ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHÓ HÀ NỘI TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TÉ HÀ NỘI THỰC HÀNH VI SINH VẬT Y HỌC GIÁO TRÌNH DẠY/ HỌC củ’ NHÂN KỸ THUẬT Y CAO ĐẲNG HÀ NỘI 2009 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÁN ĐOÁN VI SINH VẬT BỆNH NHIỄM[.]
ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHÓ HÀ NỘI TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TÉ HÀ NỘI THỰC HÀNH VI SINH VẬT Y HỌC GIÁO TRÌNH DẠY/ HỌC củ’ NHÂN KỸ THUẬT Y CAO ĐẲNG HÀ NỘI - 2009 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÁN ĐOÁN VI SINH VẬT BỆNH NHIỄM KHUẤN Kết xét nghiệm vi sinh vật có giá trị chẩn đoán bệnh nguyên bệnh nhiễm trùng Chẩn đoán vi sinh vật xác định nguyên nhân: vi khuẩn, hoặc/ virus gây nhiễm trùng Có hai phương pháp chẩn đoán vi sinh vật bệnh nhiễm trùng chẩn đoán trực tiếp chẩn đoán gián tiếp Bài thực tập giới thiệu khái quát công việc hai phương pháp chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn Chẩn đoán bệnh nhiễm virus đề cập kỳ khác MỤC TIÊU HỌC TẬP Trình bày khái niệm phương pháp chẩn đoán vi sinh vật bệnh nhiễm khuẩn Trình bày bước thường áp dụng phương pháp chẩn đoán trực tiếp; nêu yêu cầu ý nghĩa bước Nêu nguyên tắc kể bước tiến hành phương pháp chẩn đoán gián tiếp Chẩn đốn trực tiếp: Là tìm vi khuẩn gây bệnh thể người bệnh Có thể tìm vi khuẩn hai cách khác nhau: chẩn đốn nhanh ni cấy xác định Tùy theo loại bệnh, tính chất cấp tính hay khả gây dịch tình trạng trang thiết bị phịng xét nghiệm mà áp dụng hai hay dừng lại chẩn đoán nhanh (bằng nhuộm soi đơn giản) Các bước phương pháp chẩn đốn trực tiếp là: 1.1 Lây bệnh phãm: Bệnh phẩm vật phẩm có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh Vì vậy, tùy theo loại bệnh mà lấy bệnh phẩm khác Bệnh phẩm phân (ở nhiễm khuẩn đường ruột), nước tiểu (ở nhiễm khuẩn đường tiết niệu), mủ (ví dụ vết thương), máu (ở nhiễm khuẩn máu), chất dịch (ví dụ dịch não tủy viêm màng não ) Để lấy bệnh phẩm tốt (có chứa vi khuẩn gây bệnh), phải đảm bảo nguyên tắc lấy bệnh phẩm, là: - Đúng chồ: vị trí có nhiều vi khuẩn Muốn phải nắm đường lan chuyền đào thải mầm bệnh, để định lấy bệnh phẩm - Đúng lúc: thời điểm có nhiều vi khuẩn bệnh phẩm - Trước dùng kháng sinh, sau dừng sử dụng kháng sinh 24 - Đảm bảo kỹ thuật vô trùng (không gây nhiễm trùng cho người bệnh không đưa vi khuẩn lạ vào bệnh phẩm) - Bệnh phẩm cần chuyển nhanh tới phòng xét nghiệm Nếu cần phải bảo quản bệnh phẩm mơi trường nhiệt độ thích họp 1.2 Nhuộm, soi (chân đoản nhanh): - Làm tiêu nhuộm từ bệnh phẩm để tìm vi khuẩn, dựa vào: hình thể, tính chất bắt màu, kích thước cách xếp; đánh giá loại tế bào mối quan hệ vi khuẩn với tế bào (vi khuẩn nằm hay tế bào) Thường nhuộm đơn nhuộm Gram - Làm tiêu soi tươi bệnh phẩm để tìm vi khuẩn dựa vào tính chất di động Kết nhuộm soi thường có giá trị chẩn đốn sơ định hướng cho ni cấy Nhưng sổ trường hợp có giá trị chẩ đoán định: Chẩn đoán bệnh giang mai, bệnh lậu nhuộm soi trực tiếp bệnh phẩm đường sinh dục Trong chẩn đốn số bệnh có giá trị tương đối định nhuộm hat nhiễm sắc chẩn đoán bệnh bạch hầu, chẩn đoán bệnh dịch hạch nhuộm bệnh phẩm hạch Đây phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp, rẻ tiền nhanh có kết Vì vậy, áp dụng tuyến y tế sở Hình Kính hiển vi đen Hình Kính hiển vi huỳnh quang - Ngày người cịn sử dụng chẩn đốn nhanh số kỹ thuật: + Kỹ thuật di truyền, PCR (polymease chain reaction) để phát gien đặc thù vi sinh vật + Kỳ thuật miễn dịch để phát kháng nguyên vi sinh vật, huỳnh quang trực tiếp, ELISA, ngưng kết thụ động Các phưong pháp chẩn đoán nhanh đặc biệt quan trọng với bệnh gây dịch đặc biệt bệnh virus (cúm gia cầm, SARS ) Tìm vi khuẩn sau q trình ni cấy xác định tính chất cho kết xác hơn, song yêu cầu thời gian lâu trang thiết bị phức tạp cách nhuộm soi Hình Test nhanh (a) Duong tính, (b) Âm tính 1.3 Ni cấy: - Phân lập: Là tách biệt vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm bệnh Tuỳ loại bệnh phẩm loại vi khuẩn mà người ta sử dụng loại môi trường phân lập thích họp Nhưng thường mơi trường thạch ( thạch máu, thạch thường ) sử dụng để cấy phân vùng nhằm tách biệt vi khuẩn Môi trường phân lập mơi trường ni cấy, ngồi chất dinh dưỡng cịn có thêm hóa chất đặc biệt, có tác dụng ức chế tạp khuẩn hay kích thích chọn lọc vi khuẩn cần tìm phát triển - Dựa vào tính chất khuẩn lạc (hình dạng, màu sắc, độ lớn) hoặc/và tính chất ni cấy khác mà nhận biết tách biệt vi khuẩn cần tìm thành dịng vi khuẩn - Tăng sinh: Đối với bệnh phẩm có vi khuẩn (ví dụ máu), người ta phải tăng sinh cấy vào mơi trường kích thích Sự phát triển 1.4 Xác định: Phải dựa vào nhiều đặc điểm khác để xác định vi khuẩn - Xác định tính chất sinh học : Ngồi việc xác định hình thể, tính chất bắt màu người ta cịn phải xác định tính chất hóa sinh vi khuẩn cách nuôi cấy vi khuẩn vào mơi trường khác Mơi trường xác định tính chất hóa sinh có chứa hóa chất đặc biệt để xác định khả chuyển hóa, sinh enzym, tạo sản phẩm chuyển hóa vi khuẩn - Xác định tính chất kháng nguyên (định typ huyết - Serotype): Dùng kháng thể biết (kháng huyết mẫu) để xác định kháng nguyên (thân, lông, vỏ) vi khuẩn, dựa vào phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu Vì vậy, xác định vi khuẩn cách có độ xác cao - Xác định tính chất ly giải phage (định typ ly giải - Lysotype): Dùng phage biết, xác định có ly giải vi khuẩn hay khơng ly giải Cách xác định có độ xác cao, song khó có chủng phaghe mẫu - Xác định khả gây bệnh thực nghiệm: cách tiêm truyền cho súc vật thí nghiệm (như chuột lang, thở, chuột nhắt trắng), theo dõi diễn biến bệnh tìm tổn thưong điển hình súc vật thí nghiệm Hình Phùịng pháp chung thu thập nuôi cấy bệnh phâm vi khn hiếu khí kị khí Chẩn đốn gián tiếp: Là tìm kháng thể huyết người bệnh Nguyên tắc: Dựa vào kháng nguyên (mầu) biết trước phản ứng kết họp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu để tìm kháng thể Thơng qua có mặt kháng thể mà kết luận có mặt kháng nguyên - vi khuẩn gây bệnh Các bước tiến hành: 2.1 Lẩy bệnh phầm: Lấy máu tĩnh mạch (khoảng ml), cho vào ống nghiệm khô; để máu đông; li tâm lấy huyết thanh, xử lý 56°C/30 phút Phải lấy máu lần: lần I vào ngày đầu bệnh; lần II sau lần I 7-10 ngày 2.2 Làm phản ứng huyết thanh: - Huyết bệnh nhân pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau, thường giảm dần theo bậc - Hai mẫu huyết I II tiến hành làm phản ứng điều kiện - Xác định hiệu giá kháng thể (HGKT); HGKT tính độ huyết pha lỗng mà phản ứng kết họp kháng nguyên - kháng thể xảy (+) - Xác định động lực kháng thể (ĐLKT): So sánh HGKT mẫu huyết lần I II để tìm ĐLKT ĐLKT gia tăng HGKT lần II so với lần I, gấp lần Khi có ĐLKT kết luận được: người bệnh bị nhiễm khuẩn Ghi chú' -ở số bệnh định khơng cần phải tìm ĐLKT mà dựa vào hiệu giá giới hạn (là hiệu với nồng độ phản ứng dương tính hoặc/ cao khẳng định bệnh nhân bị bệnh) - Kỹ thuật xác định IgM chẩn đốn sớm khơng thiết phải làm lần Hình Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn lâm sàng Câu hỏi: Trình bày khái niệm chẩn đoán trực tiếp gián tiếp? Trình bày bước thường áp dụng phương pháp chẩn đoán phân lập vi khuẩn, nêu yêu cầu ý nghĩa bước? Nêu mục đích, nguyên tắc kể bước tiến hành phương pháp chẩn đốn gián tiếp CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÂN ĐỐN VIRUS HỌC MỤC TIÊU HỌC TẬP Trình bầy nguyên tắc chung việc lấy bệnh phẩm để phân lập virus Vẽ giải thích sơ đồ phân lập xác định virus Nhận biết hình thể tế bào bình thường tế bào tổn thương virus Đọc kết phản ứng ngưng kết hồng Cầu để xác định virus cúm Các bênh virus gây ngày nhiều Do cần thiết chẩn đoán xác định bệnh nhiễm virus Hiện có phương pháp chẩn đốn virus học: -Chẩn đoán trực tiếp xác định virus trực tiếp bênh phẩm nuôi cấy phân lập Đây kỳ thuật kinh điển, yêu cầu trang bị vàkỳ thuật, tốn nhiều thời gian, nên sử dụng -Xác định virus kính hiển vi điện tử kỹ thuật miền dịch hay di truyền Đây phương pháp hay sử dụng Cho kết nhanh xác, tốn -Chẩn đốn gián tiếp hay cịn gọi chẩn đốn huyết xác định kháng thể đặc hiệu virus Nừu tìm đuợc IgM cho kết chẩn đốn sớm, cịn IgG chẩn đốn muộn Đây phương phấp sử dụng nhiều Cách lấy bảo quăn bệnh phẩm Tuỳ theo bệnh mà lấy bệnh phẩm khác ví dụ: bệnh cúm bệnh phẩm nước xúc họng, bệnh sốt xuất huyết bệnh phẩm máu Nguyên tắc chung phải lấy lúc, vị trí Bệnh phẩm bảo quản lạnh, ghi rõ họ, tên, tuổi, giới tính, số bệnh phẩm, địa chỉ, ngày phát bệnh, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm dấu hiệu lâm sàng Gửi tới phịng xét nghiệm Các phưoìig pháp phân lập Hiện người ta thường dùng phương pháp để nuôi cấy phân lập virus là: 2.1 Phương pháp phân lập tế bào cảm thụ Khi nhận bệnh phẩm, bệnh phẩm có lẫn tạp phẩm (phân, nước xúc họng, nước tiểu ) cần diệt tạp khuẩn kháng sinh có nồng độ thích họp khơng ảnh hưởng tới virus Còn bệnh phẩm như: máu, nước não tuỷ khơng cần xử lý kháng sinh Bệnh phẩm gây nhiễm cho tế bào cảm thụ nhiệt độ khí trường thích họp (tỷ lệ oxy co2 tuỳ thuộc virus) Trong bệnh phẩm có virus, virus làm cho tế bào bị huỷ hoại Thời gian đọc kết phụ thuộc vào chu kỳ nhân lên loại virus Dấu hiệu huỷ hoại tế bào là: Nguyên sinh chất bị tiêu huỷ, tế bào co trịn lại khơng bám vào thành trai tạo ổ phá huỷ (Plaque), mơi trường ni cấy trở nên tím đỏ Có hai loại tế bào thường dùng để nuôi cấy phân lập virus tế bào tiên phát tế bào thường trực 10 nhung cân để trì trạng thái tiêu hóa hấp thu bình thường Khi cân nghĩa có loạn khuẩn gây ỉa chảy kéo dài Loạn khuẩn hay xảy sau dùng kháng sinh phổ rộng điều trị kéo dài Loạn khuẩn xảy sau bệnh lỵ bệnh cấp tính khác có người suy dinh dưỡng, ngun nhân gây viêm đại tràng mạn tính bệnh nhân bị ỉa chảy loạn khuẩn (phân lỏng, có nhiều nhày, màu xanh, khơng có mùi thối, có máu), dùng kháng sinh để điều trị bệnh nặng hon Vì vậy, bệnh nhân bị ỉa chảy kéo dài, việc ni cấy phân tìm vi khuẩn gây bệnh, cần phải làm xét nghiệm vi khuẩn chí để đánh giá tình trạng vi khuẩn có biện pháp điều trị thích họp để lập lại cân vi khuẩn Vi khuẩn ruột có nhiều loại ưa khí kị khí với số lượng lớn Trong gam phân có khoảng 1011 vi khuẩn, chiếm phần lớn trọng lượng phân Để đánh giá vi khuẩn chí, cần làm xét nghiệm nhuộm soi nuôi cấy để tính tỷ lệ trực khuẩn E coli so với vi khuẩn ưa khí khác đếm số lượng E coli gam phân Lấy bệnh phẩm Số lượng phân lấy xét nghiệm gam vào lọ vơ khuẩn gửi đến phịng xét nghiệm Neu chưa nuôi cấy phải bảo quản phân tủ lạnh 2-4°C Nhuộm soi trực tiếp Làm tiêu phân nhuộm gram soi kết phân bình thường chủ yếu trực khuẩn gram âm Trong trường họp loạn khuẩn trực khuẩn gram âm giảm nhiều Các cầu khuẩn trực khuẩn gram xuất nhiều, có nấm men Ni cấy phân Dùng que cấy lấy quai phân ria cấy lên đĩa thạch máu, ý cấy để khuẩn lạc mọc thưa đếm Đổ tủ ấm 37°c, sau 24 đếm khuẩn lạc đĩa thạch máu, xác định loại vi khuẩn mọc tỷ lệ phần trăm E coli Pha loãng gam phân vào ml nước muối sinh lý vô khuẩn Ngốy đều, pha lỗng tiếp để có độ pha lỗng cuối 10'5 Sau lấy giọt (1 ml = 20 giọt) nhỏ vào đĩa môi trường thạch thường ria cấy khắp mặt thạch Đe tủ ấm 37°C/24 Đem số lượng loại vi khuẩn đĩa thạch thường, xác định loại vi khuẩn trực khuẩn E coli gam phân theo công thức: 144 N = n X 20 X 105 (N: so lượng vi khuẩn gam phân; n: so khuẩn lạc đếm được) Từ tính tỷ lệ E coli so với tổng số vi khuẩn có phân cách đếm số khuẩn lạc E coli) Đánh giá kết Bình thường tỷ lệ E coli từ 70-90% số lượng vi khuẩn E coli gam phân 10 X 106 trở lên Truông họp loạn khuẩn nặng, E coli gần hẳn vi khuẩn khác phát triển Có thể tỷ lệ trực khuẩn E coli cao 70% số lượng vi khuẩn gam phân thấp lOxlO6 Đây loạn khuẩn số lượng Nhung ngược lại, có trưịng họp số lưọng vi khuẩn gain phân cao lOxlO6, nhung tỷ lệ E coli thấp 70%, loạn khuẩn chất lưọng Trong nhũng trường họp nghi ngờ, cần phải làm xét nghiệm vi khuẩn chí nhiều lần B Phần thực hành Chuẩn bị phương tiện - Dụng cụ: + Lam kính + Pipet loại ml, 10 ml vô khuẩn + ống nghiệm lọ đựng phân vô khuẩn + Các dụng cụ nhuộm gram + Que cấy, đèn cồn + Pipet Pasteur - Hóa chất: + Nước muối sinh lý vô khuẩn + Các loại thuốc thử - Môi trường: + Môi trường thạch máu + Môi trường thạch thường + Các môi trường sinh vật hóa học - Bệnh phẩm: Phân lấy kỹ thuật vơ khuẩn 145 Quy trình phân lập TT Nội dung Điểm Điểm chuẩn đạt Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, mơi trường bệnh phẩm 1,0 Làm tiêu nhuộm gram, soi kính trả lời kết sơ đánh 1,0 giá loạn khuẩn Dùng que cấy lấy phân cấy lên đĩa thạch máu, đế tủ ấm 0,5 37°C/18-24 Đem số khuẩn lạc đĩa thạch máu xác định tỷ lệ trực 1,0 khuẩn E.coli Pha loãng gam phân với ml nước muối sinh lý vô khuấn để 1,0 có tỷ lệ CÁC BIỆN PHÁP TIỆT TRÙNG VÀ KHỮ TRÙNG MỤC TIÊU HỌC TẬP Trình bày biện pháp tiệt trùng tác dụng chúng Trình bày biện pháp khử trùng tác dụng chúng Vận hành tủ sấy quy trình Vận hành nồi hấp quy trình Các biện pháp tiệt trùng Nguyên tắc chung tất biện pháp phải đảm bảo hoạt tính tiêu diệt vi sinh vật nha bào bên bên vật cần tiệt trùng 1.1 Khí nóng khơ Để diệt vi sinh vật khí nóng khơ, người ta thường dùng tủ sấy khơ trì từ 160 - 180°C từ - Vi sinh vật, kể nha bào bị tiêu diệt thành phần hữu bị hủy hoại Khơng khí mơi trường dẫn nhiệt nên tủ sấy khơng có phận tạo luồng khí chuyển động (quay vịng) cần phải trì 180°C/l Luôn phải kiểm tra độ tiệt trùng điểm chun biệt 146 Khí nóng khơ thường áp dụng để tiệt trùng vật dụng chịu nhiệt độ cao như: thủy tinh, kim loại, đồ gốm không dùng để tiệt trùng vật dễ cháy như: cao su, nhựa Dưới nhiệt độ thời gian tiệt trùng số dụng cụ: Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút) Thủy tinh 160 60 Kim loại 160 160 Các chất dầu mỡ 160 160 Dụng cụ 1.1.1 Cấu tạo tủ sấy khô Tủ sấy khơ có ba phận chính: nguồn cung cấp điều hòa nhiệt, ngăn xếp dụng cụ lóp vỏ bao bọc cách nhiệt (hình 1) Vỏ cách nhiệt ếp cung cấp nhiệt Hình Sơ đồ cấu tạo tủ sấy khơ 1.1.2 Quy trình sử dụng tủ sấy khô - Điều chỉnh nhiệt độ thời gian thích họp với dụng cụ sấy - Dụng cụ cần sấy phải cọ rửa khô - Tháo rời phận dụng cụ (nếu được) - xếp dụng cụ vào tủ: không xếp sát đáy sát thành tủ chật - Đặt hóa chất băng thị màu để kiểm tra nhiệt độ - Đóng cửa tủ cẩn thận 147 - Vận hành tủ (bật cơng tắc điện đóng cầu dao) - Trong sấy phải thưòng xuyên theo dõi, không mở cửa tủ cho thêm dụng cụ vào nhiệt độ lên cao - Chỉ lấy dụng cụ khỏi tủ sau ngắt điện nhiệt độ tủ xuống 50°C - Vận hành tủ sấy: cần phải thận trọng, tránh tai nạn lao động bỏng 1.2 Hoi nước căng Hoi nước căng nước áp suất cao tương ứng với nhiệt độ đạt 100°C Khi pha cân với pha lỏng nước gọi bão hịa Hơi nước căng có tác dụng diệt vi sinh vật Nồi hấp (autoclave) dụng cụ tạo nước căng dùng để tiệt trùng Biện pháp thường áp dụng cho dụng cụ kim loại, đồ vải, cao su, số chất dẻo chất lỏng áp suất, nhiệt độ thời gian tiệt trùng áp suất (atm) Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút) Đồ vải 120,5 30 Đồ cao su 120,5 15 Kim loại gói 120,5 30 Kim loại đế hở 120,5 15 Đồ thủy tinh 120,5 15 0,5 111,4 30 120,5 15 Dụng cụ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 1.2.1 Cấu tạo nồi hấp ướt Nồi hấp ướt có nhiều kiểu cách khác nhung cấu tạo tuân theo nguyên tắc chung: tạo nước bình kín có áp suất cao (hình 2) 148 1.2.2 Quy trình sử dụng nồi hấp ướt - Dụng cụ cần tiệt trùng phải cọ rửa - Tháo rời phận dụng cụ (nếu được) - xếp dụng cụ vào nồi hấp cho nước nóng tiếp xúc với dụng cụ; hộp hấp phải để hở lồ thoát khí, bình phải để hở nắp - Đặt hóa chất băng thị màu để kiểm tra nhiệt độ - Đậy nắp kín (kiểm tra vịng đệm thành nồi hấp, có bụi cát phải lau sạch) - Chọn nhiệt độ, áp suất, thời gian thích họp với dụng cụ cần tiệt trùng - Kiểm tra mức nước, thiếu phải bổ sung nước cất - Mở van xả -Vận hành nồi hấp - Khi nóng 5-7 phút khóa van xả - Trong q trình vận hành khơng cho thêm dụng cụ vào, phải thường xuyên theo dõi có cố phải cắt điện ngay, báo cho người phụ trách - Khi đủ thời gian vận hành (tính từ áp suất đạt yêu cầu), tắt nồi hấp - Chỉ lấy dụng cụ khỏi nồi hấp kim áp suất số Không chủ động hạ áp suất nhanh tránh gây "xục" chất lỏng tiệt trùng 149 - Vận hành nồi hấp (thiết bị tạo áp suất cao) phải thận trọng, bảo đảm an toàn lao động tránh nổ gây bỏng 1.3 Tanh đan (tydan) Phương pháp đan dựa nguyên tắc: đun cách thủy 100°C lần đầu vi sinh vật bị tiêu diệt chưa diệt nha bào Đợi 24 sau nha bào chuyển thành trạng thái sinh dưỡng, lại đun cách thủy lần để diệt tác dụng việc đun cách thủy lần thứ ba Phương pháp đan dùng để tiệt trùng chất bị hỏng giảm chất lượng 100°C, dung dịch có anbumin (đơng 70°C biến chất 100°C) loại mơi trường có glucid 1.4 Lọc vơ trùng Có hai kỳ thuật lọc vô trùng: lọc màng lọc lọc sâu 1.4.1 Dùng màng lọc Dùng màng lọc với khe hở vô bé để giữ lại vi sinh vật bề mặt Nhũng chất khí lỏng khơng thể dùng nhiệt độ để tiệt trùng phải lọc vơ trùng, ví dụ vacxin, sản phẩm huyết thanh, mơi trưịng ni cấy tế bào, dung dịch nhạy cảm nhiệt độ, đồ uống, khơng khí chất khác 1.4.2 Lọc sâu Dòng chảy qua lóp vật liệu có cấu tạo sợi, hạt Việc giữ lại vi sinh vật dựa nguyên tắc gắn vi sinh vật vào cấu tạo mạng, nhờ hiệu lực vật lý khác nên giữ lại nhũng vật thể nhỏ Thơng thưịng người ta dùng sợi thủy tinh để lọc khơng khí (khả giữ vật thể lón hon 0,5 pm 99,95%) dùng nến gốm để lọc chất lỏng So với biện pháp vật lý để tiệt trùng lọc vơ trùng có nhiều yếu tố khơng chắn, nên dùng cho nhũng thuốc chất liệu áp dụng biện pháp tiệt trùng khác 1.5 Hóa chất Trong hóa chất người ta thưòng dùng ethylenoxid formaldehyd Tiệt trùng ethylenoxid (CH2OCH2) dựa phản ứng hóa học, nhờ hoạt tính nguyên tử oxy cấu tạo phân tử Ethylenoxid chất độc, gây dị ứng, kích 150 thích mạnh niêm mạc dề cháy, ngồi cịn chất gây ung thư Vì vậy, sử dụng phải thận trọng đề phòng nổ 1.6 Tia gama Tia gama xạ ion hóa giàu lượng giết chết vi sinh vật Tia gama áp dụng để tiệt trùng catgút vật dụng nhạy cảm với ethylenoxid hay nhiệt độ cathether mảnh ghép Ngồi cịn dùng để tiệt trùng dụng cụ băng nhũng túi đóng sẵn Các biện pháp khử trùng Người ta dùng biện pháp khử trùng biện pháp vật lý biện pháp hóa học 2.1 Biện pháp vật lý 2.1.1 Khử trùng nhiệt độ cao Luồng nước nóng 80 - 100°C thường dùng giết tế bào sinh dưõng trạng thái tự vài phút Phưong pháp thưòng áp dụng để khử trùng quần áo, chăn màn, dụng cụ dùng người bệnh Người ta cịn khử trùng bang Pasteur hóa sữa 72°c/15 phút Pasteur hóa đồ uống khác 62°C/30 phút 2.1.2 Tia cục tím (UV) Tác dụng tia cực tím dựa chế: cấu trúc phân tử vi sinh vật acid nucleic bị biến đổi hấp thụ tia xạ Sóng điện từ với bước sóng 13,6 - 400 nm, 257 nm, có tác dụng khử trùng Liều sử dụng 100 - 500 pWsec/cm2 diệt 90% hầu hết loài vi khuẩn Tia uv dùng để khử trùng không khí, nước vị trí bị nhiễm trùng Đổ đảm bảo vô trùng tủ cấy vi sinh phịng thí nghiệm, người ta thường dùng bóng đèn cực tím 15W bóng 30W cho phịng 25 m3 Đèn treo cao khơng q m, thời gian chiếu sáng nhung khơng q Tia uv gây viêm kết mạc, giác mạc ảnh hưỏng đến sức khỏe người lao động Cưòng độ chiếu xạ pWsec/cm2 cần theo dõi kiểm tra hiệu lực, ngăn ngừa ảnh hưỏng đến người 2.2 Biện pháp hóa học 2.2.1 Cồn: Các hóa chất thưịng dùng để khử trùng dung dịch ethanol 80%, isopropanol 70% n-propanol 60% Những dung dịch đặc hon hút nước vi 151 khuẩn mạnh nên hiệu hon cồn không diệt nha bào Tác dụng diệt virus có nhiều ý kiến khác Cồn thường dùng để khử trùng da, khử trùng bàn tay phẫu thuật lau nhũng bề mặt chất rắn làm vệ sinh Ưu điểm thời gian tác dụng nhanh, đon giản, tiện lợi, có khả thấm vào da kể lồ chân lông tuyến mồ hôi, nhung nhược điểm bay hoi dễ cháy 2.2.2 Phenol dẫn xuất nồng độ 0,5-4%, dung dịch phenol tiêu diệt vi khuẩn nhung không diệt nha bào virus Phenol "ăn" da, niêm mạc cịn gây độc thần kinh Người ta dùng số phenol để đánh giá tác dụng sát khuẩn hóa chất Chỉ số phenol tỷ số nồng độ phenol thấp nồng độ chất sát khuẩn thấp có tác dụng lên loài vi khuẩn thời gian định 2.2.3 Nhóm halogen Tác dụng khử khuẩn phản ứng oxy hóa halogen hóa chất hữu Phản úng oxy hóa xảy nhanh khơng quay trở lại được, cịn halogen hóa chậm hon khơng mạnh Nhũng phản úng xảy với nhiều chất hữu khác nhau, làm giảm hoạt tính khử trùng nhũng dung dịch có nhiều chất bẩn hữu hay chất oxy hóa halogen hóa khác, amoniac Halogen có phổ tác dụng rộng thời gian tác dụng ngắn + Clo: sử dụng nhiều dạng khí nguyên chất dạng họp chất hữu hay vô Clo dùng để trùng nước ăn (nồng độ 0,1 - 0,3 mg/1, nước bể boi 0,5 mg/1) + Chlorua canxi thường sử dụng để khử trùng chất nôn, chất thải dụng cụ thô (pha 1/15 với nước) rắc hố xí + Chloramin tinh khiết pha lỗng 1% có khả khử trùng bàn tay phút tác dụng, cho dụng cụ phải 20 phút Khử trùng đồ vải tẩy uế dùng dung dịch 1,5 - 2,5% thời gian 2-12 Chloramin thô dùng để tẩy uế chlorua canxi + lốt: dung dịch iốt cồn iốt (7% I, 3% Kl, 90% cồn) sử dụng nhiều để khử trùng da Nhược điểm halogen phản úng không đặc hiệu xảy nhanh với nhiều chất hữu khác khí clo cịn có tính độc; có người bị dị ứng với iod 2.2.4 Muối kim loại nặng 152 Hoạt tính kháng khuẩn theo thứ tự muối thủy ngân (Hg), bạc (Ag), đồng (Cu), kẽm (Zn) Chủ yếu có tác dụng chế khuẩn, khơng diệt nha bào, virus; tác dụng vi khuẩn kháng acid Trong y học, họp chất hữu Hg phenyl - borat - thủy ngân dùng sát trùng vết thương, da niêm mạc 2.2.5 Aldehyd Thường dùng formaldehyd dạng dung dịch 0,5 - 5% khí g/cm3, có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn, nấm virus; đủ thời gian nhiệt độ cao diệt nha bào Dạng dung dịch dùng để lau chùi sàn nhà đồ dùng Khí dùng để khử trùng khơng khí máy móc lón Formaldehyd kích thích da niêm mạc, gây chảy nước mắt, dẫn tới dị úng nghi ngờ gây ung thư Do làm tủa protein nên không dùng để khử trùng chất thải Đổ trung hòa formaldehyd, dùng amoniac, sulfit histidin 2.2.6 Các chất oxy hóa thuốc nhuộm vi khuẩn Các chất như: oxy già (H2O2), thuốc tím (KMnO4), xanh methylen pha thành dung dịch dùng làm chất khử khuẩn 2.2.7 Acid base Hầu hết acid base có tác dụng diệt khuẩn tính điện phân mạnh thành H+ OH' Tùy tùng loại vật liệu cần khử trùng mà dùng nồng độ, loại acid base cho thích họp 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tác dụng chất khử trùng Nhũng sai sót ảnh hưỏng đến hiệu khử trùng gồm nhiều yếu tố, nhung quan trọng là: - Nồng độ hóa chất khơng đủ - Thời gian tác dụng không đủ - Nhiệt độ (có liên quan tới thời gian tác dụng) - Mật độ sinh vật nơi khử trùng - Môi trường xung quanh cản trở hóa chất ngấm tới sinh vật làm bất hoạt hóa chất (ví dụ: vi khuẩn lao dòm) 153 - Khả đề kháng vi sinh vật (ví dụ: virus có lóp vỏ bao ngồi (lipid) dễ bị tiêu diệt dung mơi lipid cồn, phenol virus khơng có vỏ bao ngồi) Vì vậy, để phát huy hiệu chất khử trùng, cần sử dụng loại hóa chất, đủ nồng độ thời gian cần thiết tùy theo loại dụng cụ vật cần khử trùng CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ Kể tên biện pháp tiệt trùng nêu tác dụng biện pháp? Trình bày biện pháp khử trùng nhiệt độ cao tia cực tím? Kể tên hóa chất thường dùng khử trùng tác dụng mồi loại? Trình bày quy trình sấy khơ? Trình bày quy trình hấp ướt? 154 ĐẢM BẢO CHÁT LƯỢNG TRONG LABO VI SINH- KIÊM TRA CHÂT LƯỢNG TỪ BÊN TRONG MỤC TIÊU HỌC TẬP Trình bày quy định thành phần đảm bảo chất lượng tò bên labo Vi sinh Trình bày khái quát việc lưu trữ chủng vi khuẩn Chương trình kiểm tra chất lượng từ bên phải đạt yêu cầu: Thiết thực, khả thi kinh tế Nó phải tiến hành hàng ngày Dựa vào tầm quan trọng thành phần chất lượng toàn xét nghiệm mà phải đánh giá xem quy trình xét nghiệm, thuốc thử, mơi trường ni cấy có phù họp với công việc thực tế không Thường quy làm việc labo vi sinh Những quy định chung cho tác phong làm việc labo Vi sinh phải tuân thủ nghiêm chỉnh (xem "Quy định làm việc labo Vi sinh" học phần Kỹ thuật xét nghiệm bản) Nhằm đánh giá chất lượng labo Vi sinh cịn phải có quy định cho nhũng cơng việc cụ thể sau đây: - Có quy định vệ sinh (lau chùi sẽ) chồ làm việc; vệ sinh cá nhân; chồ ăn nghỉ tách hẳn chồ làm việc - Có thưịng quy bảo dưõng máy, thiết bị - Có quy định rõ việc thu nhận bệnh phẩm; vào sổ đầy đủ thông tin người bênh; loại bỏ bệnh phẩm không đạt yêu cầu - Có quy trình xét nghiệm tùng loại bệnh phẩm - Có quy định việc vào sổ (ghi chép) kết xét nghiệm - Có quy định việc báo cáo kết xét nghiệm 155 Bảng theo dõi nhiệt độ máy Tên máy: Nhiệt độ: Phòng số: Tháng Ngày 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 28 28 29 29 30 30 31 31 Môi trường nuôi cấy Mơi trường ni cấy vi khuẩn tự sản xuất từ hóa chất đon lẻ dùng sản phẩm thưong mại - bột pha sẵn 3.1 Lựa chọn mơi trường Nên dùng mơi trưịng để điều chế mơi trường khác nhau, ví dụ dùng mơi trưịng để điều chế mơi trường thạch máy, môi trường sôcôla môi trường phânlập Neu muốn phân lập vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm lẫn tạp nên dùng mơi trường có khả tách vi khuẩn cần tìm tốt nhất; ví dụ 156 tìm vi khuẩn thương hàn phân nên chọn môi trường DCA (Deoxycholate citrate agar) môi trường ss (Salmonella - Shigella) 3.2 Bảo quăn môi trường bột pha sẵn - Chỉ nên mua số lượng đủ dùng tháng tối đa năm - Hộp mơi trường mua phải cịn ngun vịng bảo hiểm - Viết ngày tháng tiếp nhận lên vỏ hộp - Đe nơi thoáng, mát, tránh ánh sáng - Khi mở hộp để sử dụng phải ghi ngày tháng mở hộp lên vỏ Chú ý: Môi truồng bột pha sẵn hút nước khơng khí nên mơi trường đóng vón chuyển màu sẫm phải loại bỏ 3.3 Pha chế môi trường - Thực hướng dần hãng sản xuất - Sử dụng hết khối lượng trước hết hạn 3.4 Lưu trữ môi trường pha chế - Tránh nhiệt độ cao Môi trường có máy chất hữu khác hay mơi trường có kháng sinh phải cất tủ lạnh - Dù có lưu trừ quy định, mơi trưịng pha chế tốt thời gian định, cụ thể: + Trong tubes nút bông: tuần + Trong lọ có nút xốy: tháng + Trong đĩa petri, để túi nilơng đóng kín: tuần 3.5 Kiểm tra chất lượng môi trường pha chế 3.5.1 Kiểm tra pH Nếu sản xuất từ bột pha sẵn bước làm xác khơng cần kiểm tra pH thường xuyên Môi trường sản xuất từ hóa chất đon lẻ cần kiểm tra mơi trường nguội Mơi trường có thạch kiểm tra sau hòa nước cat Neu pH sai lệch nhiều hon 0,2 đon vị so với chuẩn phải cho thêm xút acid pha lại mẻ khác 3.5.2 Kiểm tra vô trùng Lấy 3-5% số môi trường mồi mẻ sản xuất, ủ ấm 35°C/2 ngày; chồ cịn lại cất tủ lạnh Nếu có > khuẩn lạc/1 đĩa phải hủy bỏ mẻ mơi trường Kiểm ứa chất lưọng mơi trưịng 157 Mồi labo phải có chủng mẫu để kiểm tra chất lượng mơi trường (bảng 3a) Nhũng chủng nhận tù- hãng sản xuất, từ labo chuẩn từ ngân hàng gen chủng labo tự phân lập định danh xác - Pha huyền dịch vi khuẩn mầu có độ đục McFahrland 0,5 - Lấy "ăng" cấy lên mơi trưịng - Thời gian ủ ấm tùy theo yêu cầu loại - Ghi chép kết 158