) Cho biết bước để chuẩn bị bảng gel agarose 1% ( W/v) cho điện di: ( xem kĩ them giáo trình prelab): -Cho agarose vào TAE ( sử dụng TAE TAE dung dịch đệm để hịa tan agarose gel để chạy điện di , để DNA di chuyển cần nằm dung dịch đệm để tạo điện trường để lôi kéo DNA, thống môi trường) -Cho vào chai nuran, dung micropipet để lấy thể tích dung dịch cần dung, khơng dung vạch định mức bình định mức tính xác khơng cao mang tính tương đối, pha gel khơng cần nồng độ xác, sai số không ảnh hưởng nên không cần dung micropipet để đo xác -Đun nóng gel agarose, lắp khn lược gel ( mục đích lược lược có rang lược, sau rút tạo thành lỗ( giếng) tạo giếng để DNA chạy điện di cách ổn định phân tách DNA khác) -Để nguội gel khoảng 50 tới 55*c ( sỡ dĩ phải làm nguội gel bước sau cho ethidium bromine ( chất nhuộm DNA) dễ bị phân hủy nhiệt) Ethidium bromine chất phát tín hiệu để phát DNA, nhạy cảm với nhiệt ánh sáng., gắn với mạch đơi DNA -Các cơng đoạn q trình tách chiết nucleic acid, điểm cần lưu ý tách chiết RNA, so với DNA là? ( xem kĩ giáo trình prelab) Cách sử dụng micropipet Bài 2: Tách chiết Nucleic Acid I Nguyên tắc: gia đoạn (1) Phá màng tế bào màng nhân-→(2) loại protein( bổ sung nhiều hoạt chất ức chế)-→(3) thu nhận nucleic acid ( enzyme phân hủy) - Mục tiêu tách gDNA ( DNA nhân) tách RNA tổng số -Cofactor ( ion 2+ gồm Mg2+ Ca2+) gắn vào enzyme enzyme có hoạt tính -DNA bảo vệ EDTA Những chất tác dụng + guanidine thiocyanate: ( hỗ trợ gắn, bất hoạt enzyme), chất gây biến tính protein, Rnase nội bào màng tế bào bị phá + Phenol: Gây biến tính protein , có dạng dung dịch bão hòa pH= pH = 4, phonol có pH = có khả hấp thu nuclic acid có trọng lượng phân tử lớn pha phenol thường dung tách chiết RNA để tranh nhiễm DNA +Chloroform: yếu phenol( thường dung chung với phenol), chất gây biến tính protein +EDTA có khả bắt giữ ion MG2+ Ca2+ ức chế hoạt động Dnase +DEPC: Chất biến tính protein , ức chế Rnase +Trizol ( phenol pH4.0 guanidine thiocyanase), biến tính mạnh protein, ức chế Rnase +DVC : Biến tính protein + Dung dịch L6: ( guanidine, Tris- X 100, Tris-HCl pH6.4, EDTA pH 8, Triton X-100): Phá màng, Giúp gắn nu vào silica, bất hoạt enzyme nucleas +Dung dịch L2: ( guanidine, Tris-HCl ph6.4): Rửa nucleic acid, giúp biến tính protein, ức chế enzyme Rnase, hỗ trợ gắn silica +TEIX: ổn định pH EDTA, bất hoạt ion Mg2+,bất hoạt Dnase + Etanol 70 % : Giúp loại bỏ muối, biến tính protein, thu tủa loại dịch +Silica: gắn nu +Axetol: Bay etanol ( rửa etanol) +KTL1( Trix, EDTA, Triton 100X, guanidine) : phá màng + KTL2: ( TE pha rời từ 1): gắn giải +KTL4: Phân hủy protein + KTC3 ( Trix, guanidine, etanol): Rửa + KTC4 ( etanol, NaH2PO4 với pH = 8): Rửa + SDS: Phá màng tế bào Bài 3: Phân Tích Nucleic Acid Bằng Kĩ Thuật Điện Di Và Đo Mật Độ Quang Điện di định tính Đo OD định lượng( xác định nồng độ…) I: Phương Pháp Điện Di ( định tính) -Xác định Có Nu mục tiêu hay khơng -DNA RNA tích điện âm nhờ nhóm phosphate, kích thước phân tử lớn chạy điện di chậm kích thước nhỏ - Nếu phân tử có khối lượng, phân tử có điện tích lớn di chuyển điện cực trái dấu nhanh - Có yếu tố phân tử Nu điện di mà ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển DNA khác biệt phân tách 1) Kích thước 2) Cấu hình: phức tạp để bắt ethidium bromine - Điện cao tốc độ di chuyển DNA nhanh - Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép nhân tách phân tử DNA sợi đơi, kích thước 300- 10.000 cắp nucleotide -Gel polyacrylamide cho lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách đoạn DNA có kích thước 500bp - Đối với gel agrose người ta nhuộm ethidium bromide, chất gắn xen vào base phân tử DNA Dưới ánh sáng kích thích UV , ethidium bromide phát ánh sáng huỳnh quang màu đỏ cam Điều cho phép phát vị trí đoạn DNA gel - Đối với gel polyacrylamide, phân tử DNA thường dánh dấu đồng vị phóng xạ vị trí chúng phát kĩ thuật phóng xạ tự ghi Bài 4: Phản Ứng PCR ( Polymerase Chain Reaction) I: Lý thuyết ( Sao chép DNA/ nhân số lượng lớn DNA mục tiêu) -PCR có chất phản ứng chép khuếch đại -Mồi cung cấp cho phản ứng PCR trình tự DNA ngắn có khả bắt cặp bổ sung với trình tự DNA mục tiêu, cung cấp đầu 3’OH tự cho DNA polymerase tổng hợp kéo dài mạch -Phản ứng PCR thực dựa lặp lại nhiều ( 20-40) chu kì luân nhiệt gồm bước: 1) Biến tính ( 94-98*c): DNA mạch đơi tách rời thành hai mạch đơn 2) Bắt cặp ( 50-65*c) Mồi bắt cặp với mẫu 3) Tổng hợp ( 72* c) : Mạch nối dài từ mồi - Thành phần phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xi mồi ngược , dNTP ( dATP, dCTP dGTP, dTTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2 Tag DNA polymerase - Chứng âm: mẫu chứng không chứa đoạn DNA/RNA mẫu mục tiêu để kiểm sốt q trình nhiễm chéo thực phản ứng PCR ( có xâm nhập DNA mẫu ngồi mơi trường lên kết chứng âm khơng có DNA mẫu theo ngun tắc không vạch, vạch chứng tỏ bị ngoại nhiễm-→ Dương tính giả) xem xét xem có nhiễm DNA ngoại lai hay khơng - Chứng dương: Là mẫu chứng có chứa đoạn DNA/RNA khn mục tiêu biết trước-→ so sánh đánh giá mẫu thử ( quy trình kĩ thuật bình thường chứng dương lên vạch) - Trong phản ứng PCR có tượng: + Xuất Primer dimer: mồi bắt cặp với nhau, có kích thước nhỏ, phân biệt với sản phẩm mục tiêu ( 60-70bp) + Sản phẩm kí sinh: Mồi thiết kế khơng tốt, bắt vào vùng trình tự khác từ nhân vùng trình tự → Ngồi sản phẩm mục tiêu xuất thêm sản phẩm không mong muốn.( khơng có đặc hiệu) -D1S80: Nằm NST số 1, trình tự khơng mã hóa, lặp lại 16bp, khác số lần lặp lại Bài 5: Các Enzyme thông dụng sinh học phân tử Nuclease enzyme có hoạt tính thủy giải liên kết phosphodiester nucleotide phân tử DNA hay DNA Trong SHPT số enzyme nuclease sử dụng phổ biến như: + Dnase + Rnase + Enzyme cắt giới hạn ( Restriction enzyme- RE): nhận diện trình tự phân cắt phân tử nucleic acid vị trí chuyên biệt Hầu hết enzyme cắt giới hạn sinh học phân tử nhóm II có khả nhận diện cắt vị trí chuyên biệt Công dụng enzyme cắt giới hạn thủy giải đoạn DNA dài thành đoạn DNA ngắn hơn, có kích thước phù hợp để dễ dàng phân tích thí nghiệm RFLP… Polymerase: enzyme tham gia vào sinh tổng hợp chuỗi DNA RNA số polymerase thông dụng: + Enzyme phiên mã ngược có khả nange tổng hợp c DNA từ khn RNA + DNA polymerase có khả sinh tổng hợp DNA Hoạt động khơi mào đầu 3’OH tự do, cung cấp đoạn mồi( primer) bắt cắp khuôn để bắt đầu tổng hợp + Các RNA polymerase SP^, T7, T3 cho phép tổng hợp RNA từ mạch khn DNA Ligase: có khả hình thành liên kết phosphodiester đầu 3’OH nu ddaauf5’P nu kế cận DNA ligase nối trình tự DNA, cịn RNA ligase nối hai trình tự RNA + vạch đầu chạy nhanh dạng siêu xoắn, + vạch dạng thẳng + Vạch dạng vịng lơi: Khó di chuyển Phân tích Plasmit -SaiI cắt vị trí ( 6096): plasmit tạo thành dạng thẳng, kích thước vịng kích thước plasmid ( 6279bp) - Cắt HindIII cắt vị trí ( 6102 5704): sản phẩm tạo thành đoạn, vịng lớn lại, đoạn cắt HindIII, với kích thước đoạn nhỏ (6102-5074), kích thước đoạn lớn ( 6279-(6102-574)) Chốt lại: Khi có sơ đồ plasmid, xác định xem làm việc với enzyme nào, enzyme có vị trí cắt plasmid, cắt thành công tạo sản phảm với kucsh thước ddienj di tạo vạch với kích thước Ví dụ: Ví dụ phân tích báo cáo: Một số kiến thức cần nhớ ... kích thước khác nhau, phân tử có kích thước q lớn hay q nhỏ khơng phân tách được, khơng phân tách nu chạy nhau, không tách , thể VẠCH thang ( tập trung nhiều nu tập trung không phân tách) Nhưng kích... phosphate, kích thước phân tử lớn chạy điện di chậm kích thước nhỏ - Nếu phân tử có khối lượng, phân tử có điện tích lớn di chuyển điện cực trái dấu nhanh - Có yếu tố phân tử Nu điện di mà ảnh... RE): nhận diện trình tự phân cắt phân tử nucleic acid vị trí chuyên biệt Hầu hết enzyme cắt giới hạn sinh học phân tử nhóm II có khả nhận diện cắt vị trí chuyên biệt Công dụng enzyme cắt giới