• Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn bằng cách tận dụng ưu điểm của Bst ADN Polymerase Bacillus stearothermophilus và Trang 3 • Dù m
KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) 1.TỔNG QUAN KỸ THUẬT LAMP • LAMP viết tắt từ “LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION” có nghĩa khuếch đại ADN điều kiện đẳng nhiệt thơng qua cấu trúc vịng hay móc (loop) • LAMP phát triển vào năm 2000 nhóm tác giả T Notomi (Nhật Bản) • Đây phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu cao thời gian ngắn cách tận dụng ưu điểm Bst ADN Polymerase (Bacillus stearothermophilus) loạt mồi thiết kế đặc biệt để nhận diện tồn trình tự cách xa ADN đích • Dù đời LAMP ứng dụng vào nhiều lĩnh vực chuẩn đoán mầm bệnh, virus thủy sản, phát nhanh vi sinh vật thực phẩm, môi trường,…LAMP phương pháp khuếch đại gen tiềm có nhiều hứa hẹn tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm để áp dụng vào hướng nghiên cứu • Sử dụng mồi (primer) khác thiết kế đặc biệt nhận đoạn riêng biệt gen đích (target gene) trình phản ứng xảy nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay mạch • Khuếch đại phát gene hồn thành bước cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase có hoạt tính thay mạch chất nhiệt độ cố định (khoảng 65°C) • Phương pháp cho hiệu khuếch đại cao với lượng DNA khuếch đại đến 109-1010 lần vòng 15-60 phút Bởi tính đặc hiệu cao, Sự diện sản phẩm khuếch đại chứng tỏ có mặt đoạn gene quan tâm • Đặc điểm • Khơng cần bước làm tách mạch đơi thành dạng mạch đơn • Cả phản ứng khuếch đại xảy liên tục điều kiện đẳng nhiệt • Hiệu khuếch đại cao • Thiết kế primers nhận đoạn riêng biệt, phương pháp LAMP khuếch đại đặc hiệu đoạn gen quan tâm • Tổng giá thành giảm LAMP khơng địi hỏi hố chất đặc biệt thiết bị phức tạp NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT LAMP • Phương pháp dựa tổng hợp ADN thay chuỗi tự xoay vòng thực Bst DNA polymerase (Bacillus stearothermophilus) hai cặp mồi mồi ngồi thiết kế đặc biệt • Ở bước đầu phản ứng LAMP mồi sử dụng, sau suốt phản ứng chu kz mồi sử dụng để tổng hợp ADN thay chuỗi Thiết kế primers Thiết kế loại primers dựa theo đoạn riêng biệt đoạn gene quan tâm: đoạn F3c, F2c F1c đầu 3' đoạn B1, B2 B3 đầu 5' • Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp bổ sung với ADN đầu vịng vị trí F2c để tiến hành tổng hợp mạch bổ sung thay Mặt khác, BIP bổ sung vào đầu mạch ADN đầu vòng xảy trình tổng hợp ADN tương tự; • Kết phản ứng hỗn hợp sợi đơi ADN chứa nhiều trình tự ADN mục tiêu với kích thước khác • Cặp mồi gồm mồi mồi xuôi (forward inner primer- FIP), mồi ngược (backward inner primerBIP) mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense antisense ADN đích Trình tự FIP BIP thiết kế sau: • +FIP chứa F1c, đoạn TTTT trình tự F2 bổ sung với F2c • +BIP chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, đoạn TTTT B2 • +Hai mồi bên ngồi B3 bổ sung cho đoạn B3c trình tự F3 bổ sung cho F3c • • Để khởi động phản ứng LAMP, Bst DNA polymerase sử dụng ủ nhiệt độ 60 oC – 65°C Khi gen mục tiêu nhân tố cần thiết ủ nhiệt độ không đổi, bước phản ứng xảy ban đầu sau: Nguyên liệu ban đầu sợi đôi ADN chứa gen mục tiêu + Bước 1: mồi xi FIP chứa trình tự F2 bổ sung vào mạch ADN vị trí F2c + Bước 2: DNA polymerase thực kéo dài sợi ADN từ mồi FIP + Bước 3: mồi F3 bổ sung vào F3c kéo dài Sự tổng hợp sợi ADN mồi DNA polymerase dẫn đến giải phòng sợi ADN tổng hợp từ mồi FIP + Bước 4: sợi đơi ADN hình thành từ sợi khuôn mồi F3 +Bước 5: sợi đơn ADN tổng hợp từ mồi FIP khn giải phóng Vì đầu 5’ sợi có chứa trình tự bổ sung F1c F1 nên hình thành cấu trúc vòng + Bước 6: sợi ADN tạo từ bước làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp sợi mồi B3 có chức F3 tổng hợp sợi giải phóng sợi ADN mồi BIP + Bước 7: sợi đơi ADN hình thành từ mồi B3 sợi tổng hợp từ bước + Bước 8: sợi ADN tổng hợp từ mồi BIP sợi chứa mồi FIP hình thành cấu trúc vịng đầu bổ sung cặp trình tự với • Bước Mạch đơi DNA tạo thành qua trình điễn tả bước (6) Hình 8: Tổng hợp mạch bổ sung nhờ primer B3 • Bước Đoạn bổ sung gắn BIP thay bước (6) tạo thành cấu trúc vòng đầu nhìn cấu trúc tạ Cấu trúc cấu trúc khởi đầu cho vòng khuếch đại phương pháp LAMP Quá trình bên coi trình tạo cấu trúc ban đầu cho vịng LAMP Hình 9: Sự tạo thành đầu vịng đoạn DNA đơn • Bước 8-11 Cấu trúc DNA hình tạ nhanh chóng chuyển thành DNA mạch vịng tổng hợp DNA tự mồi FIP bám vào đoạn mạch đơn DNA vịng mồi q trình tổng hợp DNA thay mạch giải phóng đoạn Dna tổng hợp trước Mạch đơn giải phóng tao cấu trúc mạch vịng đầu 3’ tạo đoạn B1c bổ sung B1 Sau đầu 3’ đoạn B1, tổng hợp DNA dùng cấu trúc làm template giải phóng mạch bổ sung gắn FIP (Bước (9)) Mạch đơn giải phóng tạo cấu trúc tạ hai đầu có đoạn bổ sung F1 - F1c B1c - B1 (Bước (11)) Cấu trúc cấu trúc ngược lai cấu trúc tạo thành bước (8) Giống từ bước (8) đến (11), cấu trúc bước (11) dẫn đến trình tổng hợp DNA tự mồi đầu 3’ đoạn B1 Hơn nữa, BIP bám vào đoạn B2c bắt đầu tổng hợp DNA thay mạch, giải phóng đoạn DNA B1 mồi Theo đó, cấu trúc tương tư bước (9) (10) giống cấu trúc bước (8) tạo thành Với cấu trúc tạo thành bước (10), BIP bám vào đoạn mạch đơn B2c, tổng hợp DNA tiếp tục thay đoạn mạch đôi DNA Kết trình nhiều cấu trúc bao gồm nhiều đoạn lặp lại ngược đoạn quan tâm mạch tạo thành