nhóm 3 báo cáo th vi sinh y học

Phương pháp điện di DNA lạ có gắn mồi Salmonella có tiềm năng trở thành một phương pháp chẩn đoán Salmonella hiệu quả, nhanh chóng, dễ dàng, chính xác và chi phí thấp.. Phát triển hướng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

TP Thủ Đức, 05/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH TRONG Y HỌC

TP Thủ Đức, 05/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tống quan về Salmonella sp 2

2.2 Điện di mẫu gắn mồi Salmonella sp 4

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu và thiết bị 5

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 5

3.2.2 Hóa chất 5

3.2.3 Thiết bị 5

3.2.4 Dụng cụ 5

3.3 Phương pháp nghiên cứu 6

3.3.1 Đổ thạch gel agarose 6

3.3.2 Điện di DNA tổng số định tính và định lượng DNA 6

3.3.3 PCR 16S DNA kiểm tra mẫu vi khuẩn 6

3.3.4 PCR với mồi Salmonella kiểm tra mẫu 8

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9

4.1 Điện di DNA tổng số 9

4.1.1 Kết quả 9

4.1.2 Thảo luận 9

4.2 PCR 16S kiểm tra DNA vi khuẩn 10

4.2.1 Kết quả 10

4.2.2 Thảo luận 10

4.3 PCR kiểm tra DNA với primer Salmonella sp 10

4.3.1 Kết quả 10

4.3.2 Thảo luận 11

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 12

5.1 Kết luận 12

5.2 Đề nghị 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella sp dưới kính hiển vi 3

Hinh 3.1 Votex mẫu DNA 6

Hình 3.2 Cho DNA mẫu vào ống túp 7

Hình 3.3 Màn hình chạy PCR 16S 7

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số 9

Hình 4.2 Kết quả điện di 16S DNA vi khuẩn 10

Hình 4.3 Kết quả điện di DNA với primer Salmonella 10

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Bảng các giai đoạn phản ứng PCR với primer đặc hiệu cho Salmonella 4

Bảng 3.1 Bảng thành phần và cách pha gel agarose 1% 6

Bảng 3.2 Bảng thành phần phản ứng PCR 8

Bảng 3.3 Bảng thành phần và thể tích điện di cho sản phẩm PCR với primer 8

Salmonella 8

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Salmonella là một loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến, có thể dẫn đến

các triệu chứng nghiêm trọng như tiêu chảy, sốt, nôn mửa và thậm chí tử vong Việc phát

hiện Salmonella kịp thời và chính xác là rất quan trọng để kiểm soát sự lây lan của bệnh

và điều trị hiệu quả cho người bệnh Phương pháp điện di DNA lạ có gắn mồi Salmonella

có tiềm năng trở thành một phương pháp chẩn đoán Salmonella hiệu quả, nhanh chóng,

dễ dàng, chính xác và chi phí thấp Phát triển hướng nghiên cứu: tối ưu hóa điều kiện

điện di như nồng độ agarose, thời gian điện di và điện áp để nâng cao độ nhạy và độ

chính xác của phương pháp, cần phát triển các bộ kit điện di DNA lạ có gắn mồi

Salmonella dễ sử dụng và giá cả phải chăng để phương pháp này có thể được sử dụng

rộng rãi hơn, cần tiến hành các nghiên cứu so sánh phương pháp điện di DNA lạ có gắn

mồi Salmonella với các phương pháp chẩn đoán Salmonella khác để đánh giá hiệu quả

của phương pháp này Phương pháp này có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác

nhau, bao gồm y tế, an toàn thực phẩm và y tế thú y Nghiên cứu phương pháp điện di

DNA lạ có gắn mồi Salmonella để phát hiện Salmonella là một lĩnh vực nghiên cứu hứa

hẹn với nhiều tiềm năng ứng dụng

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhóm 3 sử dụng mẫu Q12 đã được ly trích để kiểm tra mẫu có vi khuẩn

Salmonella hay không

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Điện di DNA tổng số, định tính, định lượng DNA

Nội dung 2: PCR 16S DNA kiểm tra mẫu có vi khuẩn hay không

Nội dung 3: PCR với mồi Salmonella để kiểm tra mẫu có Salmonella không

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tống quan về Salmonella sp

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi

khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm

đến 5 µm và có vành lông rung hình roi Salmonella sp bao gồm 2 loài S.enterica và

S.bongoly Salmonella có khả năng sống sót bên ngoài cơ thể con người và động vật một

thời gian khá dài (vi khuẩn sống trong nước 2 – 3 tuần, trong phân hoặc nước đá có thể

2 – 3 tháng) Salmonella bị huỷ bởi nhiệt độ: 500C trong vòng 1 giờ hoặc 1000C trong vòng 5 phút, do đó việc ăn thức ăn nấu chín kỹ và uống nước đun sôi để nguội làm giảm

nguy cơ nhiễm salmonella Khuẩn Salmonella đi vào cơ thể khi ăn hoặc uống thứ gì đó

có vi khuẩn trong đó Salmonella phổ biến hơn trong thực phẩm từ động vật, như trứng,

thịt bò và gia cầm Nhưng đất hoặc nước cũng có thể làm ô nhiễm trái cây và rau quả

Ngoài ra, Salmonella có thể được lây nhiễm từ thực phẩm này sang thực phẩm khác

bằng tay hoặc dao, thớt, đĩa và các dụng cụ nhà bếp khác Bên cạnh đó, trực khuẩn này

có thể bị tiêu diệt bởi những chất sát khuẩn thông thường, do đó tại những nơi bệnh nhân

bị nhiễm salmonella sinh sống nên được tẩy trùng để giảm nguy cơ lây lan vi khuẩn ra cộng đồng

Triệu chứng nhiễm Salmonella sp bao gồm tiêu chảy, sốt, co thắt cơ bụng, buồn nôn, nôn mửa và mất nước Tùy theo từng type vi khuẩn Salmonella có thể gây các bệnh

cảnh khác nhau, nhưng chủ yếu là các vấn đề tại đường tiêu hoá Ở nước ta, bệnh thương

hàn chủ yếu do Salmonella typhi gây ra Bệnh có thể lây lan thông qua nước uống, thức

ăn bị nhiễm khuẩn không được nấu chín hoặc do tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, người lành mang vi khuẩn thông qua chất thải, tay, chân, đồ dùng bị nhiễm khuẩn Bệnh thường khởi phát đột ngột với sốt cao kéo dài, đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, táo bón hoặc tiêu chảy

và ho khan, diễn tiến từ nhẹ đến nặng Ngoài ra còn có nhiễm Salmonella không gây thương hàn, các loại salmonella khác nhau gây ra các bệnh cảnh khác nhau như viêm dạ

dày ruột, ngộ độc thức ăn, viêm ruột… với những triệu chứng thường gặp là sốt, buồn

nôn, nôn ói, tiêu chảy… Ngoài ra, Salmonella còn có thể xâm nhập vào đường máu và

gây các nhiễm trùng ở vị trí khác trên cơ thể như viêm màng não, viêm phổi…Nhiễm

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella sp dưới kính hiển vi

trùng Salmonella không thương hàn thường gặp và do tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp với

nhiều loài động vật nhiễm bệnh, thực phẩm có nguồn gốc từ chúng và phân của chúng

Tình trạng nhiễm khuẩn Salmonella có thể diễn tiến từ nhẹ đến nặng, có thể gây tử vong

cho bệnh nhân Có nhiều yếu tố tác động đến biểu hiện của bệnh, chẳng hạn như độ tuổi, bệnh nền…

Đối với trẻ em hoặc một số đối tượng có hệ miễn dịch suy giảm (do bệnh lý hoặc

do dùng thuốc ức chế miễn dịch trong điều trị một số bệnh lý), bệnh có thể diễn tiến nặng nề hơn, vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng huyết và các tình trạng viêm nhiễm nặng khác ở xương, màng não, phổi… Trong bệnh thương hàn, biến chứng nguy hiểm nhất

là thủng ruột, chảy máu đường tiêu hoá hoặc nhiễm trùng huyết Tỷ lệ xảy ra các biến chứng này là khoảng 5%

Để bảo vệ bản thân và gia đình khỏi nguy cơ nhiễm Salmonella sp., việc tuân thủ

các biện pháp phòng ngừa vệ sinh an toàn thực phẩm là vô cùng quan trọng Bao gồm: Rửa tay thường xuyên bằng xà phòng và nước: Đây là biện pháp đơn giản nhưng hiệu quả nhất để ngăn ngừa vi khuẩn lây lan Nấu chín kỹ thực phẩm: Đặc biệt là thịt gia cầm, trứng và hải sản Nên sử dụng nhiệt kế thực phẩm để đảm bảo thực phẩm được nấu chín đến nhiệt độ an toàn Rửa sạch trái cây và rau quả: Rửa kỹ dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn và vi khuẩn Tránh tiếp xúc với động vật bị bệnh: Không nên tiếp xúc trực tiếp với động vật, đặc biệt là động vật có biểu hiện bệnh Uống nước an toàn: Chỉ uống nước đun sôi hoặc nước đóng chai đảm bảo an toàn

2.2 Điện di mẫu gắn mồi Salmonella sp

Điện di mẫu có gắn mồi Salmonella sp là công cụ hiệu quả trong phát hiện vi khuẩn nguy hiểm Phát hiện sớm và chính xác Salmonella sp là chìa khóa cho việc điều

trị hiệu quả và ngăn chặn sự lây lan của bệnh Trong số các phương pháp chẩn đoán,

điện di mẫu có gắn mồi Salmonella sp nổi lên như một công cụ vô cùng hiệu quả bởi những ưu điểm vượt trội: Độ nhạy cao: Phát hiện được lượng nhỏ DNA Salmonella sp.,

ngay cả trong các mẫu bị ô nhiễm nhẹ Tính đặc hiệu: Mồi được thiết kế đặc biệt để liên

kết với DNA Salmonella sp., giảm nguy cơ phát hiện sai các vi khuẩn khác Tương đối

nhanh chóng: Hoàn thành trong vài giờ, giúp đưa ra kết quả chẩn đoán nhanh chóng Dễ thực hiện: Không đòi hỏi thiết bị chuyên dụng phức tạp, phù hợp cho nhiều phòng thí nghiệm Các ứng dụng của kỹ thuật: Kiểm tra an toàn thực phẩm: Đảm bảo thực phẩm

an toàn cho người tiêu dùng Nghiên cứu dịch tễ học: Theo dõi sự lây lan của Salmonella

sp và xác định nguồn gốc bùng phát Chẩn đoán lâm sàng: Xác định bệnh nhân mắc

bệnh thương hàn Nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu về cơ chế gây bệnh, phát triển

vắc-xin và thuốc điều trị Ngoài ra, phương pháp điện di mẫu có gắn mồi Salmonella sp còn

có thể được ứng dụng trong: Kiểm tra chất lượng nước: Đảm bảo nguồn nước sạch và

an toàn cho sinh hoạt Nghiên cứu môi trường: Đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường

bởi Salmonella sp Nghiên cứu thú y: Chẩn đoán và kiểm soát bệnh ở động vật

Bảng 2.1 Bảng các giai đoạn phản ứng PCR với primer đặc hiệu cho Salmonella

(Bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 8 giờ sáng mỗi thứ 3, từ ngày 9/4 đến 7/5 năm 2024

Địa điểm: Tòa A1, khoa khoa học sinh học, Phòng 304

3.2 Vật liệu và thiết bị

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu Q12

3.2.2 Hóa chất

Loading dye

Gel agarol 1%

TBE 0.5X

GelRed

Dreamtab Green

Primer ngược

Primer xuôi

3.2.3 Thiết bị

Lò vi sóng

Máy chụp UV

Máy votex

Máy diện đi

Máy PCR

3.2.4 Dụng cụ

Cân

Ống đong

Micropipet

Eppendorf

Khay đổ gel

Lược gel

6

Hinh 3.1 Votex mẫu DNA

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Đổ thạch gel agarose

Bước 1: Pha 20 mL gel điện di 1% bằng 0,2 g agarose, 20 mL TBE 0.5X

Bước 2: Cho dung dịch gel vào lò vi sóng và đun sôi cho đến khi agarose tan ra Bước 3: Làm nguội lọ gel đến khoảng 60oC , khi tay có thể chạm được, rồi đổ vào khay đã có sẵn lược gel

Bước 4: Đợi cho gel đông đặc lại thì tiến hành điện di

Bảng 3.1 Bảng thành phần và cách pha gel agarose 1%

3.3.2 Điện di DNA tổng số định tính và định lượng DNA

Bước 1: Cho tấm gel đã đông đặt vào bồn điện di

Bước 2: Trộn 3µL mẫu Q12, 1µL gel red và 0.5µL loading dye với nhau Bơm hỗn hợp đã trộn vào giếng

Bước 3: Tiến hành che và thực hiện điện di 100V trong 25 phút

3.3.3 PCR 16S DNA kiểm tra mẫu vi khuẩn

Bước 1: Đem mẫu DNA được giữ lạnh đi votex trên mấy votex để kích hoạt lại chức năng của DNA

Hình 3.3 Màn hình chạy PCR 16S

Hình 3.2 Cho DNA mẫu vào ống túp

Bước 2: Cho 0,5 µm primer ngược và 0,5 µm primer xuôi cho vào ống tupe, thêm vào 3 µm nước tinh khiết Cho mẫu DNA đã ly trích vào ống túp

Bước 3: Đem ống tupe đi chạy PCR 16S trong 60 phút

Bước 4: Mẫu DNA đã pha loãng với loading dye cho vào giếng chạy điện di trong

25 phút với hiệu điện thế 100V

3.3.4 PCR với mồi Salmonella kiểm tra mẫu

Thao tác thực hiện tương tự ở mục 3.3.2 và 3.3.3 dưới đây là bảng các thành phần

Bảng 3.2 Bảng thành phần phản ứng PCR

Đối chứng dương (DNA

Salmonella sp.) 1 𝜇l

(Đối chứng âm thay 1 𝜇l DNA mẫu bằng 1 𝜇l H2O)

Bảng 3.3 Bảng thành phần và thể tích điện di cho sản phẩm PCR với primer Salmonella

Để lắng các thành phần 1 phút và chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V trong vòng 25 phút

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Điện di DNA tổng số

4.1.1 Kết quả

Kết quả điện di cho thấy mẫu Q12 có dải vệt sáng đậm, cho biết rằng trong mẫu

có DNA và nồng dộ DNA tương đối cao

4.1.2 Thảo luận

Nồng độ DNA trong mẫu Q12 tương đối cao để có thể sử dụng, cho nên cần pha loãng DNA để giảm nồng độ vì nếu nồng độ DNA quá cao thì khi thực hiện điện di không gian của các phản ứng sẽ không được đảm và sẽ không xuất hiện band

Q12

Hình 4.2 Kết quả điện di 16S DNA vi khuẩn

4.2 PCR 16S kiểm tra DNA vi khuẩn

4.2.1 Kết quả

Kết quả điện di cho thấy có không xuất hiện band sáng như những nhóm khác

4.2.2 Thảo luận

Kết quả không thấy xuất hiện band sáng do khi thực hiện nhóm đã không pha loãng

để giảm nồng độ DNA Nhóm đã tham khảo kết quả của nhóm học khác cùng làm mẫu Q12 cho kết quả có band sáng có thế kết luận rằng cho thấy trong mẫu Q12 có chứa

DNA vi khuẩn, để khẳng định mẫu có chứa DNA của Salmonella sp hay không, cần tiến hành thực chạy PCR với primer Salmonella sp ở bước tiếp theo

4.3 PCR kiểm tra DNA với primer Salmonella sp

4.3.1 Kết quả

Hình 4.3 Kết quả điện di DNA với primer Salmonella

Q12 ĐC(-)

Kết quả điện di cho thấy có band sáng xuất hiện, cho thấy mẫu Q12 chứa DNA

Salmonella sp

4.3.2 Thảo luận

Nhóm đã pha loãng 2 lần mẫu Q12 nên khi điện di đã xuất hiện band, so sánh với mẫu đối chứng âm (-), đối chứng dương (+) và mẫu Q12 trong hình 4.3, bên cạnh đó,

mẫu Q12 xuất hiện band sáng có nghĩa primer Salmonella sp đã bắt cặp thành công, có thể khẳng định mẫu Q12 thuộc chi Salmonella sp

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận

Sau hơn 4 tuần từ ngày 9/4 đến 7/5 năm 2024 nhóm đã thực hiện thành công việc

kiểm tra DNA mẫu có Salmonella hay không, tuy rằng thao tác của nhóm chưa tốt nhưng

nhở có sự giúp đỡ của chị và các bạn trong lớp mà nhóm đã hoàn thành bài thực hành,

kết quả cho thấy mẫu Q12 được thầy giao thuộc chi Salmonella sp vì nó chứa mồi

Salmonella đã bắt cặp thành công và mẫu Q12 là mẫu của 1 loài vi khuẩn đã được chứng minh ở việc PCR 16S kiểm tra DNA vi khuẩn

5.2 Đề nghị

Tuy rằng lớp đã học 4 tuần thực hành nhưng chỉ hoàn thành được 3 nội dung, còn một nội dung cuối chưa được học, nếu có thêm điều kiện và thời gian nhóm mong muốn rằng được học hết những gì được giới thiệu để nắm vững hơn về kiến thức môn học