QUÁ TRÌNH THIẾT bị CNSH

QUÁ TRÌNH VÀ THIẾT BỊ CNSH Câu 1.1: Nguyên lý chung phương pháp sắc ký cột, kèm sơ đồ ? a) Nguyên lý hoạt động sắc ký cột - Dung dịch cần phân tích qua cột nhồi loại vật liệu có khả hấp phụ chọn lọc - Các chất hòa tan phân bố ≠ pha di động (lỏng) pha tĩnh (cột hấp phụ) - Dung dịch khỏi cột sau khoảng TG khác thu thành phân đoạn khác - Sắc ký đồ mô tả mối quan hệ chất phân đoạn theo thời gian - Sơ đồ nguyên lý phương pháp sắc ký cột: b) Hệ thống sắc ký cột - Thành phần hệ thống sắc ký cột gồm cột sắc ký, chất nhồi cột, dung môi, detector computer - Cột sắc ký giống burette, gồm ống thủy tinh khóa, khơng cần vạch chia độ, kích thước cột thay đổi từ nhỏ đến lớn - Chất nhồi cột (pha tĩnh) thường dùng silica gel, có loại silica gel pha thuận silica gel pha đảo (silica gel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính nhóm OH, silica gel pha đảo gồm Si có đính gốc alkan R), ngồi cịn dùng alumina, florisil Chất nhồi cột định trình sắc ký Nếu dùng pha thuận, silica gel có gắn nhóm OH giữ chặt chất phân cực hơn, chất không phân cực liên kết với silica gel yếu nên trước, chất phân cực sau Ngoài ra, tùy thuộc vào lượng mẫu mà dùng lượng silica gel bao nhiêu, từ chọn kích cỡ cột sắc ký thích hợp - Việc chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột Nếu dùng silica gel pha thuận (phân cực) chọn dung môi từ không phân cực đến phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thơng thường dùng hỗn hợp dung môi Chú ý dung môi chạy sắc ký cột phải phân cực chút so với dung mơi chạy sắc ký mỏng hạt silica gel dùng cho cột sắc ký to hạt mỏng nên khả tách chút - Mơ hình hệ thống sắc ký cột: Câu 1.2: Cấu tạo hệ thống tinh protein Biologic DuoFlow (Bio-Rad), kèm sơ đồ ? - Mặc dù hệ thống Biologic DuoFlow có nhiều cấu hình khác tất chúng dựa cấu tạo bao gồm: + Máy tính điều khiển truyền kết nối + Máy trạm + Maximizer + Bộ trộn có loại MX-1 mixer Maximizer mixer + Hệ thống phát hiện: Đầu dò UV, đầu dò QuadTec, giám sát độ dẫn, giám sát pH + Hệ thống van: AVR7-3, AVR9-8, SV5-4, SVT3-2 + Bộ thu hồi phân đoạn: BioFrac, Model 2128 Model 2110 + Bộ phận nạp mẫu: DynaLoop, EP-1 Econo Pump, EGP Econo Gradient Pump + Các phụ kiện + Cột sắc ký phụ kiện cột - Sơ đồ cấu tạo hệ thống Biologic DuoFlow (Nguồn: Bio-Rad): Câu 1.3: Cấu tạo chi tiết Workstation hệ thống Biologic DuoFlow (BioRad), kèm sơ đồ ? a) Cấu tạo - Bao gồm: đầu bơm kép, đầu bơm kép có piston kép tương ứng, chuyển đổi áp suất đặt máy trạm đầu bơm Bộ chuyển đổi áp suất có chức đo áp suất hệ thống, hiển thị trạng thái phía hình Manual and Run Các nút rửa (Purge) A B, nút tạm dừng (Pause) bố trí mặt trước máy trạm - Có loại bơm gradient máy trạm F10 F40 (bơm F10 có tốc độ bơm tối đa 10 mL/phút áp suất tối đa 3.500 psi, bơm F40 40 mL/phút 1.000 psi) - Chức nút bảng điều khiển máy trạm + Nút nguồn (power): Đóng mở nguồn điện máy trạm phận kết nối với + Nút tạm dừng (pause): Tạm dừng bơm máy trạm tạm dừng phương pháp chạy Khi nhấn, trạng thái đèn LED bơm A B thay đổi từ màu xanh lục sang nhấp nháy đỏ Để tiếp tục chạy: Nhấn nút lần để khởi động bơm phương pháp, hoặc: Nhấn nút Continue hình Run, hoặc: Nhấn nút START hình Manual + Nút rửa A B (Purge A & B): Trước nhấn hai nút Purge, chuyển valve tiêm AVR7-3 tới vị trí Purge hình Manual để cột sắc ký khơng chịu áp suất tốc độ dòng chảy cao Các nút Purge có đường ống chứa dung dịch kết nối với bơm A B Khi nút nhấn, đèn LED màu xanh lục cho bơm A B nhấp nháy Để dừng dòng chảy, nhấn nút Purge lần đèn LED tắt Các nút không hoạt động hệ thống chạy phương pháp Khi nút Purge nhấn, đầu bơm chạy tốc độ tối đa (mặc định) chúng (F10 10 mL/phút 20 mL/phút sử dụng Maximizer, F40 40 mL/phút 80 mL/phút sử dụng Maximizer) Để thay đổi tốc độ dòng chảy mặc định, chọn Manual Setup từ Options drop-down menu + Đèn cảnh báo (alert light): Đèn LED có chức sau: Màu đỏ: Chỉ bơm bị tắt cố điện, giới hạn áp suất cao thấp vượt ngưỡng Giới hạn áp suất cài đặt hình Manual Run Màu đỏ nhấp nháy: Xuất trình chạy phương pháp có bước ALARM lập trình trước Bộ phận điều hành hệ thống phải đáp ứng trước phương pháp tiếp tục Màu xanh lục: Chỉ bơm chạy - Chức cổng phía trước máy trạm + Cổng khởi động A B: Làm nhiệm vụ khởi động bơm + Cổng bơm mẫu vào/ra: Vị trí gắn đầu bơm để bơm mẫu vào/ra khỏi hệ thống + Cổng chuyển đổi áp suất vào/ra: Vị trí chuyển đổi áp suất vào hệ thống + Cổng bơm dịch rửa vào/ra: Vị trí gắn đầu bơm để bơm dịch rửa nhằm loại bỏ muối kết tinh cặn bẩn để làm piston b) Sơ đồ mặt trước Workstation Câu 1.4: Tính hệ thống Biologic DuoFlow (Bio-Rad) bước trình sắc ký a) Tính bật hệ thống - Thiết kế kiểu module chồng phù hợp với khơng gian phịng thí nghiệm Khay dọc di chuyển tháo rời Thanh ngang đặt vị trí tối ưu cho loại van, cột đầu dị - Dễ nâng cấp cấu hình, phần mềm dễ sử dụng - Bộ trộn đệm: có khả trộn đệm có nồng độ muối pH cụ thể - Thăm dị: tính giúp chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký thơng qua thăm dị pH, thời gian, cột, đệm, tốc độ dịng số lượng mẫu - Phương pháp: chạy nhiều loại sắc ký hệ thống như: lực, tương tác kỵ nước, trao đổi ion lọc gel - Bộ giám sát pH: theo dõi trực tiếp giá trị pH trình sắc ký - Tốc độ bơm hệ thống đầu dò linh hoạt: lưu lượng từ 0,01-80 mL/phút với loại đầu bơm khác Hệ thống đầu dò đa dạng, phổ hấp thụ rộng tạo nên tính linh động cho hệ thống - Bộ thu hồi phân đoạn: hệ thống hỗ trợ thiết lập nhiều dạng thu hồi sản phẩm: thu hồi toàn bộ, thu hồi phần, thu theo ngưỡng - Nhiều lựa chọn cho van: Máy trạm cung cấp kết nối cho van áp suất cao van áp suất thấp Bổ sung Maximizer làm tăng gấp đôi khả năng: van áp suất cao van áp suất thấp - Bộ kit khởi động UNO Q1 anion exchange column: gồm có thuốc thử cần thiết, mẫu protein cột chạy thử nghiệm sắc ký trao đổi anion b) Các bước q trình sắc ký Có nhiều cấu hình Bio-Rad đưa ra, nhìn chung cấu hình hệ thống Biologic DuoFlow trải qua bước thực sau: - Thiết lập hệ thống: Lắp ráp kết nối phận hệ thống van, đầu dò, máy trạm, máy tính, máy đo pH… lại với - Chọn cột sắc ký: Cột lựa chọn lắp vào hệ thống phải phù hợp với mục đích phương pháp sắc ký - Khởi động phần mềm: Mở trình duyệt chạy ch/trình Biologic DuoFlow Software - Chọn phương thức hoạt động: Chọn phương thức mặc định chương trình phương thức thiết lập thủ công - Cài đặt thông số: Điều chỉnh thông số kỹ thuật cần thiết loại sắc ký, tốc độ dòng, áp suất, bước sóng hấp thụ… với cơng cụ (toolbar) chương trình - Chạy để nạp mẫu: Các phương pháp tải mẫu lựa chọn cho phù hợp với thể tích mẫu, tốc độ bơm, tốc độ dịng… - Thu hồi sản phẩm Câu 1.5: Nguyên lý chung trình điện di, kèm sơ đồ a) Nguyên lý chung Điện di tượng dịch chuyển phân tử tích điện tác động điện trường, hay nói cách khác kỹ thuật phân tách phân tử DNA, RNA protein dựa đặc điểm vật lý khối lượng hay điện tích thực chúng Khi phân tử tích điện đặt điện trường, chúng dịch chuyển cực dương (+) âm (-) tùy theo điện tích chúng Protein có điện tích thực dương âm, cịn nucleic acid có điện tích âm khơng đổi nhờ khung đường-phosphate dịch chuyển hướng đến cực dương Các phân tử protein nucleic acid chạy điện di khuôn đỡ giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose polyacrylamide gel Tuy nhiên, kỹ thuật điện di agarose polyacrylamide phổ biến Kỹ thuật sử dụng dung dịch đệm để dẫn điện tạo điện trường đều, gel để phân tách phân tử, chất nhuộm khác để phát vị trí phân tử gel sau điện di Trong đó, polyacrylamide gel dùng để phân tách phân tử protein phân tử DNA có kích thước 1000 base, đồng thời giúp phân tích SNP (single nucleotide polymorphism) 15 phút - Cung cấp đầy đủ loại phần mềm chuyên dụng để triển khai tất ứng dụng, tất lĩnh vực đối tượng: chẩn đoán, nghiên cứu phát mới, xây dựng ngân hàng gen, giám định hình sự, đa dạng kiểu gen đa dạng di truyền - Tóm lại: ABI 3130 hệ thống tiên tiến nay, cho phép tự động hoàn toàn từ khâu đưa polymer lên mao quản đến phân tích Hệ thống có đầy đủ ứng dụng: phân tích microsatellite, SNP, AFLP, LOH b) Tiện ích hệ thống - Cài đặt tối thiểu hoạt động đơn giản, hệ thống cung cấp polymer tự động nhờ khơng cần phải tự nhồi gel vào xylanh, bảo quản rửa mao quản sau chạy - Bộ cấp nhiệt cho buồng đọc (detection cell heater) module tối ưu 3130 POP-7™ tạo nên liệu ổn định có chất lượng cao giúp mở rộng ứng dụng phân tích trình tự phân tích phân đoạn với thời gian làm việc nhanh - Công nghệ mạnh giảm thiểu thực yêu cầu bảo quản - Tăng chất lượng liệu phân tích trình tự ứng dụng phân tích phân đoạn, chiều dài đoạn DNA phân tích tăng lên, khả xử lý tăng lên thời gian chạy ngắn có nhiều lựa chọn cho ứng dụng - Mở rộng chức one-polymer one-array việc đọc trình tự ƯD phân tích phân đoạn, chuyển đổi liền mạch phân tích trình tự phân tích phân đoạn - Hệ thống cung cấp polymer, nạp mẫu, phân tách, đọc phân tích liệu hồn tồn tự động vịng 24 - Cải tiến toàn hệ thống nhằm giúp dễ dàng sử dụng, không cần phải chuyên gia có kết tốt - Hệ thống ABI 3130 nâng cấp với chương trình phân tích DT Cho dù phân tích trình tự, phân tích phân đoạn hay hai, có phần mềm xử lý đáp ứng - Hệ thống xác định trình tự DNA tự động sử dụng kỹ thuật huỳnh quang đa màu phân tách cột mao quản - Sử dụng nhiều loại POP chuyên biệt mao quản với chiều dài khác cho yêu cầu ứng dụng cụ thể - Thời gian chạy 15 phút cho 16 mẫu (3130xl) mẫu (3130) Câu 2.10: Các phần mềm phân tích liệu máy đọc trình tự gen ABI 3130 (Applied Biosystems) Sequencing Analysis Software - Thực basecalling (chuyển tín hiệu màu điện di thành nucleotide tương ứng) Với basecaller KB có thể: + Xác định độ tinh khiết pha trộn nucleotide + Gán giá trị chất lượng cho nucleotide + Phát phân tích thất bại + Tính tốn giá trị chất lượng (QV) cho nucleotide - Phân tích lại liệu cách sửa đổi thiết lập phân tích - Tổng quan liệu cho xử lý cố cách sử dụng số liệu cung cấp - Xuất định dạng phân tích trình tự bao gồm *.seq, *.phd1 *.scf để tích hợp với cơng đoạn phân tích sau - Tạo đường dẫn để theo dõi thay đổi nucleotide thiết lập phân tích Variant Reporter™ Software - Phân tích liệu trình tự tạo trình tự xác cho mẫu - Ghi nhận chỉnh sửa cách sử dụng thuật toán nâng cao chất lượng số liệu bổ sung KB ™ v1.4 Basecaller - Sắp gióng cột trình tự để xác định biến thể - Nhập vào trình tự tham khảo Genbank (NCBI) - Tùy chỉnh trình tự tham khảo cách tạo trình tự bao gồm đặc tính khác nhau, exons, introns, vùng không dịch mã (UTRs) - Thiết lập số liệu kiểm soát chất lượng để lọc liệu chất lượng thấp, đảm bảo kết tin cậy cao giảm thời gian xem xét hướng dẫn sử dụng - Lưu trữ dự án với tập tin mẫu tất liệu tham khảo liên quan (các thiết lập phân tích, tài liệu tham khảo…) cho mục đích chia sẻ liệu SeqScape® Software - Phân tích liệu trình tự tạo trình tự xác cho mẫu - Ghi nhận nucleotide cách sử dụng thuật toán nâng cao chất lượng số liệu bổ sung KB ™ Basecaller - Nhập vào trình tự tham khảo Genbank (NCBI) - So sánh liệu trình tự phân tích với trình tự tham khảo để xác định biến thể biết đến thư viện trình tự liên quan - Hiển thị biến thể amino acid trình tự liên quan MicroSeq® ID Analysis Software - So sánh liệu trình tự loài vi khuẩn nấm chưa biết đến với trình tự vi khuẩn nấm biết lưu trữ thư viện - Tạo danh sách cuối loài sinh vật có số họ hàng mà chưa biết đến, dựa phản ánh phần trăm tương đồng có số họ hàng thư viện trình tự Sequence Scanner Software - Xem, chỉnh sửa, in ấn, xuất định dạng liệu trình tự - Sắp xếp phân tích peak - Lập đồ vết vị trí đĩa tương ứng để hình dung mơ hình chất lượng - Tạo xuất báo cáo đồ họa - Xuất liệu trình tự vào tập tin định dạng bao gồm *.fsta, *.seq, *.phd1 *.scf Câu 3.1: Cấu tạo nguyên lý hoạt động súng bắn gen PDS-1000/He a) Cấu tạo - Thiết bị bao gồm: + Thân máy + Nguồn khí He + Bộ điều áp khí He + Bộ nguồn chân không + Van solenoid + Hệ thống ống nối + Các dụng cụ - Sơ đồ cấu tạo b) Nguyên lý hoạt động - Súng bắn gen Biolistic PDS-1000/He System hay hệ thống dội bom Hãng BioRad sử dụng áp lực cao khí He, giải phóng đĩa an tồn (RD), phần chân không để đẩy macrocarrier (viên đạn lớn) gắn hàng triệu vi đạn vàng tungsten có kích thước hiển vi đến tế bào đích với vận tốc cao Những vi đạn bọc DNA vật liệu sinh học khác để biến nạp Macrocarrier dừng lại sau di chuyển quãng ngắn bị lưới chặn Các vi đạn bọc DNA tiếp tục di chuyển hướng đến tế bào đích để xuyên qua biến nạp vào tế bào - Tốc độ khởi đầu vi đạn súng bắn gen phụ thuộc vào áp suất khí He, hàm lượng chân khơng buồng dội bom, khoảng cách từ RD đến macrocarrier, khoảng cách di chuyển macrocarrier đến lưới chắn, khoảng cách lưới chắn tế bào đích Các yếu tố quan trọng tối ưu hệ thống dội bom khoảng cách đến đích kích thước vi đạn Các thơng số khác cần tối ưu theo kinh nghiệm Câu 3.2: Cấu tạo nguyên lý hoạt động máy chuyển gen xung điện Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) a) Cấu tạo Hệ thống bao gồm: - thân máy - module phụ (CE Module PC Module) - Buồng sốc điện - cuvette có chứa điện cực b) Nguyên lý hoạt động - Gene Pulser Xcell Hãng Bio-Rad loại máy phát xung điện sử dụng tụ điện tạo xung kim xung vuông để chuyển gen vào tế bào Bộ phận tạo xung lên tới 3.000 V mạch điện áp cao, 500 V mạch điện áp thấp Khi tạo xung mạch điện áp cao, phải dùng tụ điện mức 10, 15 25 µF nằm phần thân máy Khi tạo xung điện áp thấp, bắt buộc sử dụng tụ điện CE Module Xung kim xung vuông loại xung điện sử dụng phổ biến - Khi công tắc thứ đóng, tụ điện nạp điện vào tích điện áp cao Khi cơng tắc thứ hai đóng, điện áp phóng điện qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật thường khoảng 500-1.000 V/cm (thay đổi tùy theo kích thước tế bào) vài phần ngàn giây Xung điện làm rối loạn lớp phospholipid kép màng tế bào tạo lỗ tạm thời Khả điện qua màng tế bào lúc tăng lên 0,5-1 V nên phân tử nạp điện qua màng tế bào thông qua lỗ cách thức tương tự điện di Khi ion nạp điện phân tử qua lỗ, màng tế bào phóng điện lỗ đóng lại cách nhanh chóng lớp phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ Lúc phân tử mong muốn tế bào chúng sử dụng cho nghiên cứu Câu 3.3: Các ứng dụng máy chuyển gen xung điện Gene Pulser Xcell (Câu bỏ, không cần học) a) Biến nạp DNA: gen đặc hiệu tạo dịng plasmid sau plasmid đưa vào tế bào vật chủ để nghiên cứu cấu trúc chức gen protein b) Chuyển plasmid trực tiếp tế bào: tế bào vi khuẩn chứa plasmid ủ với dịng khác khơng mang plasmid lại có đặc tính mong muốn - Ðiện áp xung điện tạo lỗ, cho phép số plasmid khỏi tế bào vào tế bào khác - Sau tế bào mong muốn chọn lọc tính kháng kháng sinh phương pháp tương tự khác - Kiểu chuyển gen thực lồi khác - Vì vậy, lượng lớn plasmid chép khuẩn lạc vi khuẩn nhân lên cách nhanh chóng sau chuyển vào tế bào nấm men kỹ thuật xung điện để nghiên cứu c) Dung hợp tế bào kích thích: xuất lỗ thủng màng xung điện chớp nhống tạo cho thấy kích thích dung hợp tế bào d) Phân phối thuốc qua da: xung điện gây lỗ tạm thời màng sinh chất, lỗ tương tự tạo màng lipid kép lớp da chết phía ngồi - Các lỗ cho phép thuốc qua da đến mơ đích - Các bệnh nhân thích phương pháp phương pháp tiêm tránh vấn đề phân hủy hấp thu không liệu pháp uống thuốc hệ tiêu hóa e) Liệu pháp hóa điện khối u ung thư: nhà khoa học nghiên cứu tiềm kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu liệu pháp hóa học - Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện phá vỡ màng tế bào ung thư làm tăng lượng thuốc đến vị trí đích - Một số nghiên cứu cho làm giảm phát triển khối u áp dụng phương pháp cho tế bào ung thư hệ thống mơ hình động vật f) Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép vector mang gen quan tâm biến nạp qua da đến mô đích - Khi hợp vào tế bào thể, protein tổng hợp từ gen thay gen sai hỏng điều trị rối loạn di truyền Câu 3.4: Mô tả buồng sốc điện cuvette máy chuyển gen xung điện Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) a) Buồng sốc điện - Buồng sốc điện hệ thống buồng ngăn Nhấn nút “Tab” phía trước buồng để nhả chốt mở nắp Đẩy nhẹ phần nắp xuống để đóng buồng Để tạo an tồn cho hệ thống này, phần nắp phải đóng lại trước xung điện xuất Do khóa an tồn, nên khơng có xung phát đến cuvette nắp buồng sốc điện mở - Vệ sinh shockpod + Tháo shockpod khỏi thân máy Gen Pulser Xcell Nhấn nút Tab để mở buồng, dùng tua-vít để tháo lỏng ốc vít bảo vệ, nhấc ốc vít bảo vệ khỏi shockpod + Nên dùng vải cotton thấm nước xà phòng ấm để lau chùi vùng xung quanh điện cực, lau khô điện cực vải cotton khô dùng giấy Kimwipe + Lắp ráp lại phận cách đặt bảo vệ vào đáy shockpod, vặn lại ốc vít b) Cuvette - Vị trí cuvett chứa loại cuvette thương mại có - Vơ trùng - Cấu trúc bền - Đường gờ plastic khơng có mối hàn - Bề mặt điện cực nhẵn - Cuvette chứa tế bào vật chủ DNA ngoại lai - Có ba loại: loại có lỗ trống 0,4 cm; 0,2 cm 0,1 cm (Hình 4.22) + 0,1 cm: dùng cho E.coli vi khuẩn khác, cường độ điện trường (CĐĐT) cực đại tới 25 kV/cm + 0,2 cm: dùng cho nấm men, CĐĐT tới 12,5 kV/cm + 0,4 cm: dùng cho động vật có vú, CĐĐT tới 6,25 kV/cm Câu 3.5: Các bước chuẩn bị vi đạn bọc DNA trước bắn gen súng PDS1000/He (Bio-Rad) Quy trình chuẩn bị vi đạn tungsten hay vàng cho 120 lần bắn (dội bom), sử dụng 500 µg vi đạn cho lần - Cân 30 mg vi đạn vào tube 1,5 mL - Thêm vào mL ethanol 70% - Vortex mạnh 3-5 phút - Ngâm vi đạn 15 phút ethanol 70% - Vê tròn vi đạn cách ly tâm nhanh giây - Loại bỏ phần mặt - Lặp lại lần bước rửa sau: + Thêm mL nước vô trùng + Vortex mạnh phút + Để vi đạn lắng xuống phút + Vê tròn hạt cách ly tâm nhanh giây + Loại bỏ phần mặt - Sau rửa lần, thêm vào 500 µL glycerol 50% vơ trùng để làm cho nồng độ vi đạn đạt 60 mg/mL Các vi đạn bảo quản nhiệt độ phòng vòng tuần Các hạt tungsten cần bảo quản -20oC để ngăn cản oxy hóa Các hạt vàng bảo quản 4oC nhiệt độ phòng Bảo quản vi đạn tungsten hay vàng mơi trường khơ, khơng oxy hóa để giảm thiểu kết tụ - Bọc vi đạn rửa với DNA: Các bước chuẩn bị sau đủ cho lần thực dội bom, thực điều chỉnh số lượng cho thích hợp Vortex vi đạn chuẩn bị glycerol 50% (30 mg/mL) phút để phá vỡ vi đạn bị kết tụ Khi lấy lượng tối thiểu vi đạn, cần vortex tube chứa vi đạn liên tục để tạo mẫu đồng tối đa Khi hút lượng tối thiểu, giữ phần tube liên tục vortex phần phía Lấy 50 µL (3 mg) vi đạn cho vào tube 1,5 mL Liên tục vortex vi đạn cần thiết để lượng đồng DNA kết tủa lên vi đạn Trong vortex, thêm vào theo thứ tự: - µL DNA - 50 µL 2,5M CaCl2 - 20 µL 0,1 M spermidine - Tiếp tục vortex 2-3 phút - Để cho vi đạn lắng xuống phút - Vê tròn vi đạn cách ly tâm nhanh giây - Loại bỏ phần mặt - Thêm vào 140 µL ethanol 70% - Loại bỏ phần mặt - Thêm vào 140 µL ethanol 100% - Loại bỏ phần mặt - Thêm vào 48 µL ethanol 100% - Dùng tay búng vào bề mặt tube vài lần, sau vortex vận tốc thấp 2-3 giây Câu 3.6: Nguyên lý hoạt động hệ lên men, vẽ sơ đồ cấu tạo tổng quát hệ lên men BioFlo 110 (New Brunswick Scientific) a) Nguyên lý chung - Hệ lên men xây dựng dựa vào sinh trưởng tự nhiên tế bào yếu tố cần thiết cho sinh trưởng chúng Từ đó, thiết kế hệ thống cung cấp yếu tố q trình ni cấy - Hoạt động tồn hệ lên men điều chỉnh kiểm soát điều khiển trung tâm (PCU) PCU kết nối với máy tính khơng PCU kiểm sốt trực tiếp thông số nhiệt độ, tốc độ khuấy trộn, pH, lượng oxy hịa tan, chất phá bọt thơng qua đầu dò khác Acid, base, chất dinh dưỡng, chất phá bọt bổ sung vào bình lên men - Hệ thống kiểm sốt nhiệt độ hoạt động thơng qua lớp áo nước quanh phận cần làm nguội làm nóng bình b) Sơ đồ cấu tạo tổng quát hệ lên men Câu 3.7: Cấu tạo hệ lên men BioFlo 110 (New Brunswick Scientific), vẽ sơ đồ bình lên men a) Bộ điều khiển chính: Trung tâm điều khiển PCU PCU kiểm sốt từ 1-4 bình lên men Màn hình hiển thị đồ họa rõ nét bàn phím đánh dấu rõ ràng, trung tâm điều khiển cho tất bình lên men kết nối Đầu bốn kênh để ghi dải biểu đồ có sẵn từ PCU b) Bình lên men: Có thể tích tổng số 7,5 L 14 L thể tích làm việc L 10 L, làm thủy tinh lớp hai lớp vỏ, phía có vách ngăn nối với phần nắp phía Bình lên men có phận: - Hệ thống khuấy trộn: motor, trục khuấy cánh khuấy - Ống xoắn làm mát (loại 7,5 L) - Đầu dò phá bọt - đầu dò (điện cực): pH oxy hòa tan - Sensor nhiệt - Bộ phận cung cấp chất dinh dưỡng - Bộ phận thu mẫu - Bộ ngưng-xả c) Phần nắp: Được làm thép khơng gỉ có vịng kẹp để gắn với bình lên men tháo lắp dễ dàng Câu 3.8: Lắp đặt bình lên men, vẽ sơ đồ cấu tạo hệ thống tiếp mẫu BioFlo 110 (New Brunswick Scientific) a) Lắp đặt bình lên men - Đặt bình lên men mặt bàn - Nếu bình lên men có lớp áo nước đặt bình lên đế gia nhiệt: gắn cẩn thận đường nước vào phía sau đế gia nhiệt đặt bình lên, đế cao su bình phải lắp vào lỗ - Nối đế gia nhiệt tới ổ cắm phía trước nguồn - Nối đường nước tới ống xoắn làm mát bình lên men khơng có lớp áo nước, đường vào lớp áo nước với ngưng-xả - Mở nắp đầu dị pH (nếu có) nối lại cáp pH với đầu dị module kiểm sốt dO2/pH - Mở nắp đầu dị dO2 (nếu có) nối lại cáp dO2 với đầu dò module kiểm soát dO2/pH - Mở nắp của vỏ trụ đỡ motor gắn lại motor - Nối lại cáp sensor nhiệt (bổ sung 1-2 mL glycerol vào giếng nhiệt) với sensor - Tháo phá bọt và/hoặc giá đỡ chai thu tế bào khỏi nắp kim loại Lắp lại chúng đế Vặn chặt tất chốt - Gắn lại phá bọt và/hoặc ống thu tế bào vào bơm thích hợp mở khố (kẹp) - Nối lại dịng khơng khí và/hoặc khí b) Sơ đồ cấu tạo hệ thống tiếp mẫu Câu 3.9: Các bước chuẩn bị khử trùng bình lên men BioFlo 110 (New Brunswick Scientific) a) Chuẩn bị khử trùng - Mục đích chuẩn bị + Hạn chế thấp chênh lệch áp suất trình khử trùng, cách cho khơng khí lưu thơng tự bên bên ngồi bình + Bảo vệ lọc khơng bị dính nước + Bảo vệ phần dễ bị hư hỏng nước - Các bước chuẩn bị - Tháo motor - Bôi trơn nắp vỏ trụ đỡ motor mỡ silicone để dễ gắn vào vỏ - Ngắt đường dẫn khí màng lọc nằm vịi phun khí - Ngắt dịng nước Tháo tất ống PVC - Kẹp ống thu tế bào, ống nạp mẫu ống khác có tiếp xúc với môi trường - Tháo RTD (cảm biến nhiệt điện trở) khỏi giếng nhiệt - Ngắt kết nối tất đầu dò sensor, tháo dây cáp chúng - Nếu có dùng đầu dị pH dO2 gắn nắp lên đầu dị - Trước đặt bình lên men vào bên nồi hấp, nới lỏng chai đựng mẫu thủy tinh 1/2 - Bọc tất lọc giấy nhôm để bảo vệ chúng khỏi bị nước làm hỏng - Tháo giá đỡ chai gắn lại nắp bình lên men ốc vít - Gắn chai vào lại xoay giá đỡ chai giá đỡ nằm nắp bình, tránh để chúng nằm ngồi mép bình - Vặn chặt đinh ốc - Kẹp đường ống nơi thích hợp tháo ống khỏi bơm b) Khử trùng - Nếu bình cao so với nồi hấp đặt bình cẩn thận lên giá (nếu có), nằm nghiêng tùy ý - Đặt tồn bình lên men nồi hấp tiến hành khử trùng - Khi lấy bình khỏi nồi hấp, gập ống silicone bịt kín giấy nhơm cổng bổ sung (acid, base chất dinh dưỡng) đóng kín ống thơng để trì tiệt trùng Chú ý: Thời gian khử trùng thay đổi tùy thuộc vào đặc tính nồi hấp, nhiệt độ cài đặt, kích cỡ bình lên men yếu tố khác Câu 3.10: Cài đặt khung dO2 khung nhiệt độ hệ lên men BioFlo 110 (New Brunswick Scientific) Vẽ sơ đồ cấu tạo van solenoid a) Cài đặt khung dO2 - Hệ thống có điều khiển dO2/pH - PCU giám sát dO2 hịa tan mơi trường Nếu sử dụng điện cực dO2 cần cài đặt khung dO2 Phải kiểm tra điện cực sau hấp khử trùng - Cách thực hiện: + Khi giá trị dO2 thực tế cao giá trị cài đặt, tốc độ khuấy tự động gia tăng đạt giá trị dO2 cài đặt + Ngược lại, giá trị dO2 thực tế thấp giá trị cài đặt hệ thống hoạt động để tăng giá trị dO2 Nghĩa dO2 điều khiển việc bổ sung oxy dO2 thực tế < dO2 cài đặt - Cho oxy hòa tan theo đợt để khuấy trộn - Sự khuấy trộn oxy/điều khiển oxy hòa tan thực khuấy trộn tự động - Nếu oxy hịa tan khơng đạt giá trị cài đặt, tăng dịng oxy thơng qua sục khí Phương thức sử dụng thường xuyên trình lên men b) Cài đặt khung nhiệt độ - Nhấn phím lựa chọn Temp hàng lựa chọn cài đặt Màn hình chi tiết khung nhiệt độ xuất - Nếu chế độ điều khiển Off, PCU không điều khiển nhiệt độ Để bật chế độ điều khiển lên, nhấn phím lựa chọn Control - Màn hình chế độ điều khiển khung nhiệt độ mở ra, nhấn phím lựa chọn Auto - Chế độ điều khiển tự động cập nhật (update) hình chi tiết khung nhiệt độ hiển thị trở lại - Setpoint (cài đặt giá trị): Nhấn phím lựa chọn setpoint, hộp thay đổi xuất hiện, nhập setpoint Nhấn phím Enter để lưu setpoint Màn hình chi tiết quay lại, thể setpoint biểu đồ c) Sơ đồ cấu tạo van solenoid ... qua thiết bị thay đổi từ chiều sang chiều ngược lại - Chính đổi chiều dịng điện làm cho mảnh kim loại thiết bị Peltier nóng lên mặt lạnh mặt khác bị đảo ngược lại nhiệt độ, nghĩa mặt nóng bị lạnh... gradient cho phép tối ưu q trình thí nghiệm thời gian ngắn - Thiết bị gọn, nhẹ, tiết kiệm diện tích, thuận tiện cho người sử dụng với việc dễ dàng thiết lập gọi chương trình làm việc, chế độ tự... Nhập vào trình tự tham khảo Genbank (NCBI) - So sánh liệu trình tự phân tích với trình tự tham khảo để xác định biến thể biết đến thư viện trình tự liên quan - Hiển thị biến thể amino acid trình