BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬBài 2: Pha đệm điện diCác loại nồng độ thường được sử dụng trong sinh học phân tử: µgml, mM, µM, UµL…Tính nồng độ các hóa chất trong TBE 1x:Số mol Tris base = 1.08121.14 x 1000 ≈ 8.92 mmolNồng độ mol của Tris base = 8.92(0.1 ) = 89.2 mMSố mol acid boric = 0.5561.83 x 1000 ≈ 8.90 mmolNồng độ mol của acid boric = 8.900.1 = 89 mM Bài 3: Biến nạpGiải thích các bước:STTTiến hànhGiải thích mục đích1Lấy ống tế bào khả biến từ tủ 80oC, đặt vào hộp đá, ủ 510 phút cho hỗn hợp trong ống thành dạng lỏng.Hỗn hợp ở dạng lỏng mới pha trộn được ở các bước tiếp theo.2Để 40µL tế bào khả biến vào ống 1.5mL và bổ sung 2µL plasmid, trộn đều bằng cách đập nhẹ vào thành ống, để trong đá 10 phút.Tăng khả năng gặp nhau của plasmid và các tế bào khả biến.3Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC, ủ 1 phút, nhanh chóng chuyển ngay lại hộp đá để 12 phút Sốc nhiệt cho màng tế bào dãn ra để các plasmid đi vào tế bào4Bổ sung 950 µL LB lỏng, giữ ở trạng thái tĩnh trong 15 phút ở 37oC sau đó lắc trong 30 phút.Để tế bào ổn định lại.5Hút 50 µL dung dịch tế bào cho vào đĩa LB có bổ sung ampicilin, nhanh chóng gạt đều dung dịch tế bào trên mặt thành.Pha loãng dung dịch tế bào khả biến ban đầu 5000 lần, lấy 50 µl trải trên đĩa LB không có ampicilin.Chuyển các đĩa vào tủ ấm nuôi cấy qua đêm.Nuôi cấy vi khuẩn để đánh giá hiệu quả biến nạp. Bài 4: Tách plasmidSTTTiến hànhGiải thích tác dụng1Cho 1.5ml môi trường nuôi cấy qua đêm vào ống eppendorf, ly tâm 10000rpm 5’ – 4oC. Bỏ phần dịch nổi, để cặn tế bào khô.Thu tế bào để làm thí nghiệm2Hòa cặn trong 100µL Sol I → vortex → ủ nhiệt độ phòng 5 phút.Phá vỡ màng tế bào giải phóng các thành phần trong tế bào, EDTA ức chế hoạt động của các kim loại hóa trị II là coenzym của các enzym thủy phân nhờ đó bảo vệ DNA.3Thêm 200µL Sol II → đảo 3 lần, ủ trên đá 3 phút.Sol II có tác dụng tạo pH biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn.Đảo 3 lần để các sợi đôi tách hẳnỦ đá 3 phút để tránh Sol II kết tủa làm đứt gãy plasmid.4Thêm 150 µL Sol III → đảo 5 lần, ủ trên đá 5 phút. Tạo môi trường hồi tính ổn định lại DNA, các DNA plasmid có kích thước nhỏ hơn hồi tính nhanh hơn, còn DNA của vi khuẩn kích thước lớn hồi tính chậm nên kết tủa cùng SDS.5Ly tâm 12000rpm – 4oC – 10 phút → thu dịch trong được 400µL.Cặn là DNA của vi khuẩn nên không thu.6Bổ sung 1 thể tích phenol: chloroform:isoamyl (25:24:1) → vortexKết tủa protein7Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5 phút → thu dịch trong được 300µL.Loại bỏ protein8Thêm 0.6 thể tích isopropanol → đảo 35 lần, ủ nhiệt độ phòng 17 phútKết tủa các chuỗi acid nucleic tỷ trọng cao, các mảnh acid nucleic tỷ trọng thấp không bị kết tủa.9Ly tâm 12000rpm– 4oC – 15 phút → bỏ dịch nổiLoại bỏ các mảnh DNA tỷ trọng thấp trong dịch nổi10Bổ sung EtOH 70% lạnhLoại bỏ NaOH, SDS, CH3COOK 11Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5 phút → bỏ dịch nổi, để khô tủa.Bỏ dịch EtOH chứa tạp chấtCác phương pháp tách plasmid khác:Phương pháp đun sôi.Phương pháp dựa vào Lithium. Bài 5: Xác định nồng độ DNAKết quả:NhómNồng độ(ngµL)A260A280A260 A2802.1261252,2525,232,072.2159331,8815,42,072.3218643,7420,852,12.4139327,8613,62,05Nhận xét:Nồng độ DNA cao hơn hai tổ 2.2 và 2.4 nhờ thu được nhiều dung dịch hơn ở bước 7 nhưng tại bước 5 chỉ thu được 400µL dung dịch nên thấp hơn tổ 2.1Tỷ lệ A260 A280 là 2,1, cao nhất trong cả 4 tổ, tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,82,0 là đạt yêu cầu nên kết quả chưa đạt, có thể do DNA bị biến tính, đứt gãy, phân hủy một phần. Bài 6 : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.Để xử lý không hoàn toàn plasmid có thể giảm lượng enzym EcoRI vàhoặc giảm thời gian ủ.Để xử lý hoàn toàn plasmid có thể tăng lượng EcoRI vàhoặc tăng thời gian ủ.Bài 7 : PCR phân đoạn gen đặc hiệu.Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR:Thành phầnVai tròNồng độH2OMôi trường cho phản ứng xảy ra.Đệm 10X(MgCl2 20mM)Cân bằng pH cho hoạt động của enzym Taq polymerase.Ion Mg2+ là cofactor của enzym Taq polymerase.2 mMdNTP (2mM)Gồm 4 loại nucleotide là nguyên liệu để tổng hợp DNA215 mMM13F (10µM)Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào.23 µMM13R (10µM)Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào.23 µMTaq polymerase (2UµL)Xúc tác tổng hợp DNA có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.115 UµLDNA khuônKhuôn tổng hợp sợi bổ sungµgµLTính nồng độ DNA khuôn: Nồng độ DNA ở bài 5 là: 2186 µgµLLấy 3 µL DNA ở bài 5 chuyển sang phản ứng tách plasmid ở bài 6 và lấy sản phẩm pha loãng 2 lần thực hiện phản ứng PCR ở bài 7 nhưng kết quả điện di ở bài 9 cho thấy phản ứng không xảy ra hoàn toàn nên không thể tính chính xác lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR được. Bài 8: MULTIPLEX PCRThành phầnThể tích (µL)Nồng độH2O6Đệm 10X(MgCl2 20mM)1,52 mMdNTP (2mM)1215 mMMồi F1 (10µM)123 µMMồi R1 (10µM)123 µMMồi F2 (10µM)123 µMMồi R2 (10µM)123 µMTaq polymerase (2UµL)0,5115 UµLDNA khuôn2Tổng thể tích 15Tính nồng độ DNA khuôn: tương tự như bài 7 không thể tính chính xác được.Bài 9: Điện di các sản phẩm DNA trên gel AgrasoeThành phần và tác dụng của dye điện di:+ Glycerol : có tỷ trọng lớn kéo sản phẩm DNA xuống giếng nếu không DNA sẽ lơ lửng trên buffer mà không xuống được giếng.+ Chất chỉ thị màu (thường dùng Bromophenol Blue) di chuyển cùng với DNA để ta quan sát được quá trình điện di đã đi đến vị trí nào.+ EDTA: liên kết với các nhóm kim loại hóa trị II để tránh ảnh hưởng đến quá trình điện di, bảo vệ DNA.Thang chuẩn (marker) là một tập hợp các đoạn DNA đã biết trước kích thước do nhà sản xuất cung cấp, có nồng độ đủ cao để thấy được trên gel agarose khi điện di. Tác dụng: ước lượng được kích thước của DNA bằng mắt thường nhờ so sánh với vị trí của băng DNA tương ứng với marker.Bài 10: Phân tích kết quảBài 3 : Biến nạp: Số khuẩn lạc thu được:+ Đĩa có ampicillin: do gạt không đều và phần trung tâm mọc quá dày nên không thể đếm chính xác số lượng khuẩn lạc. Ước tính có khoảng 5000 khuẩn lạc.+ Đĩa không có ampicillin: 819 khuẩn lạc.Hiệu suất biến nạp = 5000(819 ×5000) ×100 ≈ 0,122%.So sánh kết quả biến nạp với các tổ trong nhóm:+ Số khuẩn lạc mọc trong môi trường không có ampicilin lớn nhất nhưng số khuẩn lạc trong môi trường có ampicillin lại ít hơn tổ 1 và tổ 2 có thể do các tổ còn lại để que gạt nóng (trong trường hợp mọc ít) hoặc nhiễm khuẩn đĩa làm vi khuẩn chết.+ Hiệu suất thấp hơn tổ 1 và tổ 2 nhưng do lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường bình thường lớn nên hiệu suất biến nạp như vậy có thể coi là đạt.Ảnh điện di: Bài 4: Tách plasmid.Ảnh điện di có 2 băng, băng đi xa hơn là dạng siêu xoắn của plasmid, băng đi ngắn hơn là các mảnh plasmid bị đứt gãy thành mạch thẳng do plasmid có ở dạng siêu xoắn có kích thước gọn đi được nhanh hơn dạng mạch thẳng bị đứt gãy.Đánh giá kết quả tách plasmid tốt hay không dựa vào băng dạng siêu xoắn phải đậm rõ nét, băng dạng đứt gãy mạch thẳng mờ, ngắn. Kết quả điện di của tổ: băng dạng siêu xoắn khá đậm nhưng băng dạng đứt gãy mạch thẳng cũng đậm và dài có thể do trong quá trình vận chuyển, pha trộn làm đứt gãy plasmid, còn sót lại enzym nuclease cắt plasmid, lẫn các mảnh DNA của vi khuẩn.Các bài 6,7,8 do không có thông tin về marker nên không xác định được kích thước DNA.Bài 6: Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.Sau khi điện di thu được 2 băng: một băng sắc nét đi xa hơn là DNA dạng vòng, băng còn lại là DNA dạng mạch thẳng.Kết quả như vậy cho thấy phản ứng xử lý không hoàn toàn do vẫn còn plasmid dạng vòng.Bài 7: PCR nhân đoạn gen đặc hiệuMẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm DNA, mẫu kiểm tra lên 1 băng mờ.Kết quả PCR lên băng mờ, không rõ có thể do nồng độ DNA sau phản ứng PCR thấp do DNA khuôn là kết quả từ bài 6 phản ứng xử lý không hoàn toàn, tra mẫu vào giếng không chính xác làm mẫu trôi ra ngoài.Bài 8: Multiplex PCRMẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm khuẩn, mẫu kiểm tra lên 2 băng mờ.Kết quả PCR lên đủ 2 băng cho thấy phản ứng PCR phản ứng tốt với hai cặp mồi nhưng hiệu quả chưa cao do thu được nồng độ DNA nhỏ khiến băng mờ hoặc tra DNA vào giếng chưa chính xác. Bài 9: Điện diSo với các tổ còn lại trong nhóm, tổ có hình ảnh điện di tốt hơn ở chứng âm không lên băng (tổ 2 chứng âm lên băng) và phản ứng PCR đặc hiệu hơn giúp lên băng chính xác (ở các nhóm còn lại multiplex PCR không lên băng, PCR đặc hiệu lên 2 băng có thể do bị nhiễm khuẩn), nhưng băng còn mờ chưa rõ nét và trong tách plasmid chưa xảy ra hoàn toàn.
Trang 1BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ
Bài 2: Pha đệm điện di
- Các loại nồng độ thường được sử dụng trong sinh học phân tử: µg/ml, mM,
µM, U/µL…
- Tính nồng độ các hóa chất trong TBE 1x:
Số mol Tris base = 121.141.08 x 1000 ≈ 8.92 mmol
Nồng độ mol của Tris base = 8.92
0.1 = 89.2 mM
Số mol acid boric = 61.830.55 x 1000 ≈ 8.90 mmol
Nồng độ mol của acid boric = 8.90
0.1 = 89 mM
Trang 2Bài 3: Biến nạp
Giải thích các bước:
ST
T
Tiến hành Giải thích mục đích
1 Lấy ống tế bào khả biến từ tủ -80oC, đặt
vào hộp đá, ủ 5-10 phút cho hỗn hợp trong ống thành dạng lỏng
Hỗn hợp ở dạng lỏng mới pha trộn được ở các bước tiếp theo
2 Để 40µL tế bào khả biến vào ống 1.5mL
và bổ sung 2µL plasmid, trộn đều bằng cách đập nhẹ vào thành ống, để trong
đá 10 phút
Tăng khả năng gặp nhau của plasmid và các tế bào khả biến
3 Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC, ủ 1
phút, nhanh chóng chuyển ngay lại hộp
đá để 1-2 phút
Sốc nhiệt cho màng tế bào dãn ra để các plasmid đi vào tế bào
4 Bổ sung 950 µL LB lỏng, giữ ở trạng
thái tĩnh trong 15 phút ở 37oC sau đó lắc trong 30 phút
Để tế bào ổn định lại
5 Hút 50 µL dung dịch tế bào cho vào đĩa
LB có bổ sung ampicilin, nhanh chóng gạt đều dung dịch tế bào trên mặt thành
Pha loãng dung dịch tế bào khả biến ban đầu 5000 lần, lấy 50 µl trải trên đĩa
LB không có ampicilin
Chuyển các đĩa vào tủ ấm nuôi cấy qua đêm
Nuôi cấy vi khuẩn để đánh giá hiệu quả biến nạp
Trang 3Bài 4: Tách plasmid
ST
T
Tiến hành Giải thích tác dụng
1 Cho 1.5ml môi trường nuôi
cấy qua đêm vào ống
eppendorf, ly tâm
10000rpm- 5’ – 4oC Bỏ
phần dịch nổi, để cặn tế bào
khô
Thu tế bào để làm thí nghiệm
2 Hòa cặn trong 100µL Sol I
→ vortex → ủ nhiệt độ
phòng 5 phút
Phá vỡ màng tế bào giải phóng các thành phần trong tế bào, EDTA ức chế hoạt động của các kim loại hóa trị II là coenzym của các enzym thủy phân nhờ đó bảo vệ DNA
3 Thêm 200µL Sol II → đảo 3
lần, ủ trên đá 3 phút
- Sol II có tác dụng tạo pH biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn
- Đảo 3 lần để các sợi đôi tách hẳn
- Ủ đá 3 phút để tránh Sol II kết tủa làm đứt gãy plasmid
4 Thêm 150 µL Sol III → đảo
5 lần, ủ trên đá 5 phút
Tạo môi trường hồi tính ổn định lại DNA, các DNA plasmid có kích thước nhỏ hơn hồi tính nhanh hơn, còn DNA của vi khuẩn kích thước lớn hồi tính chậm nên kết tủa cùng SDS
Trang 4phút → thu dịch trong được
300µL
8 Thêm 0.6 thể tích
isopropanol → đảo 3-5 lần,
ủ nhiệt độ phòng 17 phút
Kết tủa các chuỗi acid nucleic tỷ trọng cao, các mảnh acid nucleic tỷ trọng thấp không bị kết tủa
9 Ly tâm 12000rpm– 4oC – 15
phút → bỏ dịch nổi
Loại bỏ các mảnh DNA tỷ trọng thấp trong dịch nổi
10 Bổ sung EtOH 70% lạnh Loại bỏ NaOH, SDS, CH3COOK
11 Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5
phút → bỏ dịch nổi, để khô
tủa
Bỏ dịch EtOH chứa tạp chất
Các phương pháp tách plasmid khác:
- Phương pháp đun sôi
- Phương pháp dựa vào Lithium
Trang 5Bài 5: Xác định nồng độ DNA
Kết quả:
Nhóm Nồng độ
(ng/µL)
A260 A280 A260/ A280
Nhận xét:
Nồng độ DNA cao hơn hai tổ 2.2 và 2.4 nhờ thu được nhiều dung dịch hơn
ở bước 7 nhưng tại bước 5 chỉ thu được 400µL dung dịch nên thấp hơn tổ 2.1
Tỷ lệ A260/ A280 là 2,1, cao nhất trong cả 4 tổ, tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8-2,0 là đạt yêu cầu nên kết quả chưa đạt, có thể do DNA bị biến tính, đứt gãy, phân hủy một phần
Trang 6Bài 6 : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.
Để xử lý không hoàn toàn plasmid có thể giảm lượng enzym EcoRI và/hoặc giảm thời gian ủ
Để xử lý hoàn toàn plasmid có thể tăng lượng EcoRI và/hoặc tăng thời gian ủ
Bài 7 : PCR phân đoạn gen đặc hiệu.
- Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR:
H2O Môi trường cho phản ứng xảy ra
Đệm 10X
(MgCl2 20mM)
Cân bằng pH cho hoạt động của enzym Taq polymerase
Ion Mg2+ là cofactor của enzym Taq polymerase
2 mM
dNTP (2mM) Gồm 4 loại nucleotide là nguyên liệu để
tổng hợp DNA
2/15 mM
M13F (10µM) Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq
polymerase bám vào
2/3 µM
M13R (10µM) Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq
polymerase bám vào
2/3 µM
Taq polymerase
(2U/µL)
Xúc tác tổng hợp DNA có thể hoạt động ở nhiệt độ cao
1/15 U/µL DNA khuôn Khuôn tổng hợp sợi bổ sung µg/µL
Tính nồng độ DNA khuôn:
Nồng độ DNA ở bài 5 là: 2186 µg/µL
Lấy 3 µL DNA ở bài 5 chuyển sang phản ứng tách plasmid ở bài 6 và lấy sản phẩm pha loãng 2 lần thực hiện phản ứng PCR ở bài 7 nhưng kết quả điện di
ở bài 9 cho thấy phản ứng không xảy ra hoàn toàn nên không thể tính chính xác lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR được
Trang 7Bài 8: MULTIPLEX PCR
Thành phần Thể tích (µL) Nồng độ
Đệm 10X
(MgCl2 20mM)
Taq polymerase
(2U/µL)
Tổng thể tích 15
Tính nồng độ DNA khuôn: tương tự như bài 7 - không thể tính chính xác được
Bài 9: Điện di các sản phẩm DNA trên gel Agrasoe
- Thành phần và tác dụng của dye điện di:
+ Glycerol : có tỷ trọng lớn kéo sản phẩm DNA xuống giếng nếu không DNA sẽ lơ lửng trên buffer mà không xuống được giếng
+ Chất chỉ thị màu (thường dùng Bromophenol Blue) di chuyển cùng với DNA để ta quan sát được quá trình điện di đã đi đến vị trí nào
+ EDTA: liên kết với các nhóm kim loại hóa trị II để tránh ảnh hưởng đến quá trình điện di, bảo vệ DNA
- Thang chuẩn (marker) là một tập hợp các đoạn DNA đã biết trước kích
Trang 8- Số khuẩn lạc thu được:
+ Đĩa có ampicillin: do gạt không đều và phần trung tâm mọc quá dày nên không thể đếm chính xác số lượng khuẩn lạc Ước tính có khoảng
5000 khuẩn lạc
+ Đĩa không có ampicillin: 819 khuẩn lạc
- Hiệu suất biến nạp = 819× 50005000 ×100 ≈ 0,122%.
- So sánh kết quả biến nạp với các tổ trong nhóm:
+ Số khuẩn lạc mọc trong môi trường không có ampicilin lớn nhất nhưng số khuẩn lạc trong môi trường có ampicillin lại ít hơn tổ 1 và tổ 2 có thể do các tổ còn lại để que gạt nóng (trong trường hợp mọc ít) hoặc nhiễm khuẩn đĩa làm vi khuẩn chết
+ Hiệu suất thấp hơn tổ 1 và tổ 2 nhưng do lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường bình thường lớn nên hiệu suất biến nạp như vậy có thể coi là đạt
Ảnh điện di:
Trang 9 Bài 4: Tách plasmid.
- Ảnh điện di có 2 băng, băng đi xa hơn là dạng siêu xoắn của plasmid, băng đi ngắn hơn là các mảnh plasmid bị đứt gãy thành mạch thẳng do plasmid có ở dạng siêu xoắn có kích thước gọn đi được nhanh hơn dạng mạch thẳng bị đứt gãy
- Đánh giá kết quả tách plasmid tốt hay không dựa vào băng dạng siêu xoắn phải đậm rõ nét, băng dạng đứt gãy mạch thẳng mờ, ngắn Kết quả điện di của tổ: băng dạng siêu xoắn khá đậm nhưng băng dạng đứt gãy mạch thẳng cũng đậm và dài có thể do trong quá trình vận chuyển, pha trộn làm đứt gãy plasmid, còn sót lại enzym nuclease cắt plasmid, lẫn các mảnh DNA của vi khuẩn
Các bài 6,7,8 do không có thông tin về marker nên không xác định được kích thước DNA
Bài 6: Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn
- Sau khi điện di thu được 2 băng: một băng sắc nét đi xa hơn là DNA
Trang 10- Kết quả PCR lên băng mờ, không rõ có thể do nồng độ DNA sau phản ứng PCR thấp do DNA khuôn là kết quả từ bài 6 phản ứng xử lý không hoàn toàn, tra mẫu vào giếng không chính xác làm mẫu trôi ra ngoài
Bài 8: Multiplex PCR
- Mẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm khuẩn, mẫu kiểm tra lên 2 băng mờ
- Kết quả PCR lên đủ 2 băng cho thấy phản ứng PCR phản ứng tốt với hai cặp mồi nhưng hiệu quả chưa cao do thu được nồng độ DNA nhỏ khiến băng mờ hoặc tra DNA vào giếng chưa chính xác
Bài 9: Điện di
So với các tổ còn lại trong nhóm, tổ có hình ảnh điện di tốt hơn ở chứng
âm không lên băng (tổ 2 chứng âm lên băng) và phản ứng PCR đặc hiệu hơn giúp lên băng chính xác (ở các nhóm còn lại multiplex PCR không lên băng, PCR đặc hiệu lên 2 băng có thể do bị nhiễm khuẩn), nhưng băng còn mờ chưa rõ nét và trong tách plasmid chưa xảy ra hoàn toàn