Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCPHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR MUTIPLEX REALTIME RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐỊNH DẠNG VIRUS DENGUEThủ Đức,
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR (MUTIPLEX REALTIME RT-PCR) TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐỊNH DẠNG VIRUS DENGUE GVHD: TS Huỳnh Văn Biết KS Trương Quang Toản Thủ Đức, Tháng 10 năm 2023 THÀNH VIÊN NHÓM Họ tên MSSV Vũ Phan Đình Hiệp 21126344 Lâm Bảo Lộc 21126396 Nguyễn Văn Nghĩa 21126423 NỘI DUNG: I Mô tả chung II Yêu cầu chung III Phương pháp thực I MÔ TẢ CHUNG - Vi rút Dengue (DENV) thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae - Bệnh dịch lưu hành địa phương Việt Nam - Bệnh SD/SXHD phát triển nhiều vào tháng 7, 8, 9, 10 năm Xét nghiệm sốt xuất huyết PCR thường sử dụng trường hợp sau: + Khi có kết xét nghiệm máu + Khi có triệu chứng dấu hiệu sốt xuất huyết Hình 1.1 Dengue virus + Khi có tiếp xúc gần với người mắc sốt xuất huyết với mơi trường có nguy cao II U CẦU CHUNG 2.1 Nhân - Có 02 nhân viên có chun mơn phù hợp đào tạo kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt xuất huyết - Nhân viên xét nghiệm tập huấn an toàn sinh học đảm bảo chất lượng phòng xét nghiệm - Nhân viên phòng xét nghiệm cần đánh giá lực định kỳ - Nhân viên sau đánh giá có kết đạt tiếp tục giám sát 3-6 tháng trước thức thực xét nghiệm cách độc lập II YÊU CẦU CHUNG 2.2 Cơ sở vật chất - Cần đáp ứng điều kiện an tồn sinh học, hệ thống quản lý chất lượng phịng xét nghiệm theo quy định hành -Đối với xét nghiệm kỹ thuật realtime RT-PCR cần phòng xét nghiệm riêng, bao gồm: + Phòng pha dung dịch phản ứng (1) + Phòng tách chiết ARN (2) + Phòng đặt máy PCR(3) Hình 2.1 Phịng sinh học phân tử PCR II YÊU CẦU CHUNG 2.3 Trang thiết bị Bảng Trang thiết bị Tên thiết bị Máy ly tâm thường Micropipette Tủ lạnh bảo quản mẫu Tủ lạnh bảo quản sinh phẩm Tủ ATSH cấp Nồi hấp ướt Máy ly tâm nhỏ để bàn Máy ly tâm lạnh tốc độ tối đa 14 000 vòng/phút Máy vortex Giá tích lạnh Tủ thao tác PCR Máy realtime PCR Máy ủ nhiệt Máy làm đá vảy Tủ lạnh âm sâu Tủ lạnh -20°C Số lượng TB cần dùng cho rRT-PCR 01 03 01 01 01 01 02 01 02 02 01 01 01 01 01 01 II YÊU CẦU CHUNG 2.4 Bảo đảm chất lượng xét nghiệm - Trước xét nghiệm : + Đảm bảo chất lượng mẫu đầu vào: + Hiệu chuẩn hiệu chỉnh máy móc/Trang thiết bị + Kiểm tra chất lượng hóa chất sinh phẩm & vật tư tiêu hao - Trong xét nghiệm: + Nội kiểm + Đánh giá từ bên - Sau xét nghiệm: +Bảo quản lưu trữ bệnh phẩm Hình 2.2 Máy realtime PCR +Tiêu hủy bệnh phẩm III PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Nguyên lý + Xét nghiệm Mutiplex realtime RT-PCR định type virus Dengue khuếch đại đoạn gen đa mồi, phiên mã ngược, khuếch đại đoạn gen đích chuẩn đốn thời gian thực Hình 3.1 Mẫu huyết Hình 3.2 Mẫu máu 3.2 Thành phần phản ứng phương pháp thực 3.2.1 Thành phần phản ứng Bảng Bảng mồi mẫu dò cần để tiến hành xét nghiệm Dengue Dengue Dengue Dengue Mồi mẫu dị Trình tự (5’-3’) Nồng độ D1 F CAA AAG GAA GTC GTG CAA TA 100µM D1 C CTG AGT GAA TTC TCT TCT CTA CTG AAC C 100µM Probe Denv1 CAT GTG GTT GGG AGC ACG C 50µM D2 F CAG GTT ATG GCA CTG TCA CGA T 100µM D2 C CCA TCT GCA ACA CCA TCT C 100µM Probe Denv2 CTC TCC GAG AAC AGG CCT CGA CTT CAA 50µM D3 F GGA CTG GAC ACA CGC ACT CA 100µM D3 C CAT GTC TCT ACC TTC TCG ACT TGT CT 100µM Probe Denv3 ACC TGG ATG TCG GCT GAA GGA GCT TG 50µM D4 F TTG TCC TAA TGA TGC GAA GGA GCT TG 100µM D4 C TCC ACC TGA GAC TCC TTC CA 100µM Probe Denv4 TTC CTA CTC CTA CGC ATC GCA TTC CG 50µM - Pha sinh phẩm/hóa chất Thao tác thực tủ thao tác PCR phòng chuẩn bị dung dịch phản ứng - Rã đơng hóa chất, sinh phẩm cần sử dụng, trộn nhẹ vortex, ly tâm ngắn xếp hoá chất, sinh phẩm lên hộp tích lạnh - Ghi sơ đồ mẫu ứng với vị trí mẫu plate - Xác định số lượng phản ứng (N) cần làm: N = n + (với n: tổng số mẫu xét nghiệm cộng với chứng dương RNA chứng âm) tính lượng dung dịch phản ứng theo bảng sau: Bảng Sinh phẩm dùng cho phản ứng đa mồi rRT-PCR Sinh phẩm Nước tinh 2X reagent Mix Mồi D1 F (100µM) Mồi D1 C (100µM) Probe Denv-1 (50µM) Mồi D2 F (100µM) Mồi D2 C (100µM) Probe Denv-2 (50µM) Mồi D3 F (100µM) Thể tích ( cho mẫu µl) 3,7 12,5 0,25 0,25 0,45 0,125 0,125 0,45 0,25 Thể tích ( N=(n+1) mẫu µl) cho 3,7 x N 12,5 x N 0,25x N 0,25x N 0,45x N 0,125x N 0,125x N 0,45x N 0,25 x N Sinh phẩm Thể tích ( cho mẫu µl) Thể tích ( N=(n+1) mẫu µl) cho Mồi D3 C (100µM) 0,25 0,25x N Probe Denv-3 (50µM) 0,45 0,45x N Mồi D4 F (100µM) Mồi D4 C (100µM) Probe Denv-4 (50µM) Superscript III RT/Platium Taq mix Tổng RNA mẫu 0,125 0,125 0,45 0,125x N 0,125x N 0,45x N 0,5 0,5x N 15 10 3.2 Thành phần phản ứng phương pháp thực 3.2.2 Các bước tiến hành phản ứng đa mồi PCR Hình 3.3 Các bước tiến hành phản ứng realtime PCR 11 Bảng Cài đặt chu trình nhiệt cho phản ứng đa mồi RT-PCR Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút:giây) 50 30:00 95 2:00 95 0:10 60 0:30 10 ∞ Số chu kỳ >45 12 3.3 Kết đối chứng Chứng dương Denv-1 có đường khuếch đại mồi Denv-1 trước chu kỳ 38, khơng có đường khuyếch đại ba mồi Denv lại - Chứng dương Denv-2 có đường khuếch đại mồi Denv-2 trước chu kỳ 38, khơng có đường khuyếch đại ba mồi Denv lại - Chứng dương Denv-3 có đường khuếch đại mồi Denv-3 trước chu kỳ 38, khơng có đường khuyếch đại ba mồi Denv cịn lại - Chứng dương Denv-4 có đường khuếch đại mồi Denv-4 trước chu kỳ 38, khơng có đường khuyếch đại ba mồi Denv cịn lại - Chứng âm khơng có đường khuếch đại (tín hiệu huỳnh quang) tất mồi có đường khuếch đại sau chu kỳ 3.4 Đọc kết kết luận - Đọc kết mẫu tất chứng dương chứng âm đạt - Mẫu âm tính: khơng có đường khuyếch đại (khơng có tín hiệu huỳnh quang) đường khuếch đại sau chu kỳ 38 tất mồi - Mẫu dương tính với DENV týp có đường khuyếch đại mồi (Ct