TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ

GIỚI THIỆU MỘT SỐ ENZYME THÔNG DỤNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ Phạm Trần Đăng Thức ptdthuc@hcmus.edu.vn MỤC TIÊU Hiểu vai trò ý nghĩa số loại enzyme thông dụng SHPT  Biết cách thiết lập phản ứng enzyme CÁC NHÓM ENZYME • Nuclease • Ligase • Polymerase NUCLEASE NUCLEASE – ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZME) palindromic 5’-GGATCC-3’ Bam H1 site: 3’-CCTAGG-5’ ENZYME CẮT GIỚI HẠN (TT) ENZYME CẮT GIỚI HẠN (TT) Derivation of the EcoRI name Abbreviation Meaning Description E Escherichia genus co coli species R RY13 strain I First identified order of identification in the bacterium ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN RFLP ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN • TẠO PHÂN TỬ DNA TÁI TỒ HỢP LIGASE 10 POLYMERASE Taq polymerase – PCR thông thường Pfu polymerase – PCR thu nhận gene 11 THIẾT LẬP PHẢN ỨNG ENZYME + Enzyme thành phần cho sau + Tổng thể tích enzyme ≤ 1/10 tổng thể tích phản ứng + dd mẹ nX cần pha lõang thành 1X + Phản ứng phải ủ nhiệt độ thời gian phù hợp + Rnase họat động không cần đệm + Độ tinh DNA định hiệu phản ứng cắt giới hạn 12 THIẾT LẬP PHẢN ỨNG ENZYME 13 BÀI TẬP Thiết lập phản ứng thủy giải ng DNA plasmid enzyme BamHI, HindIII Biết: - Dung dịch plasmid có OD260 0.1 - unit BamHI/HindIII thủy giải 2.5 ng DNA plasmid - BamHI/HindIII sử dụng có nồng độ 1u/µl - dung dịch đệm thích hợp cho enzyme10X 14 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID 15 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID Xác định kích thước plasmid => cắt mở vòng plasmid 16 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN Nguyên nhân: Lượng DNA/enzyme Hoạt tính enzyme suy giảm Điều kiện thực phản ứng Complete Incomplete 17 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN 18 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG NỐI 19 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG THỦY GIẢI NUCLEIC ACID Rnase+ Rnase- 20 THỰC HÀNH Chuẩn bị dụng cụ hóa chất Bổ sung đủ thứ tự thành phần vào EPPENDORF 0.5 ML Nước cất plasmid enzyme buffer LY TÂM NGẮN để kéo thành phần xuống đáy ống Đặt phản ứng vào NHIỆT ĐỘ thích hợp Bổ sung dung dịch nạp mẫu dừng phản ứng Điện di phân tích kết THỰC HÀNH (TT) Nhóm 1-> 6: Đặt phản ứng cắt plasmid RE - DNA plasmid (pBS) ul - DD đệm (buffer) 10X ul - H2O 13 ul - RE ul (THÀNH PHẦN CHO VÀO SAU CÙNG) Ủ 1h 37oC Nhóm 7-8: Đặt phản ứng nối thang lamda HindIII với DNA T4 ligase -DNA lamda HindIII ul -DD đệm (buffer) 10X ul -H2O ul -DNA T4 ligase ul (THÀNH PHẦN CHO VÀO SAU CÙNG) Ủ 1h 16oC (ĐẶT TRÊN KHAY NƯỚC ĐÁ ĐANG TAN) Nhóm 9-10: Đặt phản ứng thủy giải RNA RNAse cho hỗn hợp DNA/RNA - DNA/RNA ul - RNAse A ul Ủ 30 phút 37oC Dùng dd nạp mẫu dừng phản ứng 22 [...]... 16 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN Nguyên nhân: Lượng DNA/enzyme Hoạt tính enzyme suy giảm Điều kiện thực hiện phản ứng Complete Incomplete 17 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN 18 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG NỐI 19 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG THỦY GIẢI NUCLEIC ACID Rnase+ Rnase- 20 THỰC HÀNH 1 Chuẩn bị dụng cụ hóa chất 2 Bổ sung đủ và đúng thứ tự các thành phần vào EPPENDORF 0.5 ML Nước cất... 13 BÀI TẬP Thiết lập phản ứng thủy giải 5 ng DNA plasmid bằng 2 enzyme BamHI, HindIII Biết: - Dung dịch plasmid có OD260 là 0.1 - 1 unit BamHI/HindIII thủy giải được 2.5 ng DNA plasmid - BamHI/HindIII sử dụng có nồng độ 1u/µl - dung dịch đệm thích hợp cho 2 enzyme10X 14 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID 15 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID Xác định kích thước plasmid => cắt mở vòng plasmid 16 PHÂN TÍCH... vào EPPENDORF 0.5 ML Nước cất plasmid enzyme buffer 1 LY TÂM NGẮN để kéo các thành phần xuống đáy ống 2 Đặt phản ứng vào NHIỆT ĐỘ thích hợp 3 Bổ sung dung dịch nạp mẫu dừng phản ứng 4 Điện di phân tích kết quả THỰC HÀNH (TT) Nhóm 1-> 6: Đặt phản ứng cắt plasmid bằng RE - DNA plasmid (pBS) 4 ul - DD đệm (buffer) 10X 2 ul - H2O 13 ul - RE 1 ul (THÀNH PHẦN CHO VÀO SAU CÙNG) Ủ 1h ở 37oC Nhóm 7-8: Đặt phản ... kiện thực phản ứng Complete Incomplete 17 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN 18 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG NỐI 19 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG THỦY GIẢI NUCLEIC ACID Rnase+ Rnase- 20 THỰC... dịch đệm thích hợp cho enzyme10X 14 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID 15 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID Xác định kích thước plasmid => cắt mở vòng plasmid 16 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT GIỚI... in the bacterium ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN RFLP ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN • TẠO PHÂN TỬ DNA TÁI TỒ HỢP LIGASE 10 POLYMERASE Taq polymerase – PCR thông thường Pfu polymerase – PCR