Báo cáo thiết bị công nghệ và kỹ thuật công nghệ sinh học 2.1

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCPHÁT HIỆN NHANH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA HIỆN DIỆN TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI Môn: Thiết bị và kỹ th

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHÁT HIỆN NHANH SALMONELLA SPP.,

SALMONELLA ENTERICA HIỆN DIỆN TRONG

THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

Môn: Thiết bị và kỹ thuật CNSH

Thủ Đức, ngày 24 tháng 10, 2023 GVHD: TS HUỲNH VĂN BIẾT

THÀNH VIÊN NHÓM

NGUYỄN NGỌC HIẾU

21126060

LÊ HOÀNG PHÚC

21126467

ĐỖ TẤN THÀNH

21126190

2

NỘI DUNG

GIỚI THIỆU

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ DỰ KIẾN

3

I GIỚI THIỆU SALMONELLA

Salmonella enterica thuộc họ Enterobacteriaceae

(vi khuẩn đường ruột) là thực khuẩn Gram âm,

hình que, kích thước trung bình 3,0 x 0,5 um, có

nhiều lông xung quanh thân

• Giới : Bacteria

• Ngành : Proteobacteria

• Lớp : Gramma Proteobacteria

• Bộ : Enterobacteriales

• Họ : Enterobacteriaceae

• Giống: Salmonella lignieres 1900

• Loài : S enterica và S bongori

4

II VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG

PHÁP

5

VẬT LIỆU Gồm 260 mẫu: thịt heo, thịt gà, lòng trắng, đỏ trứng gà, vỏ trứng gà,

nem chua, chả lụa, ba khía, da heo, sò huyết

PHƯƠNG PHÁP

Đồng nhất và tăng sinh trong môi trường BPW, ủ

37oC 24 giờ

trưng cho Salmonella

cấy sang BHI và TSA ủ

qua đêm

Cấy 0,1ml dịch tăng sinh vào môi trường chọn lọc

RV, ủ ở 42oC 24 giờ

Thử nghiệm sinh hóa : KIA/TSI , Urea, Indol, VP

Phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 môi trường XLD

và HE

• Chuẩn bị mẫu và tăng sinh

6

Thiết kế các đoạn mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella

7

LY TRÍCH DNA

ly tâm 13000vòng/p loại bỏ dich nổi

thêm 1ml TE 10p

ly tâm 13000 rpm

5p

bỏ phần dịch nổi hòa tan 350ul TE với 30ml lysozyme

40ul proteinase K

ủ 30oC trong 3h

2ml dịch khuẩn

ủ thêm 800ul phenol

ly tâm 13000 rpm

10p

8

Ly tâm 13000 rpm,

15 phút

LY TRÍCH DNA

Hút phần dịch

phía trên

150 ul TE

700ul

Phenol-Chloroform-isoamyl Alcoho

trắng đục

ly tâm 13000 rpm

10p

chuyển phần trong phía trên

75 ul Natri axetat

1 ml ethanol 96%, đặt trong nước

đá 10 phút giữ lại phần tủa

ethanol 70 %,

13000 rpm, 5 phút

hòa tan DNA với 30 ul nước cất vô trùng, lưu trữ ở -20 °C.

làm khô phần tủa

9

PHƯƠNG PHÁP PCR

PHƯƠNG PHÁP PCR VỚI MỘT CẶP MÔI

• DNA,

• Buffer 10X

• MgCl2 25mM

• dNTP

• Primer F, primer S

• enzyme Taq polymerase

• BSA(0.1%)

• H2O nuclease - free water

30s

30s

60S

10

PHƯƠNG PHÁP PCR

❖ PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MÔI

45s

60s

90s

• DNA,

• buffer 10X

• MgCl2 25mM

• dNTP

• Primer F, Primer S

• enzyme Taq polymerase

• BSA(0.1%)

• H2O nuclease - free water

Cặp mồi invA và cặp mồi spvC

11

ĐIỆN DI 2di trên gel agarose và được chụp lại bằng Biorad UV35 lượng bản sao DNA được khuếch đại bằng PCR được đem đi điện

12

III KẾT QUẢ DỰ

KIẾN

13

❖ Kết quả PCR được tiến hành thử trên web Primer- BLAST

Kết quả PCR gen spvC được tiến hành trên Primer-BLAST

III KẾT QUẢ DỰ

KIẾN❖ Kết quả PCR được tiến hành thử trên web Primer- BLAST

Kết quả PCR gen invA được tiến hành trên Primer-BLAST

14

❖ Kết quả khuếch đại gen mục tiêu bằng phản ứng PCR dự kiến

600bp

Kết quả PCR dự kiên với cặp mồi invA

Mồi invA có tính chuyên biệt cao đối với dòng vi

khuẩn Salmonella spp.

III KẾT QUẢ DỰ

KIẾN

15

III KẾT QUẢ DỰ

KIẾN

Kết quả PCR dự kiên với cặp mồi spvC

Cặp mồi spvC có tính chuyên biệt đối với 2

dòng vi khuẩn

S.enteritidis, S.typhimurium

400bp

16

III KẾT QUẢ DỰ

KIẾN

Cặp mồi invA chỉ đánh giá sơ

bộ có kết quả dương tính với

Salmonella chứ không cho biết

sự hiện diện của các dòng vi

khuẩn khác như S enteritica.

Mồi spvC thì kết quả lại âm

tính với Salmonella.

400bp 600bp

Kết quả PCR dự kiến với 2 cặp mồi invA và spvC

17

Tài liệu tham khảo

Mai, T T X., Yến, T T H., Bé, N V., & Phương, V T T 2011 Phát hiện nhanh SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA hiện

diện trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR đa mồi (MULTIPLEX PCR) Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ.

Shoba CS, Banhart HM, Lee MD and Dreesen DW 1996 Virulence determinants inVA and spvC in Salmonella isolated from poultry

products wastewater and Human sources.

Swamy, S C., Barnhart, H M., Lee, M D., & Dreesen, D W 1996 Virulence determinants invA and spvC in salmonellae isolated from

poultry products, wastewater, and human sources. Applied and environmental microbiology, 62(10), 3768–3771

Sahu, B., Singh, S D., Behera, B K., Panda, S K., Das, A., & Parida, P K 2019 Rapid detection of Salmonella contamination in seafoods

using multiplex PCR. Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 50(3), 807–816.

Wang, M., Zhang, Y., Tian, F., Liu, X., Du, S., & Ren, G 2021 Overview of Rapid Detection Methods for Salmonella in Foods: Progress

and Challenges. Foods (Basel, Switzerland), 10(10), 2402.

Kurtz, J R., Goggins, J A., & McLachlan, J B 2017 Salmonella infection: Interplay between the bacteria and host immune

system. Immunology letters, 190, 42–50.

14

THANK YOU