Với các thành tựu nổi bật đã được xem xét gần đây như loài sâu sáp được đánh giá cao khi có khả năng tiêu thụ được nhựa nhờ vào hệ sinh có trong hệ thống tiêu hóa hoặc khả năng tiết ra e
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khoa : KHOA HỌC SINH HỌC Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã môn học : 211402 Nhóm thực hiện : Nhóm 1 thứ 4 ca 2 Niên khoá : 2021-2025 TP HCM, tháng 10, năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHỦ ĐỀ: CHUYỂN GEN PETASE VÀO TRONG TRỨNG CỬA BƯỚM ĐÊM (ẤU TRÙNG SÂU SÁP) BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM Gảng viên hướng dẫn: TS Huỳnh Văn Biết Ths Trương Quang Toản Sinh viên thực hiện: Lã Chí Đan 21126296 DH21SHA Tạ Thanh Nhàn 21126435 DH21SHA Nguyễn Quang Huy 21126361 DH21SHA Ngô Thanh Thảo 21126505 DH21SHA Niên khóa: 2021-2025 Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2023 MỤC LỤC Chương 1 Mở đầu .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 Chương 2 Tổng quan tài liệu 2 Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 4 3.1 Vật liệu 4 3.2 Phương pháp nghiên cứu 4 Chương 4 Thảo luận và đề nghị 6 4.1 Thảo luận 6 4.2 Đề nghị 7 Tài liệu tham khảo………………………………………………………………………… Chương 1 Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Nhựa là một vật liệu thần kì khi đã thay đổi cách sống của con người với những tiện ích như vô trùng, bền bỉ, có giá thành thấp và dễ dàng tìm thấy ở mọi nơi Bên cạnh đó để một túi nhựa nylon phân hủy có thể mất cả một thiên niên kỉ và đó lại trở thành vấn đề khó khăn cho việc xử lý rác thải nhựa Mỗi năm thế giới tạo ra khoảng 400 triệu tấn rác thải nhựa Tại những nơi xa xôi và hoang sơ nhất vẫn có sự tồn tại của nhựa ở các hình thái khác nhau cùng tồn tại Khi nhựa đi vào môi trường, nó sẽ hình thành các hạt vi nhựa (đường kính < 5 mm) dưới tác động của sự mài mòn vật lý, ăn mòn hóa học và phân hủy sinh học Với lượng rác thải to lớn đó thì 9% được tái chế, 12% được đốt nhưng với 79% còn lại vẫn còn loanh quanh đó Đáng chú ý khi lượng rác thải của đại dương có nguồn gốc từ đất liền chiếm khoảng 80%, người ta ước tính rằng 80% rác thải biển là rác thải nhựa Bởi sự tồn tại của nhựa ở mọi nơi dẫn đến việc các động vật biển có thể bị vướng vào những chiếc lưới không thể thoát ra hoặc nuốt nhầm khi tưởng đó là thức ăn Có những nghiên cứu cho thấy khoảng 90% những loài chim biển đã từng tiêu thụ nhựa, vô số những loài động vật được tìm thấy trong tình trạng chết đói với dạ dày chứa đầy rác không thể tiêu hóa Nổi bật nhất cho sự việc này chính là sự kiện con cá voi nhà táng đã chết và trôi dạt vào bờ biển Sulawesi của Indonesia sau khi nuốt một lượng lớn rác thải nhựa vào bụng Bên cạnh việc lượng rác thải khi hóa thành vi nhựa sẽ tăng nguy cơ xâm nhập vào chuỗi thức ăn của động vật như việc các sinh vật phù du hấp thu vi nhựa và những con cá nhỏ lại ăn chính sinh vật phù du đó, sau đó những sinh vật có kích thước lớn hơn lại ăn những con cá đó Cho thấy việc xử lý rác thải nhựa là một vấn đề cấp thiết mang tính chất toàn cầu khi mà lượng nhựa được thải ra môi trường tăng dần qua các năm Với các thành tựu nổi bật đã được xem xét gần đây như loài sâu sáp được đánh giá cao khi có khả năng tiêu thụ được nhựa nhờ vào hệ sinh có trong hệ thống tiêu hóa hoặc khả năng tiết ra enzyme để phân hủy nhựa Polyethylene Terephthalate (PET) của vi khuẩn Ideonella sakaiensis Khi kết hợp gene PETase vào con sâu sáp nhằm gia tăng hiệu suất tiêu thụ nhựa, hạn chế sự phụ thuộc vào hệ sinh tiêu hóa có trong con sâu Đây là mục tiêu và hướng nghiên cứu nhằm tạo ra sinh vật biến đổi gene có tác dụng phân hủy 1 rác thải nhựa, xem xét mô hình xử lý nhựa bằng côn trùng và giảm thiểu sự ảnh hưởng nhựa tới môi trường tự nhiên 1.2 Mục tiêu đề tài Xử lý rác thải và đặc biệt là rác thải nhựa đang là mối nguy cấp trên toàn cầu Đặt biệt, Việt Nam là một trong những nước có lượng rác thải “khổng lồ” thải ra môi trường mỗi năm Đây là một con số rất đáng báo động và cần được can thiệp lâu dài Vì vậy, một trong những giải pháp sử dụng để giảm thiểu rác thải nhựa là sử dụng sâu sáp có khả năng xử lý rác thải nhựa nhằm giảm lượng nhựa đang tồn động trong môi trường sống và lượng nhựa đang thải ra, góp phần bảo vệ môi trường sống của các loài sinh vật sống Đối với đối tượng nghiên cứu là sâu sáp là một loài ngoài có khả năng sử dụng polyetylen (PE) theo Federica Bertocchini, một nhà khoa học thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Tây Ban Nha Cùng với đó, vi khuẩn Ideonella sakaiensis là loài mới được tìm thấy vào năm 2016 và được cho là có khả năng “xử lý” nhựa Polyetylen terephtalat (PET), một loài nhựa được sử dụng trong may mặc và thực phẩm Nhựa PE và nhựa PET là hai loại nhựa được sử dụng rộng rãi trong nhu cầu cuộc sống của con người Sự kết hợp giữa hai đối tượng sâu sáp và vi khuẩn Ideonella sakaiensis hi vọng sẽ là một hướng đi mới, một giải pháp mới nhằm giải quyết một phần vấn đề rác thải nhựa đang tồn tại, đồng thời góp phần vào công cuộc bảo vệ môi trường, một vấn đề đang rất cấp bách hiện nay Chương 2 Tổng quan tài liệu Các giải pháp xử lý rác thải nhựa an toàn, hiệu quả và thân thiện với môi trường vẫn đang còn là một vấn đề cấp bách và giải quyết lâu dài Sự phát hiện loại vi khuẩn mới của Đại học Keio, vi khuẩn Ideonella sakaiensis đã tạo ra một bước ngoặt mới Nhờ có enzyme PETase mà vi khuẩn Ideonella sakaiensis có khả năng phân hủy nhựa Polyetylen terephtalat (PET) thành Ethylene glycol và Terephthalic acid nhờ hai loại enzyme PETase và MHETase Bài báo cáo đã sử dụng enzyme PETase để phân hủy nhựa thông qua sâu sáp Tiếp nhận kết quả của Đại học Keio, tức là vi khuẩn Ideonella sakaiensis lẫn trình tự gen và đoạn aminoacid có khả năng thực hiện phân hủy nhựa PET Trước tiên, cần có được đoạn DNA có khả năng mã hóa cho đoạn amino acid bằng phương pháp suy biến 2 Sau khi biết được đoạn DNA cần tìm tiếp tục sử dụng PCR để có được đoạn gen cần tìm Cuối cùng là tạo dòng và đưa đoạn gen mục tiêu vào trứng bướm đêm Hai đối tượng chính được sử dụng trong bài là sâu sáp (Galleria mellonella) và vi khuẩn Ideonella sakaiensis Cụ thể, Galleria mellonella, loài sâu bướm sáp lớn hay bướm đêm tổ ong, là một loài bướm đêm thuộc họ Pyralidae, bộ Lepidoptera G mellonella được tìm thấy trên khắp thế giới Đây là một trong hai loài bướm đêm sáp, loài còn lại là loài bướm đêm sáp nhỏ hơn Trứng G mellonella được đẻ vào mùa xuân và chúng có bốn giai đoạn sống Ấu trùng của G mellonella cũng thường được sử dụng làm sinh vật mẫu trong nghiên cứu Một số nghiên cứu ứng dụng và đánh giá khả năng tiêu thụ nhựa của loài sâu sáp Phát hiện này được dẫn đầu bởi Federica Bertocchini, một nhà sinh học phát triển tại Đại học Cantabria ở Tây Ban Nha Lần đầu tiên cô nhận thấy khả năng này là khi dọn dẹp tổ ong ở sân sau Cô bắt một số con sâu sáp (Galleria mellonella) sống trong tổ và cho chúng vào một chiếc túi nhựa cũ Tuy nhiên, khi cô kiểm tra chiếc túi một giờ sau đó, cô phát hiện ra những lỗ nhỏ chứa ấu trùng ở phần túi Đối với đối tượng là vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 có chi Ideonella thuộc họ Comamonadaceae, lớp Betaproteobacteria Các chủng thuộc chi Ideonella là các vi khuẩn gram âm, hiếu khí và ưa nhiệt, thẳng hoặc hơi cong, không bào tử Chúng di động nhờ hai hoặc nhiều tiên mao cực hoặc cận cực Khuẩn lạc hình tròn, nhẵn và không có sắc tố Những vi khuẩn này dương tính với catalase và oxidase Với mục địch phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy và đồng hóa PET, Yoshida đã thành công khi tìm ra một loài mới thuộc chi Ideonella Và được đặt tên Ideonella sakaiensis 201-F6 (lưu tại Trung tâm Thông tin Quốc gia Cơ sở dữ liệu phân loại thông tin công nghệ sinh học dưới mã định danh 1547922) Nó có thể sử dụng PET làm nguồn năng lượng và carbon chính Khi nuôi trên PET, chủng này tạo ra hai loại enzyme có khả năng thủy phân PET và chất trung gian phản ứng là axit terephthalic mono(2-hydroxyethyl) Cả hai enzym đều cần thiết để enzyme chuyển đổi PET một cách hiệu quả thành hai monome lành tính với môi trường, axit terephthalic và etylen glycol 3 Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu Sâu sáp (Galleria mellonella) Ideonella sakaiensis 201-F6 Vetor pJet1.2 Thiết bị vi tiêm Máy luân nhiệt 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vi khuẩn Ideonella sakaiensis Vi khuẩn Ideonella sakaiensis thuộc chi Ideonelle, họ Comamonadaceae Đây là một loài vi khuẩn có khả năng phân hủy và tiêu thụ nhựa Polyetylen terephtalat (PET) Được phân lập từ mẫu ở cơ sở tái chế chai nhựa ở Sakai, Nhật Bản bởi nhóm nghiên cứu được dẫn dắt bởi Kohei Oda thuộc Viện công nghệ Kyoto và Kenji Miyamoto thuộc Đại học Keio vào năm 2016 Kế thừa kết quả từ Viện công nghệ Kyoto và Kenji Miyamoto thuộc Đại học Keio, chúng tôi có được vi khuẩn Ideonella sakaiensis 3.2.2 Suy biến đoạn DNA mục tiêu Ta đã có enzym PETase phân hủy PET trong vi khuẩn, do đó ta cần tình tự đoạn DNA mã hóa cho enzym này và đây cũng chính là đoạn DNA mục tiêu ta cần tìm Dùng công nghệ giải trình tự protein để giải mã trình tự enzym đó, dựa trên trình tự đã giải ta suy ra tổ hợp các bộ ba mã hóa codon Từ đó ta tạo ra đoạn dò để tìm trình tự DNA vi khuẩn Ideonella sakaiensis mục tiêu trong các DNA tổ hợp ta tạo ra từ các tổ hợp codon trên Sau khi tìm kiếm DNA mục tiêu bằng đoạn dò, ta cho nó biểu hiện để kiểm tra có đúng là đoạn DNA cần tìm Sau đó ta thiết kế primer đặc hiệu cho DNA mục tiêu để khuếch đại đoạn gen ta tìm kiếm và dùng chúng sau này 4 3.2.3 Tách DNA mục tiêu từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis Tiến hành tăng sinh vi khuẩn Ideonella sakaiensis trên môi trường chọn lọc và sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Biết được trình tự đoạn DNA mục tiêu (đoạn DNA có khả năng mã hóa cho enzyme PETase) nhờ phương pháp suy biến Sử dụng đoạn primer đã thiết kế tiến hành khuếch đại để có được nhiều đoạn gen mã hóa cho gen mục tiêu Mang kết quả của PCR đi điện di để kiểm tra đoạn DNA đã được khuếch đại đúng Đoạn DNA được khuếch đại sẽ là vật liệu sử dụng cho tạo dòng 3.2.4 Tạo dòng Sử dụng vetor pJet 1.2 để tạo dòng và chuyển gen Cụ thể, dùng enzyme Kpn2l và enzym Xbal để mở vòng vetor pJet 1.2, đồng thời dùng adapter gắn đoạn gen có khả năng mã hóa cho enzyme đã tìm được để đoạn DNA có khả năng gắn với đoạn vector mong muốn để tạo dòng Trộn vector pJet1.2 đã mở vòng và đoạn DNA mục tiêu đã được thiết kế sao cho có thể liên kết với vector Vì vậy ta thu được vetor tái tổ hợp 3.2.5 Dùng vi khuẩn E Coli để gia tăng số lượng vector tái tổ hợp Đầu tiên, ta cần làm cho E Coli có khả năng khả nạp vector tái tổ hợp bằng CaCl2 làm được điều đó cần loại bổ sung enzyme exonuclease và nuôi cấy có nồng độ CaCl2 cao giúp màng tế bào có khả năng cho DNA đi vào Sau đó, thêm ion Ca2+ vào dịch huyền phù tế bào để tăng khả năng bám vào màng ngoài tế bào vi khuẩn E Coli Tiếp theo, biến nạp để đưa vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E Coli Thêm CaCl2 lạnh vào dịch nuôi cấy nhằn tăng nồng độ CaCl2 và giữ trên đá lạnh để giữ nhiệt độ của dịch huyền phù tế bào ở nhiệt độ thấp Tiếp theo thực hiện sốc nhiệt bằng cách ngâm dịch huyền phù tế bào được chia nhỏ vào các ống eppendorf đang ở nhiệt độ thấp vào bồn nhiệt 42oC trong khoảng 40 – 50 giây Tiếp tục chuyển các eppendorf đặt lên đá lạnh giữ trong 2 phút, sau đó bổ sung môi trường LB lỏng tiến hành tăng sinh trong vòng 1 giờ Tiếp đó, tiến hành chọn lọc vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng cách cấy trải trên môi trường LB rắn có thêm kháng sinh ampicilin chọn lọc Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và thu nhận kết quả Quan sát đĩa pertri gạt lấy khuẩn lạc (nếu vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp có gene kháng ampicilin và gene mục tiêu sẽ sống và hình thành khuẩn lạc) trên mặt thạch để tiến hành bước tăng sinh tiếp theo 5 Tiếp tục tăng sinh trong LB lỏng để chuẩn bị cho quá trình ly trích plasmid tái tổ hợp Sau khi ly trích và điện di, ta thu lấy plasmid mang gen mục tiêu 3.2.6 Sử dụng vi tiêm để đưa vector vào trứng sâu sáp Sử dụng trứng bướm đêm là đối tượng để chuyển plasmid tái tổ hợp đã thu được ở trên, tức là vetor mang gen có khả năng mã hóa để sản xuất enzyme PETase vào trứng của bướm đêm Dưới kính hiển vi, chúng ta thực hiện thao tác vi tiêm plasmid tái tổ hợp vào trứng bướm đêm Sử dụng dùng đầu tiêm hút các vector, dùng đầu hút để cố định trứng sâu, sau đó dùng đầu tiêm đâm vào trứng sâu rồi từ từ tiêm vector vào trong trứng 3.2.7 Ấp trứng bướm đêm sau khi đã thực hiện vi tiêm Sau khi tiến hành vi tiêm, đem trứng bướm đêm ấp ở nhiệt độ 20oC – 30oC trong khoảng 3 – 4 ngày Sau thời gian này từ trứng ban đầu sẽ nở ra sâu sáp Galleria mellonella (sâu sáp) 3.2.8 Kiểm tra sự hoạt vector được chuyển vào trong sâu sáp Những con sâu sáp này sẽ được đặt trong môi trường chứa nhựa PET để đánh giá xem có sự hoạt động của enzyme PETase hay không Nếu những con sâu sáp sống và sinh trưởng bình thường thì chứng tỏ gene mã hóa enzyme PETase đã hoạt động và biểu hiện ra bên ngoài, trong trường hợp những con sâu này chết thì khả năng cao vector mang gen mục tiêu được chuyển vào đã không hoạt động Chương 4 Thảo luận và đề nghị 4.1 Thảo luận Trong trường hợp những con sâu sáp sống và phát triển bình thường từ nguồn dinh dưỡng là nhựa PET thì ta có thể kết luận rằng đã đạt được mục tiêu ban đầu là chuyển 6 thành công gene mà hóa enzyme PETase thành công vào trong trứng của bướm đêm nhằm mục đích để sâu sáp nở ra từ trứng này có mang gene mục tiêu và biểu hiện ra để thực hiện hành vi phân hủy nhựa PET Trong trường hợp ngược lại trứng của bướm đêm sau khi được vi tiêm không nở thành sâu sáp thì cần xem xét rằng phương pháp lựa chọn để thực hiện có đúng hoặc phù hợp hay không, liệu có làm tổn thương trứng dẫn đến tình trạng trứng không thể nở Ngoài ra, nếu trứng có nở tuy nhiên sâu sáp lại không thể sống và phát triển trong môi trường nhựa PET thì chúng ta cần đánh giá lại khả năng gene mục tiêu được dung nạp cũng như biểu hiện từ đó tiến hành đánh giá mức độ và tỉ lệ thành công của phương pháp trên Từ đó không ngừng thử nghiệm để tìm ra phương pháp phù hợp nhất nhằm nâng tỉ lệ thành công lên mức cao nhất 4.2 Đề nghị Với việc chuyển thành công gene mục tiêu chúng ra cần tiếp tực tiến hành theo dõi và đánh giá khả năng di truyền của cá thể đời đầu tiên cho các cá thể đời sau, đánh giá các yếu tố giúp di truyền gene này lại cho thế hệ sau cũng như các yếu tố của thể làm cho gene bị bất hoạt dẫn đến không thể biểu hiện ở đời sau dù cá thể đó có mang gene Ngoài ra đối mặt với thực trạng rác thải nhựa ngày càng tăng cả về số lượng cũng như chủng loại gây nên sức ép rất lượng cho môi trường vì thế cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nhằm có thể tìm ra và trang bị thêm cho sâu sáp khả năng phân hủy các loại rác thải nhựa khác Từ đó làm tăng giá trị của sâu sáp, tiết kiệm chi phí nhờ một tác nhân mà có thể xử lí nhiều loại đối tượng khác nhau, cũng như tăng sự đa dạng đối với các đối tượng nhựa mà sâu sáp có thể xử lí Bên cạnh các hướng đi mới thì việc kiểm soát tránh làm thất thoát sản phẩm biến đổi gne ra môi trường tự nhiên cũng là một vấn đề rất đáng để lưu ý và nghiên cứu Nên thực hiện thêm nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ an toàn của gene được chuyển cũng như đối tượng mang gene chuyển, khả năng bị thất thoát gene chuyển Ngoài ra cần có các đánh giá nghiên cứu về tác hại đối với môi trường tự nhiên nếu như gene này bị thất thoát 7 Tài liệu tham khảo Bojórquez-Quintal E., Escalante-Magaña C., Echevarría-Machado I., Martínez- Estévez M 2017 Aluminum, a Friend or Foe of Higher Plants in Acid Soils Frontiers in Plant Science 8 DOI: 10.3389/fpls.2017.01767 Morris B 2003 The components of the Wired Spanning Forest are recurrent Probability Theory and Related Fields,125:259-265 DOI: 10.1007/s00440-002-02360 seyyedi S.r., Kowsari E., Ramakrishna S., Gheibi M., Chinnappan A 2023 Marine plastics, circular economy, and artificial intelligence: A comprehensive review of challenges, solutions, and policies Journal of Environmental Management, 345:118591 DOI: https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2023.118591 8