SINH HỌC PHÂN TỬ SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 1 HÓA MÔ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH U có nguồn gốc thần kinh nội tiết Synaptophysin Mô cơ trơn Actin Mô tuyến giáp Thyroglobulin Mô tuyến tiền liệt PSA Cặp đôi kháng thể CK7CK20 được dùng để chẩn đoán Xác định nguồn gốc các carcinoma di căn Phân biệt carcinoma tuyến và carcinoma gai Cặp đôi kháng thể kappalambda được dùng để chẩn đoán phân biệt tăng sản mô lympho lành tính với lymphoma Để đạt kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch tốt nhất, mẫu mô sau khi lấy.
SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 1: HĨA MƠ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH - U có nguồn gốc thần kinh nội tiết: Synaptophysin Mô trơn: Actin Mô tuyến giáp: Thyroglobulin Mô tuyến tiền liệt: PSA - Cặp đôi kháng thể CK7/CK20 dùng để chẩn đoán: o Xác định nguồn gốc carcinoma di o Phân biệt carcinoma tuyến carcinoma gai Cặp đôi kháng thể kappa/lambda dùng để chẩn đốn: phân biệt tăng sản mơ lympho lành tính với lymphoma - - Để đạt kết nhuộm hóa mơ miễn dịch tốt nhất, mẫu mơ sau lấy khỏi người bệnh nhân phải bỏ vào dung dịch cố định ngay, không lâu 30 phút - Kháng thể CK (cytokeratin) dùng để xác định mơ có nguồn gốc từ: biểu mơ - Kháng thể LCA dùng để xác định mơ có nguồn gốc từ: mô lympho - Để điều trị Ritixumab Lympho không Hodgkin, dựa vào xét nghiệm dương tính sau đây: CD20 (sẽ đáp ứng tốt với kháng thể đơn dòng) CD 30 dương tính rải rác mơ hạch có nghĩa gì: chẩn đốn bệnh Hodgkin (TB Reed-Sternberg) - - Để điều trị Trastuzumab bệnh ung thư vú, cần làm thêm xét nghiệm nào: nhuộm hóa mơ miễn dịch HER2 Để chẩn đoán phân biệt u lành u ác tuyến vú nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể nào: p.63, dương u nhú ống dẫn sữa, âm carcinoma vú dạng nhú - Để chẩn đoán u lành ác tiền liệt tuyến, nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể: p63đám tuyến ác tính cho phản ứng nhuộm âm tính - Để điều trị GLEEVEC u mô đệm đường tiêu hóa cần làm xét nghiệm nào: nhuộm hóa mơ miễn dịch CD117 SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 2: RỐI LOẠN GEN DO BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ - Cấu trúc nhiễm sắc thể: o Được cấu tạo ADN PROTEIN, mang thông tin di truyền, cần cho phát triển tế bào o NST có phần tâm centromere phần tận telomere o NST tâm lệch có nhánh p ngắn nhánh q dài o Tâm (metacentric): vai Tâm đầu (acrocentric): vai không Tâm mút (telocentric): tâm động nằm gần cuối - Cấu trúc chức Centromere nhiễm sắc thể o Là vị trí gắn kết chromatide o Có vai trị q trình phân bào - Cấu trúc chức Telomere nhiễm sắc thể o Là nắp tận NST o Duy trì cấu trúc nguyên vẹn NST o Giúp định vị NST o Đảm bảo việc mã hoàn tất - Chu kỳ tế bào o Gồm giai đoạn G1 10-12h, S 6-8h, G2 3-4h Mitosis 1h o Nhiễm sắc thể quan sát rõ kỳ M o Chu kỳ tế bào khoảng 24h - Khái niệm interphase metaphase o interphase giai đoạn chu kỳ tế bào, gồm S G1 G2, NST không quan sát o metaphase giai đoạn phân chia tế bào, NST cuộn nhiều dễ phân biệt o từ kỳ sau nguyên phân đến trước nhân đôi ADN giai đoạn S NST sợi đơn - Ưu điểm NST đồ: o phát bất thường NST SINH HỌC PHÂN TỬ - Khuyết điểm NST đồ: o đòi hỏi tế bào phải phân chia phải thu TB kỳ o băng NST > 10 Mb o kết vòng tuần, sớm ngày o phân tích khoảng 20-30 tế bào o không phát tái xếp ẩn, khuyếch đại gen - Ưu điểm kỹ thuật FISH: o phát khuếch đại gen o đoạn dò đặc hiệu nên phát tái xếp ẩn o cho kết nhanh 24g o phát bất thường NST tế bào không phân chia o phân tích nhiều tế bào 200-500 độ nhạy phát bất thường 1% o đoạn dò gắn huỳnh quang lai hóa với đoạn NST muốn khảo sát nằm tế bào - Khuyết điểm FISH o khơng phát bất thường kèm khơng quan sát tồn cấu trúc NST - Việc phát bất thường NST o Giúp chẩn đoán o Quyết định phác đồ o Đánh giá đáp ứng điều trị - Các loại bệnh phẩm ni cấy NST (trừ mẫu paraffin block) o Máu ngoại biên tủy xương o Dịch ối gai o U đặc o Nuôi cấy vong1-2h sau lấy mẫu, khơng làm đơng - Chất kích thích ni cấy NST o Tế bào B non: khơng dùng chất kích thích o Tế bào B trưởng thành: LPS, TPA, EBV - Ni cấy tế bào dịng tủy: IL3, 6, GM-SCF(tb bth phát triển) Ni cấy tế bào lympho T trưởng thành: PHA-M, pokeweed mitogen SINH HỌC PHÂN TỬ - Các yếu tố cần thiết nuôi cấy NST o Môi trường cấy RMPI 1640, MEM, HamF10 o Huyết phơi bị o Một số chất kích thích tùy loại tế bào cấy - Các yếu tố cần thiết môi trường nuôi cấy NST o Mẫu bệnh phẩm o Môi trường nuôi cấy o Nhiệt độ, độ ẩm - Các phương pháp nhuộm băng NST o Băng G: nhuộm Giêmsa, tập trung vùng nhiều AT, ưu tiên lưu tiêu lâu o Băng R: nhuộm vùng GC o Băng Q: nhuộm Quinacrine o Băng C: nhuộm centromere o Băng T: nhuộm telomere - Rối loạn gen hội chứng Down o Hiện diện thêm NST làm tăng biểu gen o SOD1 gây lão hóa sớm, giảm miễn dịch o DYRK làm chậm phát triển tâm thần o COL6A1 khiếm khuyết tim o CYA1 gây đục thủy tinh thể o ETS2 gây bất thường xương - Bất thường NST hội chứng Edwards o Có dạng bất thường NST trisomy 18, thể khảm thể chuyển vị NST 18 o Hơn 98% gây tử vong, sinh sống 1 NST X Đúng: o Tăng biểu GTP PB6 tương quan nghịch với khả ngôn ngữ tùy thuộc vào tăng thêm >1 NST X o Tăng biểu gen NST X làm giảm biểu gen chịu trách nhiệm sản xuất testosteron huyết tương o Thường gặp nam mang NST 47XXY, có kiểu hình nữ o - Tăng biểu XIST (X inactive-specific transcript ): bất hoạt¬ nhiều gen NST X KS tương tự người nữ (XX) Rối loạn gen đa bội o o Giảm biểu gen mã hóa Asparagine synthetase Tăng biểu gen SLC19A1 (mã hóa chất vận chuyển MTX vào tb)¬ NST 21 tăng tích tụ MTX polyglutamates tế bào (thường có 3, NST 21/đa bội) Tăng biểu gen proapoptotic CAS-P8AP2 NST 6q15¬ tế bào blast đa bội có xu hướng trải qua q trình chết theo chương trình tế bào cách tự phát rõ - Marker chromosome o NST bất thường chưa định danh o Khi xác định định danh bất thường - Ring chromosome o NST bị gãy đầu tận tự nối lại với - Các bất thường cấu trúc NST tạo tổ hợp gen, chọn câu sai: đoạn phần nhánh NST( làm giảm gen phần NST bị mất) o Chuyển vị cân o Đảo đoạn NST o Chèn đoạn NST (có thể tạo tổ hợp gen, tăng thêm phần gen) o Mất đoạn phần NST - Đồng NST o Tăng thêm lần phần gen, phần nhánh p,q đối xứng qua tâm o Tương tự trisomy o Tùy điểm gãy có chứa centromere khơng, nhân đơi NST có centromere SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 3: BẤT THƯỜNG NST VÀ GEN TRONG HUYẾT HỌC o o o o o Rối loạn tăng sinh tủy MPN Bạch cầu cấp dòng tủy AML Bạch cầu cấp dòng lympho ALL Lymphoma Đa u tủy Rối loạn tăng sinh tủy MPN t(9,22) Bạch cầu cấp dòng tủy AML t(8,21) BCR/ABL CML ALL Philadelphia t(15,17) Đb kháng Imatinib JAK2V617F AML1/ETO cKIT AML-M3 PML (15) RARA(17) Inv(16) - Kỹ thuật phát gen ( BCR22/ABL9) không dùng FISH o RT-PCR o RQ-PCR - Tổ hợp gen BCR/ABL o Điểm gãy major tạo kiểu b2a2 b3a2 o Gãy miner tạo kiểu e1a2 gây ALL - Chuyển vị t(9,22) o Gặp CML ALL o Tạo tổ hợp gen BCR/ABL NST 22 o Phát NST FISH tìm NST Philadelphia SINH HỌC PHÂN TỬ - Đột biến kháng Imatinib CML o Thường gặp đột biến thay đổi nucleotide (TAC-CAC)(GAG-AAG) o Có 30 vị trí 44 loại đột biến o Phát giải trình tự ASO-PCR o Dựa vào kiểu đột biến để định tăng lều hay ngưng Imatinib o Đột biến T315I đột biến kháng mạnh với Imatinib - Theo dõi CML o Huyết đồ dùng đánh giá đáp ứng mặt huyết học o NST Phil đánh giá mặt di truyền: đếm tỉ lệ tế bào mang NST o Về mặt sinh học phân tử: Đo số copy BCR/ABL - Kỹ thuật phát nhiễm sắc thể Phil22 o Nhiễm sắc thể đồ o FISH - Kỹ thuật phát đột biến JAK2V617F o Giải trình tự gen o PCR (Mức độ NST làm NST đô FISF, mức độ gen làm PCR giải trình tự) - Đột biến p.V617F gen JAK2 hội chứng tăng sinh tủy thuộc loại đột biến o Thêm chức (đột biến H2 điều hòa ngược H2 lên H1, làm tăng đáp ứng với epo) - Đột biến thêm chức gen JAK2 gây rối loạn tăng sinh tủy o Tập trung vào vùng exon 12-15, nhiều codon 617 o Gặp đa hồng cầu nguyên phát (codon 617 chiếm 97%, tăng tiểu cầu nguyên phát 60% xơ tủy nguyên phát 60%) - Chuyển vị t(8,21) (sai phát giải trình tự) o Phát FISH, NST đồ o Gặp AML o Bệnh nhân có tiên lượng tốt khơng có đột biến gen cKIT o Tạo tổ hợp gen AML1/ETO SINH HỌC PHÂN TỬ - Phân nhóm nguy AML o Phân nhóm theo bất thường NST, gen o Chia làm nhóm tốt, trung bình xấu - Chuyển vị t(15,17)(q22,q12) o Đặc hiệu cho AML-M3 o PML (15q22) RARA(17q12) o Tạo tổ hợp gen nằm NST 15 (PML15/RARA17) o Thuộc nhớm có tiên lượng tốt o PML đích tác dụng ATO, làm tế bào vào chu trình chết tự nhiên o RARA đích tác dụng ATRA , làm tế bào biệt hóa - Các gen đột biến có giá trị tiên lượng AML o cKIT: tb o NMP1: nặng o FLT3: nặng - Bất thường NST có giá trị tiên lượng tốt AML o t(8,21) o Inv(16) o t(15,17) Phân nhóm nguy AML theo bất thường NST gen: o Tốt t(8,21) inv(16) t(15,17) o Trung bình: NST đồ bình thường o Xấu: bất thường phức tạp - - Đột biến kháng Imatinib BML o Thường gặp đột biến thay đổi nucleotide - Bất thường NST có giá trị tiên lượng tốt ALL o t(12,21) SINH HỌC PHÂN TỬ o - đa bội > 50 tế bào Bất thường NST ĐA U TỦY o Gặp 85% trường hợp lúc chẩn đoán o t (11,14) chuyển vị thường gặp chuyển vị liên quan 14q32 o Giúp phân nhóm quy o Bất thường cấu trúc số lượng NST SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 4: GIỚI THIỆU VÊ ĐỘT BIẾN GEN - Đột biến gen gây bệnh gặp trường hợp sau: Bệnh ung thư Bệnh di truyền Bệnh tim mạch, phì đại tim bẩm sinh, hội chứng Brugada gây rối loạn nhịp - Khái niệm gen o Exon phần gen lưu lại ARN mã hóa khơng mã hóa aa o Intron phần khơng mã hóa (IVS) bắt đầu GT kết thúc AG o Codon ba nucleotide mã hóa cho aa, khởi đầu ATG o Chiều gen 5’-3’ - Đột biến gen: thay đổi trình tự nucleotide gen - Phân loại theo cấu trúc o Deletion (in-frame?) o Insertion o Thay thế: im lặng (không đổi aa), sai nghĩa (đổi aa), vô nghĩa (stop codon) o Phức tạp - Phân loại theo chức năng: thêm, - Chọn câu sai nói đột biến gen: bệnh b-Thalass đột biến đoạn o Đột biến thêm chức thường tập trung vùng nóng gen (hotspot) o Bệnh alpha Thalassemie đột biến đoạn, b Thalass đột biến điểm o Các rối loạn nhịp tim đột biến gen gây nên o Các đột biến gen gây hội chứng thực bào máu không giống chủng tộc - Chọn câu sai: đột biến vùng intron không gây bệnh o Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson (gen lặn, NST thường, đột biến 21 exon gen, lắng đọng đồng mô, triệu chứng tâm thần, thần kinh, gan) o Đột biến thêm nucleotide bảo tồn khung đọc o Đột biến vô nghĩa thay aa mã dừng (stop codon) TAA TAG TGA - Đột biến chức gen ATP7B gây bệnh Wilson, chọn câu sai: đb tập trung vùng exon11 o Đột biến phân tán khắp chiều dài gen o Làm giảm, chức ATP7B việc thải đồng vào tiểu quản mật gan o Xác định đột biến góp phần chẩn đốn bệnh Để phát đột biến gen gây bệnh dân số nghiên cứu mới, kỹ thuật nên chọn - SINH HỌC PHÂN TỬ PCR giải trình tự Chọn câu sai: tất đột biến gen gây bệnh o Các đột biến gen gây bệnh thường xảy exon o Trong hội chứng nhiều đột biến gen gây nên o Đột biến JAK2 tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng tủy tăng sinh o Đột biến BRCA1 giúp đánh giá nguy K vú gia đình o Đột biến gen globine giúp chẩn đoán bệnh Thalassemie Đột biến p.V617F gen JAK2 hội chứng tăng sinh tủy o Đột biến thêm chức o Đột biến H2, điều hòa ngược H1 lên H2, tăng đáp ứng với EPO Đột biến thêm chức gen JAK2 gây rối loạn tăng sinh tủy, chọn câu sai: phổ đột biến phân tán exon JAK2 ĐÚNG: o Tập trung vùng exon 12-15, nhiều codon 617 o Gặp đa hồng cầu nguyên phát o Phát ASO-PCR, giải trình tự gen Bản chất đột biến p.E746_A750del gen EGFR ung thư phổi o Mất aminoacid từ E746 đến A750 (E: glutamate, A: Alanin) Đột biến gặp bệnh X-link agammaglobulinemia o Đột biến chức phân bố khắp chiều dài gen o Đột biến thêm chưc thường tập trung o Đột biến sai nghĩa 19 exon gen BTK o Không tạo tế bào B trưởng thành làm thiếu hụt kháng thể máu Đột biến gen gây cản trở trình trưởng thành tế bào B bênh thiếu gammaglobulin liên kết NST X o Gen BTK Đột biến IVS12+1G>A gen BTG o Thay G A vị trí intron 12 o - - - - - - - Trong PCR giải trình tử chuỗi ADN để chẩn đốn đột biến gen, đặc tính quan trọng polymerase o Có tính sửa sai để đảm bảo tính trung thực cao SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 5: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ UNG THƯ - Phát biểu không đúng: đột biến gen gây ung thư nên ung thư bệnh di truyền o Chẩn đoán xác định ung thư thường chẩn đoán giải phẫu bệnh o Chẩn đoán đột biến gen giúp chia nhóm bệnh ung thư sâu o Trong loại ung thư mang nhiều loại gen đột biến - Kiểu đột biến thường gặp ung thư: o Đột biến chức đè nén khối u P53 kèm với tăng chức gen tiền sinh ung KRAS - Gen đè nén khối u P53 (giúp tế bào apoptosis) bị đột biến loại ung thư o Ung thư gan aflatoxin B1 o Ung thư phổi khói thuốc o Ung thư cổ tử cung ung thư buồng trứng P53-> ty thể (cytochrome C) -> apoptosis - Đột biến gen KRAS gặp ung thư o Ung thư đại tràng o Ung thư phổi o Ung thư tụy - Trong diễn biến ung thư biểu mô, biểu protein FAK SCR cao giai đoạn o Xâm lấn di - Phân chia theo chế phân tử, ung thư vú xếp vào nhóm sau o Nhóm có biểu thụ thể Estrogen 60-70% o Nhóm có khuếch đại gen HER2 20- 30% o Nhóm có đột biến gen BRCA1 BRCA2 5- 10% - Cần xác định kháng nguyên ER PR ung thư vú để o Điều trị nội tiết tố - Để phát kiểu đột biến đa dạng gen BRCA1 ung thư vú gia đình, kỹ thuật phù hợp o Giải trình tự AND sản phẩm PCR - Để điều trị Trastuzumab (Hercetin) bệnh ung thư vú, cần làm xét nghiệm o Nhm hóa mơ miễn dịch với HER2 o FISH - Trong ung thư, phát đột biến gen có ý nghĩa o Tiên lượng bệnh BCC dòng tủy AML o Đánh giá nguy mắc bệnh K vú gia đình o Lựa chọn điều trị nhắm trúng đích K phổi SINH HỌC PHÂN TỬ - Trong bệnh ung thư vú gia đình, đột biến gen gây tăng nguy K vú đáng kể o Đột biến gen BRCA1 BRCA2 : mang gen bệnh 80% nguy ung thư vú o Đột biến mầm, chiếm 5% o Mang gen nên tầm soát siêu âm, MRI, chụp nhũ ảnh Can thiệp ngừa: Tamoxiphene, đoạn nhũ, cắt buồng trứng - Về đột biến EGFR ung thư phổi không tế bào nhỏ o Các đột biến chẩn đốn kỹ thuật PCR giải trình tự chuỗi ADN - Là đích điều trị crizotinib, gen tổ hợp EML4/ALK đảo đoạn NST2 phát loại ung thư o Ung thư phổi không tế bào nhỏ o Gen tổ hợp đảo đoạn NST2 o Tỉ lệ 10% - Đột biến EGFR ung thư phổi không tế bào nhỏ thường xảy exon nào: o Exon 19, 21 (tập trung exon 18-21) o Gefitinib, Erlotinib (ức chế phân tử nhỏ) thường nhạy với đột biến exon 19,21 o T790 exon 20 gây kháng thuốc o Có thể kèm với đột biến KRAS - Đột biến codon 12 gen sau gây kháng thuốc với điều trị nhắm trung đích phân tử EGFR ung thư đại trực tràng: o Gen KRAS o Khi K đại trực tràng làm xn tìm db KRAS khơng có đột biến dùng cetuximab (kháng thể đơn dịng) - Trong u mơ đệm đường tiêu hóa GIST, đột biến gen cKIT đích điều trị imitanib thường xảy exon 11 (9, 11, 13, 17) o Đột biến cKIT PDGFRA kháng Imatinib - Thuốc nhắm trúng đích phân tử EGFR o K Đại trực tràng: kháng thể đơn dòng o K phổi không tế bào nhỏ: chặn nội bào -> dễ đột biến SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 6: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ DI TRUYỀN - Các bệnh lý di truyền thường gặp: o Rối loạn đơn gen (Mendel) o Sai lệch, bất thường bên NST o RL đa nhân tố: tương tác từ gen trở lên với môi trường - Di truyền lặn NST thường: o Thalassemia o HC liềm o Tăng sinh thượng thận bẩm sinh o Xơ nang tụy o Phenyl ketone niệu o Bạch tạng o Thối hóa tủy (NST5) SMA Đột biến gen SMN1 Dạng chủ yếu đột biến đoạn gen 94-99%, exon Thối hóa tế bào sừng trước tủy sống, yếu đối xứng, biến dạng lồng ngực cứng khớp CK tăng nhẹ hoạc không tăng (khác LDC Duchenne) tổn thương tk-> điện đồ Kỹ thuật PCR-RFLP LÂM SÀNG CỦA SMA1 - Xuất trước tháng Khóc bé, nuốt kém, yếu cơ, trương lực kém, cử động, phản xạ gân xương Tử vong trước tuổi viêm phổi suy hô hấp SINH HỌC PHÂN TỬ - Di truyền lặn NST giới tính: o Hemophilia o Loạn dưỡng Duchene o Loạn sản ngoại bì o Mù màu o Hội chứng X dễ gãy o Hội chứng Lesch Nyhan - Di truyền trội NST thường o Loạn sản sụn bẩm sinh Đột biến gen FGFR thuộc NST Đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao Chẩn đốn: phân tích phả hệ kỹ thuật RFLP, giải trình tự gen - Hemoglobin người trưởng thành HbA2 cấu thành bởi: chuỗi α chuỗi β Bệnh Thalassemia giảm khả tông hợp chuỗi globin, làm giảm số lượng chuỗi globin - Trong, điện di α hemoglobin ta thấy kết quả: HbA1 giảm, HbA2 giảm, HbF giảm Trong β Thalassemia điện di Hemoglobin ta thấy kết quả: HbA1 giảm, HbA2 tăng, HbF tăng - Đột biến chủ yếu α Thalassemia đột biến đoạn lớn, KỸ THUẬT : Gap-PCR, MLPA) Đột biến chủ yếu β Thalassemia đột biến điểm (AMRS-PCR, giải trinh tự) Bệnh α Thalassemia thiếu chuỗi α globin hồng cầu đột biến làm giảm tơng hợp chuỗi α globin - Nhiễm sắc thể 11 chứa gen β globin, nhiễm sắc thể 16 chứa gen α globin - Bệnh xương thủy tinh đột biến gen: COL1A2 Dạng đột biến chủ yếu gen yếu tố IX: o Đột biến điểm o Gây bệnh Hemophilia B BÀI 7: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ NHIỄM TRÙNG - Kỹ thuật SHPT bệnh lý nhiễm nhằm: o Phát kháng nguyên đặc hiệu tác nhân gây bệnh (acide nucleic đặc hiệu) - Xét nghiệm SHPT giúp: o Khẳng định kết nuôi cấy SINH HỌC PHÂN TỬ o o Phát tác nhân nuôi cấy thường quy Phát tác nhân cho kết nuôi cấy chậm - Xét nghiệm SHPT bệnh nhiễm giúp: o Phát tác nhân gây bệnh bệnh phẩm o Số copy/ml o Kiểu genotype - Kỹ thuật phát trực tiếp tác nhân gây bệnh nhờ sử dụng o Lai phân tử đoạn dị đánh dấu với ADN đích hay ARN đích, FISH - Nhóm kỹ thuật khuếch đại acd nucleic o KĐ đoạn dò LCR (Ligase chain reaction) o KĐ tín hiệu (branched AND technology) o KĐ ADN hay ARN đích: chu kỳ nhiệt PCR, đẳng nhiệt - Khuếch đại ARN đích phản ứng: o RT PCR - RT PCR o Khuếch đại tác nhân có gen ARN o Sao chép ngược từ ARN thành cADN - RT PCR là: o Reverse transcription PCR o Chỉ khảo sát exon o Quan trọng khảo sát gen tổ hợp biểu gen o Bệnh phẩm không dùng chống đông, bảo quản sepasol - Phản ứng PCR o Có độ đặc hiệu tương đương với phương pháp nuôi cấy o Được Kary Mullis mô tả 1983 xuất tạp chí Science 1985 o Là phản ứng nhân đoạn ADN đích với enzym polymerase o Thực ống nghiệm - Hạn chế PCR o Phát sản phẩm dựa kích thước sản phẩm o Phải xử lý sau PCR nên dễ ngoại nhiễm o Chạy gel nhờ Ethidium bromide chất có khả gây ung thư o Phải sử dụng polymerase có hoạt tính sửa sai cần giải trình tự chuỗi ADN - Realtime PCR cơng cụ phát tác nhân gây bệnh thích hợp nhất: o Tránh ngoại nhiễm o Đơn giản nhanh chóng, dễ phân tích kết o Độ nhạy độ đặc hiệu tốt PCR SINH HỌC PHÂN TỬ o - Có thể định lượng phạm vi lớn Tín hiệu huỳnh quang thường sử dụng Realtime PCR o SYBR GREEN1 (chèn vào sợi đôi ADN phát huỳnh quang) o Đoạn dị Taqman (probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang) o Đoạn dò Beacon SINH HỌC PHÂN TỬ - Cho biết phản ứng PCR nhiệt độ thích hợp cho biến tính ADN: 94 - độ Cho biết phản ứng PCR nhiệt độ thích hợp cho men polymerase hoạt - động: 72 độ Cho biết phản ứng PCR nhiệt độ thích hợp cho bắt cặp mồi - vào sợi đích: 55- 65 độ Độ đặc hiệu thử nghiệm PCR tùy thuộc vào: o Thiết kế mồi có đặc hiệu khơng o Nhiệt độ bắt cặp mồi có tối ưu khơng o Có chống ngoại nhiễm khơng Cho biết lượng DNA đích tối thiểu mà PCR có khả phát bao nhiêu: pg Chiều mồi primer từ chiều: 5’ đến 3’ Trong giai đoạn kéo dài men taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung bắt đầu nguồn từ - đầu mồi 3’ Một bệnh nhân bị viêm gan cấp, HBsAg(+) nên làm xét nghiệm để chẩn đốn bệnh - nhân có bị viêm gan cấp HBV hay không o HBV- ADN o HBeAg Bệnh nhận có HBsAg (+) xét nghiệm đánh giá người carrier - người có nguy bị viêm gan B mạn tính: HBV- ADN định lượng+ ALT Đo tải lượng virus viêm gan B cần làm xét nghiệm sau đây: realtime PCR-HBV - DNA Realtime PCR: PCR theo dõi máy luân nhiệt theo chu kỳ nhiệt Đơn vị tải lượng virus realtime PCR là: copies/ml, UI/ml - SINH HỌC PHÂN TỬ - Xét nghiệm đột biến precore core promoter nên định bệnh nhân nào: o Khi bệnh nhân bắt đầu điều trị thuốc kháng virus để định có điều trị suốt đời cho bệnh nhân hay không o Khi bệnh nhân điều trị hiệu quả, bổng dưng HBV-DNA (+) trở lại, đồng - thời HBeAg (-) anti HBeAg(+/-) Ưu điểm vượt trội để anh chị chọn kỹ thuật giải trình tự phát đột biến - precore core promoter o Phát đột biến G1896A precore, A1762T G1764A promoter o Đồng thời cho biết genotype HBV Tại anh chị phải quan tâm đến đột biến core precore bệnh nhân viêm gan B mạn tính điều trị thuốc kháng virus o Tại đột biến điểm HBV kháng thuốc điều trị o Đột biến điểm cho tác nhân HBV có nguy ung thư gan địi hỏi bệnh - nhân phải điều trị thuốc kháng virus suốt đời Đứng trước bệnh nhân có anti-HCV(+) HCV-ARN(+) trước tiến hành điều trị cho bệnh nhân phác đồ điều trị đặc hiệu, anh chị nên làm xét nghiệm nào: HCV-ARN - định lượng kết hợp HCV genotype Chẩn đoán viêm gan C thường dựa vào vùng gen để khuếch đại acid nucleic: - vùng 5’UTR Tại phải xét nghiệm genotype trước điều trị HCV: để định thời gian điều - trị Kỹ thuật xét nghiệm sau coi xác để xác định genotype HCV: giải - trình tự Để xem bn nhiễm HCV có đáp ứng sớm với điều trị hay không, sau điều trị đặc hiệu bệnh nhân, anh chị cho định định lượng HCV: 12 tuần (3 tháng) - Trong điều trị viêm gan virus C, dựa vào kết định lượng HCV-RNA để - biết bệnh nhân có đáp ứng virus sớm? o Giảm 100 lần (>2 log) sau tháng điều trị Để xem bn nhiễm HCV có đáp ứng điều trị hay không, sau điều trị đặc hiệu - - bệnh nhân, anh chị cho định định lượng HCV: tháng sau bắt đầu điều trị Khi điều trị bệnh nhân HCV o Men gan ALT tăng gấp đơi bình thường o Định lượng HCV Thế ngoại nhiễm chéo: ngoại nhiễm mẫu dương bị nhiễm vào mẫu âm Thế bào ngoại nhiễm PCR carry-over: ngoại nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) vào PCR mix Phương pháp tránh ngoại nhiễm chéo: o huấn luyện tốt để có thao tác khơng nhiễm chéo SINH HỌC PHÂN TỬ o Tách biệt vùng làm việc với tránh dùng lẫn sản phẩm, dụng cụ - vùng Dùng PCR mix có dUTP UDG Phương pháp để tránh ngoại nhiễm PCR carry-over: o Dùng PCR mix có dUTP UDG Khi cho dUTP vào PCR mix làm cho sản phẩm khuếch đại có mang - nucleotide U thay cho vị trí nucleotide cho sản phẩm PCR: T Một kết PCR bắt buộc phải hiển thị kết có khuếch đại chứng nội o - - dương: o Để chứng minh khâu khuếch đại đạt độ nhạy Một kết PCR bắt buộc phải hiển thị kết có khuếch đại chứng nội âm: o Khâu chiết tách khuếch đại đạt độ nhạy o Q trình làm xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm - Một kết xét nghiệm PCR kết luận (-) bắt buộc phải hiển thị có chứng nội mẫu để làm gì: chứng minh mẫu cho kết âm tính thật khơng phải âm tính bị ức chế - Một kết xét nghiệm PCR định lượng (realtime PCR hay qPCR) có hiển thị biểu đồ chuẩn với chuẩn mẫu thử để làm gì: o Chứng minh thử nghiệm định lượng có thực với chuẩn lúc với mẫu, (chứ với chuẩn trước đó) ... Thuốc nhắm trúng đích phân tử EGFR o K Đại trực tràng: kháng thể đơn dịng o K phổi khơng tế bào nhỏ: chặn nội bào -> dễ đột biến SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 6: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ DI... Trong PCR giải trình tử chuỗi ADN để chẩn đốn đột biến gen, đặc tính quan trọng polymerase o Có tính sửa sai để đảm bảo tính trung thực cao SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 5: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ... trúc số lượng NST SINH HỌC PHÂN TỬ BÀI 4: GIỚI THIỆU VÊ ĐỘT BIẾN GEN - Đột biến gen gây bệnh gặp trường hợp sau: Bệnh ung thư Bệnh di truyền Bệnh tim mạch, phì đại tim bẩm sinh, hội chứng