Báo cáo thực tập sinh học phân tử

BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ THỰC NGHIỆM I QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM CHUNG II NGUYÊN TẮC VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGUYÊN TẮC Bước 1: PCR thu nhận gen EPN Mỗi nhóm tiến hành đặt phản ứng PCR vào eppendorf 0,2ml (kèm theo mẫu chứng âm) biết nồng độ dung dịch mẹ nồng độ cuối hóa chất phản ứng sau: Hóa chất Nồng độ cuối Mạch khn µl Buffer µl MgCl2 µl dNTPs µl Mồi F µl Mồi R µl Taq polymerase 0.5 µl Nước 28.5 µl Tổng thể tích 50 µl Đậy chặt nắp eppendorf, trộn kỹ cách búng nhẹ hay huyền phù pipet, spin kéo mẫu xuống đặt vào máy PCR Chu kỳ nhiệt: - PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật sử dụng để khuếch đại đoạn DNA sản xuất nhân nhiều mẫu DNA giống theo cấp lũy thừa dựa mạch khuôn - Các thành phần cần thiết: • DNA mạch khn • Mồi F (mồi xi) R (mồi ngược) • dNTPs • MgCl2 chứa ion Mg2+ cofactor DNA polymerase • DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) • Buffer giúp ổn định môi trường - Phương pháp PCR dựa chu kỳ nhiệt, bao gồm giai đoạn: biến tính, bắt cặp mồi, tổng hợp mạch - Giai đoạn biến tính + Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu tất thành phần khác đun nóng đến 95⁰C + Nhiệt độ cao làm liên kết hydro base hai chuỗi DNA khuôn bị phá vỡ, sợi tách rời hoạt động khuôn mẫu để tạo chuỗi DNA Nhiệt độ trì giai đoạn đủ lâu để đảm bảo sợi DNA tách hoàn toàn - Giai đoạn bắt cặp mồi + Nhiệt độ phản ứng giảm xuống 55°C 30s để mồi gắn vào sợi DNA đơn + Nếu nhiệt độ thấp, mồi gắn không đặc hiệu Nếu q cao, mồi khơng gắn - Giai đoạn tổng hợp Bước 2: Tách chiết plasmid phương pháp SDS kiềm Thu nhận toàn sinh khối vào eppendorf ly tâm dịch nuôi cấy 10000v/p phút Cho vào eppendorf chứa sinh khối 100ul dung dịch I, vortex đến sinh khối huyền phù Thêm 200ul dung dịch II, đảo nhẹ eppendorf 6-8 lần Sau thêm tiếp 150 ul dung dịch III, đảo 6-8 lần Li tâm 13000v/phút 10 phút, nhiệt độ phòng Thu dịch từ eppendorf vào eppendorf chứa sẵn 7ul RNAse, đảo nhẹ, ủ 37oC Ước tính thể tích dịch Cho vào eppendorf 1V phenol bão hòa TE pH 8:chloroform (tỉ lệ 1:1), đảo 6-8 lần, li tâm 10000v/phút, phút, to phòng Thu dịch vào eppendorf khác Ước tính thể tích dịch Cho vào eppendorf 1V chloroform, đảo 6-8 lần, li tâm 10000v/phút, phút, nhiệt độ phòng Thu dịch vào eppendorf khác Ứớc tính thể tích V dịch thu + Trong bước này, nhiệt độ tăng lên 72⁰C để chuỗi DNA tạo nhờ DNA polymerase cách sử dụng sợi gốc làm mẫu + DNA polymerase tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA khuôn cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung - Sau kết thúc chu kì cuối phải trì nhiệt độ khoảng 72oC 10 phút để đảm bảo tất DNA sợi đơn cịn lại tổng hợp hồn tồn Sau chuyển sang 4oC để bảo quản sản phẩm phản ứng - Sol I chứa: + 50mM glucose: tạo áp suất thẩm thấu giúp tế bào không bị vỡ + 25mM Tris HCl: giúp ổn định pH + 10mM EDTA: có vai trị bắt giữ Mg2+ khiến DNAse khơng hoạt động → Sol I có chức huyền phù tế bào, giúp cho sol II tiếp xúc với tế bào để phá màng tế bào - Sol II chứa 0,2N NaOH 1% SDS có vai trị phá màng tế bào, làm biến tính DNA protein - Sol III chứa 5M CH3COOH, CH3COONa có vai trị trung hịa Sol II, giúp DNA hồi tính Đồng thời sol III làm DNA có kích thước lớn (DNA genome) bị kết tủa, DNA plasmid tan dịch - Thu nhận dịch nổi, lúc dịch hỗn hợp gồm DNA plasmid, protein, RNA va2 RNAse Để thu DNA plasmid ta tiếp tục tiến hành loải bỏ tạp chất lại phenol chloroform: + DNA tích điện âm nhóm photphat nên tan nước mà không tan phenol phenol phân cực nước + Phenol có vai trị biến tính protein tách protein khỏi nước cách làm protein bộc lộ vùng kị nước để tan phenol + Kết li tâm, dung dịch thu tách thành lớp: lớp pha nước chứa DNA plasmid, lớp pha dung mơi hữu có chứa protein sản phẩm cần loại bỏ khác Thêm vào eppendorf 2.5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ tối thiểu 30 phút -30oC, li tâm 13000v/phút, 10 phút, 4oC Đổ bỏ dịch (lưu ý dung giấy thấm miệng eppendorf) Rửa tủa với 500ul ethanol 70% lạnh, li tâm 13000v/phút, 10 phút, 4oC Đổ bỏ dịch (lưu ý thấm dịch cịn sót lại eppendorf), phơi khơ tự nhiên hay ủ 50oC Hịa tủa vào 20µl nước cất vơ trùng Giữ -20oC Bước 3: Phân tích sản phẩm PCR điện di Nạp mẫu vào gel Trộn 5µl of DNA với 1µl loading dye (6X) (đã nhỏ sẵn lên paraffin), trộn pipet (tránh tạo bọt khí) Nạp µl mẫu vào giếng gel Mỗi gel chạy sản phẩm PCR chứa thang DNA mẫu chứng dương (do TG chuẩn bị) Mỗi gel chạy sản phẩm tách chiết plasmid chứa thang DNA, mẫu chứng dương plasmid chưa cắt mẫu plasmid cắt mở vòng (do TG chuẩn bị) Chạy điện di 135V 30-45 phút Ghi lại vị trí mẫu nhóm miếng gel Phân tích gel Ngâm gel ethidium bromide 10 phút, rửa lại nước Đặt gel lên bàn đèn soi UV Quan sát, chụp hình gel + Chloroform tan nước, giúp hỗ trợ phenol biến tính protein đồng thời trung hịa lượng phenol cịn dư - Thu nhận dịch phía có chứa plasmid với nồng độ thấp Để tăng nồng độ plasmid ta dùng ethanol ủ lạnh Ethanol tạo liên kết hydro với nước làm khả liến kết DNA plasmid với nước giảm tạo kết tủa Thu tủa hòa với 20µl nước ta nhận dung dịch có nồng độ plasmid cao ban đầu - Điện di DNA gel agarose kỹ thuật sử dụng để phân tách đoạn DNA dựa kích thước điện tích chúng điện trường - Hỗn hợp cần phân tách đổ vào giếng gel agarose Gel đặt dung dịch điện di TAE (Tris - Acetic acid - EDTA), đó: + Tris - Acetic acid có khả tách mạch DNA giúp cân pH môi trường + EDTA liên kết với ion Mg2+ cofactor DNAse giúp bảo vệ DNA - Dưới tác dụng điện trường, DNA chứa nhóm photphat tích điện (-) nên chúng di chuyển từ cực (-) sang cực (+) máy điện di tạo thành vạch khác Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước, cấu trúc điện tích phân tử DNA So sánh vạch với vạch thang DNA giúp nhận biết có mặt DNA mẫu hay không *Kết điện di sản phẩm PCR nhóm + Vị trí 1: Mẫu chứng dương + Vị trí 2: Mẫu chứng âm: xuất vạch tương tự chứng dương Bước 4: Cắt hạn chế plasmid Thực phản ứng cắt sau: Hóa chất Nồng độ mẹ Buffer µl EcoRV 1µl Plasmid 10 µl dH2O µl Tổng thể tích phản ứng 20 µl Bổ sung đầy đủ thành phần phản ứng Trộn búng nhẹ hay huyền phù pipet spin mẫu xuống Ủ 37oC, Bước 5: Phân tích sản phẩm cắt plasmid điện di Nạp µl mẫu sản phẩm cắt sau trộn với loading dye vào gel agarose Chạy điện di 135V 30-45 phút, nhuộm ethidium bromide xem bàn đèn soi UV Hình chụp điện di gửi qua email cho nhóm kèm thơng tin vị trí mẫu nhóm Ghi lại kết + Vị trí 3: Mẫu sản phẩm PCR: xuất vạch tương tự chứng dương mờ, chứng tỏ nồng độ DNA thu không cao - Mẫu chứng âm xuất vạch DNA q trình thao tác để PCR bị nhiễm DNA mạch khuôn - Plasmid pBluescript cắt enzyme cắt giới hạn EcoRV có vị trí cắt vùng MCS - Đây enzyme cắt đầu bằng, cắt plasmid vị trí xác định đầu dính tương ứng với gen mục tiêu cần nối vào - Nguyên tắc tương tự điện di sản phẩm PCR bước - Kết điện di sản phẩm cắt plasmid: + Vị trí (Chưa cắt): xuất vạch plasmid dạng vòng dạng xoắn + Vị trí (đã cắt): xuất vạch vạch vị trí số plasmid dạng thằng - Kết cho thấy plasmid cắt hết thành dạng thẳng, hiệu suất cắt cao nồng độ sản phẩm thấp nên vạch mờ Bước 6: Tinh chế sản phẩm PCR sản phẩm cắt Mỗi nhóm nhận lại 01 eppendorf chứa sản phẩm PCR (bài 1) Hút chuyển sản phẩm PCR sang epp 1.5ml Sau đó, bổ sung nước cất hai lần vào epp để đạt tổng thể tích 100μl Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1V, đảo 6-8 lần Li tâm 10000rpm phút nhiệt độ phòng Chuyển phần dịch sang epp 1.5ml Bổ sung 1/10 V dung dịch NaOAC 3M, pH 5.2, đảo Bổ sung ml ethanol tuyệt đối, lạnh, đảo ủ 30oC 30 phút Li tâm 13,000rpm 10 phút 40C Nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa 10 Bổ sung 500l ethanol 70%, lạnh Li tâm 13,000 rpm phút 4oC 11 Nhanh chóng, nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa làm khơ tủa 12 Hịa tan tủa 15l TE Bảo quản -20oC Nếu dùng ngay, hoà 15l nước Milli-Q giữ nhiệt độ phòng Thực tương tự sản phẩm cắt Bước 7: Thực phản ứng nối Chuẩn bị phản ứng nối biết thành phần sau: Plasmid cắt mở vịng 12 µl Gen A µl T4 DNA ligase buffer (10X) µl T4 DNA ligase (1U/µl) µl - Dịch sản phẩm PCR bao gồm enzyme Taq, DNA khuôn, mồi, muối, gen EPN - Dịch plasmid cắt bao gồm plasmid cắt, plasmid chưa cắt, plasmid đứt gãy, EcoRV - Để loại bỏ thành phần khác giữ lại plasmid cắt, ta tiến hành tinh nhờ chloroform NaOAc, chất làm giảm tính tan DNA plasmid, tạo tủa - Ethanol có lực với nước mạnh DNA làm giảm tính tan DNA tạo tủa - Plasmid cắt ủ với gen cần chuyển nối với nhờ enzyme nối T4 ligase, enzyme xúc tác để hình thành liên kết phosphodiester đầu sợi đơi đơn nhóm 3′-OH 5′-phosphate - Nếu trình nối xác, gen mục tiêu nối vào vị trí vùng MCS (nằm gen mã hóa enzyme β-galactosidase) Tổng thể tích phản ứng 20 µl Ủ 22°C Bước 8: Tạo tế bào có tính khả nạp Hút dịch ni cấy vào eppendorf, tiến hành li tâm 6000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch Lặp lại bước thêm lần Sau đó, thu tủa, cho CaCl2 vào epp, tiến hành li tâm, thu tủa Cho CaCl2 vào hòa tan tủa, đảo thêm glycerol 20%, ủ lạnh Bước 9: Biến nạp E coli Chuẩn bị epp ký hiệu “+” tên nhóm, chuyển 100µl tế bào khả nạp vào (huyền phù trước hút) Epp chứa phần tế bào khả nạp cịn lại ký hiệu “-“ tên nhóm Cho toàn sản phẩm nối vào epp “+”, trộn Để đá phút, sau sốc nhiệt 45oC 60 giây, tiếp tục để lạnh đá phút Cho 1ml môi trường LB vào eppendorf, lắc 37oC 30 phút Trãi 50µl dung dịch X-gal 20 mg/ml lên 02 đĩa LB ampicillin Ly tâm eppendorf biến nạp 6000rpm, phút, hút bỏ 1ml dịch để loại bớt môi trường Huyền phù sinh khối môi trường cịn lại trải tồn lên đĩa mơi trường LB có ampicillin-X-gal Lưu ý ghi đĩa “+” “-“ tên nhóm ngày thực lên mặt đĩa - Màng tế bào plasmid tích điện âm (do có nhóm photphat) nên cần sử dụng Ca2+ để liên kết với plasmid đưa plasmid lại gần màng tế bào giúp tăng khả DNA đưa vào tế bào - CaCl2 giúp thành tế bào vi khuẩn tăng khả thấm DNA ngoại lai - Glycerol bổ sung giúp tế bào không bị vỡ điều kiện nhiệt độ thấp - Khi tế bào bị sốc nhiệt nhiệt độ cao, màng tế bào bị lỏng tạo lỗ hổng, lúc DNA plasmid sát màng lọt vào tế bào Sau chuyển qua nhiệt độ thấp, lỗ hổng khép lại giữ plasmid - Các tế bào biến nạp chuyển vào môi trường dinh dưỡng 30 phút để gen chuyển có thời gian phiên mã dịch mã - Trong đĩa mơi trường trải có bổ sung ampicillin Plasmid pBluescript có chứa gen kháng ampicillin gen mã hóa enzyme β-galactosidase (có chức phân giải Xgal tạo thành khuẩn lạc màu xanh) → tế bào nhận plasmid gen mục tiêu có gen mục tiêu cát/nối khơng vị trí có khuẩn lạc màu xanh - Vị trí cắt EcoRV gen mã hóa β-galactosidase nên tế bào nhận plasmid chuyển gen thành cơng khung đọc gen β-galactosidase bị phá vỡ dẫn đến không tạo enzyme → khuẩn lạc có màu trắng - Những tế bào không nhận plasmid không kháng ampicillin nên không mọc khuẩn lạc *Kết biến nạp nhóm: - Đĩa (-): khơng có khuẩn lạc - Đĩa (+): có khuẩn lạc trắng chứng tỏ biến nạp thành công hiệu suất cao Chồng đĩa (úp ngược) lên gói lại Ủ 37oC, 18-24 Phân tích sản phẩm biến nạp Đếm số khuẩn lạc trắng xanh đĩa, phân tích hiệu suất biến nạp ... phương pháp SDS kiềm Thu nhận toàn sinh khối vào eppendorf ly tâm dịch nuôi cấy 10000v/p phút Cho vào eppendorf chứa sinh khối 100ul dung dịch I, vortex đến sinh khối huyền phù Thêm 200ul dung... cao ban đầu - Điện di DNA gel agarose kỹ thuật sử dụng để phân tách đoạn DNA dựa kích thước điện tích chúng điện trường - Hỗn hợp cần phân tách đổ vào giếng gel agarose Gel đặt dung dịch điện... máy điện di tạo thành vạch khác Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước, cấu trúc điện tích phân tử DNA So sánh vạch với vạch thang DNA giúp nhận biết có mặt DNA mẫu hay không *Kết điện di sản