Trang 1 BẢN CHẤT+ Đoạn oligon càng dài thì tính chuyên biệt càng cao + Chứ năng máy PCR – máy luân nhiệt Thermos cycle+ Nguyên lí dựa trên biến tính và hồi tính+ Gen mục tiêu xác định bằ
BẢN CHẤT + Đoạn oligon dài tính chun biệt cao + Chứ máy PCR – máy luân nhiệt (Thermos cycle) + Nguyên lí dựa biến tính hồi tính + Gen mục tiêu xác định cặp primer ngược – xuôi + Enzmye DNA polymerase xúc tác + Real time PCR: PCR bình thường Có khả định lượng – thơng qua chất phát huỳnh quang PCR => định tính – xác định có đoạn gen mục tiêu hay khơng Realtime PCR = q PCR ( quantification: định lượng; quantitation Xác định số lương gen mục tiêu, bản, bao hàm định tính tính Tái bản, nhân DNA dựa biến tính hồi tính Tái bản, nhân DNA dựa biến tính hồi tính Thành phần Mẫu DNA Primer F – R ( ngược xuôi) dNTPs ( A – T – G – C) Enzmye DNA polymerase III ( Taq; Pfu; … – thu nhật từ vi khuẫn khác chức giống Mg 2+ ( MgCl – yếu tố kích hoạt DNA polymerase; kết nối dNTPs; ….) H2O không chứa nu Buffer – dung dịch đệm – làm giữ độ pH thành phần phản ứng thay đổi xảy tốt gồm muối khooang1 Mẫu DNA Primer F – R ( ngược - xuôi) dNTPs ( A – T – G – C) Enzmye DNA polymerase III ( Taq; Pfu; … – thu nhật từ vi khuẫn khác chức giống Mg 2+ ( MgCl – yếu tố kích hoạt DNA polymerase; kết nối dNTPs; ….) H2O không chứa nu Buffer – dung dịch đệm – làm giữ độ pH thành phần phản ứng thay đổi xảy tốt gồm muối khooang1 Chất phát huỳnh quang – chất nhận lượng luồng ánh sáng tới tích lũy phát lượng bước sống cao SYBR Green – khoảng bước sóng 490 nm -> phát ánh sáng 530 nm Đọc kết quả: PCR -> Điện di -> Nhuộm ( Gel Red ; Ethedium Brommi Quy trình : Biến tính -> Bắt cặp -> Kéo dài SYBR Green chui vào DNA -> phát sáng -> nhận biết có mặt DNA Khác biệt Thu ảnh thơng qua detectior thu nhận tính hiệu ánh sáng Nguyên lý: = PCR + chất phát huỳnh quang 1.1 Chất phát huỳnh quang ( trạng thái tự do, ko gắn DNA, ko có ánh sáng kích thích ( ko có tính hiệu) => ko phát sáng a SYBR Green: + Bắt 490 nm phát 530 nm + DNA nhiều đỉnh đồ thị cao + Đồ thị phát tỉ lệ thuận với tỉ lệ DNA xuất mẫu Trong tube mẫu có: - Gen mục tiêu - Các sản phẩm gây dương tính giả: Đoạn sole Dimer ( primer xuối ngược liên kết với nhau) DNA ngoại lai Do SYBR – Green bắt với DNA sợi đôi => kết bị sai lệch -> khắc phục nghiên cứu đoạn Probe ( đoạn dò ) a.1 Probe: Bản chất Oligon nucleotide Có khả phát tín hiệu – chất phát huỳnh quang Ví dụ Kỹ thuật lai ( hoạt động dựa biến tính hồi tính): + DNA – DNA – Southern blot + RNA – RNA – Northern blot + Protein – Protein – Western blot Phát tín hiệu đánh dấu đồng tử phóng xạ photpho Hiện có loại phổ biến: I Đoạn dị phân cắt: Taqman II Đoạn dò tách rời: Molecular Beacons; FRET III Đoạn dò gắn kết primer: Ampliflour I Đoạn dò phân cắt: Taqman – liên quan tới enzyme Taq polymerase + Là đoạn oligo nucleotide – có trình tự bổ xung với DNA mục tiêu nằm đoạn mồi quy định + Có khả phát tính hiệu huỳnh quang đầu – đầu có khả phát tính hiệu huỳnh quang đầu cịn lại có chức ức chế tín hiệu huỳnh quang -> trạng thái tự ko phát huỳnh quang phát tham gia phản ứng Quy trình Biến tính : sợi tách Bắt cặp: Mồi xi gắn sợi xi Mổi ngược gắn sợi ngươc Đầu dị bám vào DNA mục tiêu nằm khoảng đoạn mồi ngược xuôi Kéo dài: Chiều kéo dài diễn -> cấu trúc đoạn dò bị phá hủy Khi có ánh sáng chiếu tới phát tính hiệu ( ko cấu trúc gây ức chế) Kết thúc chu kì Đèn tín hiệu ko chiếu liên tục Một đoạn dò hoạt động chu kì Tín hiệu có tính tích lũy -> nhiều chu kì -> ánh sáng tích lũy -> nhiều dần lên sáng dần lên II Đoạn dị Tách rời a Molecular Beacons Biến tính: Duỗi dựa lực nu Bắt cặp: Dính vào DNA mục tiêu -> bắt đầu phát tín hiệu Kéo dài: Dùng loại enzyme khác có khả cắt đứt liên kết hydro mà ko cắt nu => đoạn dò bị tách tái sử dụng chu kì Tín hiệu có tính tích lũy -> nhiều chu kì -> ánh sáng tích lũy -> nhiều dần lên sáng dần lên b FRET yêu cầu đứng gần -> phận tiếp nhận nhận bước sóng bắt đầu kích thích phát tính hiệu Cơ chế y chang Molecular Beacons III Đoạn dò gắn kết primer: Ampliflour