Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC SỬ DỤNG KĨ THUẬT LAMP PHÁT HIỆN Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG L
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC SỬ DỤNG KĨ THUẬT LAMP PHÁT HIỆN Toxoplasma Gondii KÍ SINH TRONG RUỘT MÈO Ngành học : Công nghệ sinh học Nhóm thực hiện : 10 Mã môn học : 211402 Niên khóa : 2021-2025 TP HCM, tháng 10 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC SỬ DỤNG KĨ THUẬT LAMP PHÁT HIỆN Toxoplasma Gondii KÍ SINH TRONG RUỘT MÈO Giảng viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết Ths Trương Quang Toản Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kiều Vân 21126575 DH21SHA 21126576 DH21SHA Nguyễn Thúy Vân 21126589 DH21SHA Võ Thị Tường Vy TP HCM, tháng 10 năm 2023 MỤC LỤC 1.Đặt vấn đề 1 2 Nguyên lí của kĩ thuật LAMP .2 2.1 Mục đích, của kĩ thuật LAMP 2 2.2 Thành phần của phản ứng LAMP .2 2.3 Nguyên lí của phản ứng LAMP .2 3 Kết quả .4 3.1 Đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng 4 3.2 Sử dụng thuốc nhuộm .4 4 Ưu điểm và nhược điểm 5 5.Tài liệu tham khảo 6 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1 Quá trình hình thành cấu trúc vòng ở hai đầu của 2 cặp trình tự với nhau 3 Hình 2 Quá trình tổng hợp nhiều đoạn DNA 3 Hình 3 Biểu đồ thể hiện độ đục của sản phẩm LAMP 4 Hình 4 Sử dụng thuốc nhuộm Calcein để quan sát kết quả của phản ứng LAMP… 5 1.Đặt vấn đề: Toxoplasma gondii, là loại ký sinh trùng trong cơ thể sinh vật sống, gây ra bệnh toxoplasmosis lây truyền qua thực phẩm ở người và động vật.Thường gặp ở những người có hệ miễn dịch kém gây ra những vấn đề nghiêm trọng như viêm não, nhiễm trùng mắt hoặc có thể sinh non, sảy thai, gặp cái bệnh về mắt, não bộ đối với người mang thai nhiễm loại ký sinh trùng này Mèo, là vật chủ của T gondii ,sinh sản hữu tính trong đường ruột mèo, sau đó qua quá trình bài tiết của mèo hàng triệu nang trứng đi ra môi trường Con người, động vật nhiễm bệnh thông qua đất, nước, thực vật, thực phẩm có chứa nang trứng do mèo thải ra Vì vậy, việc phát hiện nhanh những con mèo bị nhiễm bệnh là rất quan trọng để tránh lây truyền bệnh toxoplasmosis Người ta sử dụng PCR, Real-time PCR để chẩn đoán T gondii tuy nhiên có những hạn chế, bao gồm giá thành cao, thiết bị đắt tiền, không thể sử dụng trong điều kiện thường Thay vào đó, kĩ thuật LAMP dùng để khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt được ứng dụng trong phát hiện T gondii,có ưu điểm nhanh, đặc hiệu và nhạy, chỉ cần môi trường ổn nhiệt để thực hiện khuếch đại trong 1 giờ rồi phát hiện gen mục tiêu 1 2 Nguyên lí của kĩ thuật LAMP 2.1 Mục đích, của kĩ thuật LAMP Mục đích: khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc móc hay kẹp tóc 2.2 Thành phần của phản ứng LAMP Thành phần bao gồm: DNA khuôn mẫu, DNA polymerase, Primer, dNTPs, dung dịch đệm, MgCl2, H2O (free nuclease) * Điểm khác biệt so với phản ứng PCR: Bảng 1.Đặc điểm khác biệt của phản ứng PCR và phản ứng LAMP Phản ứng PCR Phản ứng LAMP + Primer: 1 cặp (1F+1R) nhận biết 2 vị trí + Primer: 2 cặp (2F+2R) nhận biết 6 vị trí + DNA polymerase: Nhiều loại + DNA polymerase: Chỉ dùng Bst (Bacillus stearothermophilus) + Chu trình nhiệt: Biến tính, bắt cặp, kéo + Chu trình nhiệt: ~ 65oC dài 2.3 Nguyên lí của phản ứng LAMP Các bước phản ứng diễn ra như sau: Bước 1: Mồi xuôi FIP chứa trình tự F2 sẽ bổ sung vào mạch DNA ở vị trí F2c Bước 2: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi DNA mới từ mồi FIP Bước 3: Mồi ngoài F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài Sự tổng hợp sợi DNA mới bởi mồi này và DNA polymerase dẫn đến giải phóng sợi DNA tổng hợp từ mồi FIP Bước 4: Sợi đôi DNA được hình thành từ sợi khuôn và mồi F3 Bước 5: Sợi đơn DNA được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng Vì đầu 5’ của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành cấu trúc vòng Bước 6: Sợi DNA được tạo ra từ bước 5 sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp sợi mới và mồi B3 sẽ có chức năng như F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng sợi DNA mồi BIP Bước 7: Sợi đôi DNA được hình thành từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ bước 5 Bước 8: Sợi DNA được tổng hợp từ mồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình thành cấu trúc vòng ở 2 đầu do sự bổ sung của 2 cặp trình tự với nhau 2 Hình 1.Quá trình hình thành cấu trúc vòng do sự bổ sung ở hai đầu của 2 cặp trình tự với nhau Bước 9: F2 của FIP bám vào F2c của mạch đơn trong đoạn DNA vòng và tổng hợp kéo dài Bước 10-11: Còn đoạn mạch đơn còn lại từ trình tự 3’ của đầu B1 cũng tổng hợp kéo dài và giải phóng cấu trúc quả tạ (cấu trúc này ngược với cấu trúc tạo ở bước 8) Tiếp tục giống như từ bước 8 đến bước 11, cấu trúc ở bước 11 dẫn đến quá trình tổng hợp DNA tự mồi bắt đầu từ đầu 3’ trong đoạn B1 Kết quả của quá trình này là nhiều cấu trúc DNA kép bao gồm các trình tự lặp đi lặp lại luân phiên đảo ngược trình tự đích được ngăn cách với nhau bởi các loop trong cùng một sợi trên 1 phân tử DNA kép Hình 2.Quá trình tổng hợp nhiều đoạn DNA 3 3 Kết quả 3.1 Đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng Khi DNA đích được khuếch đại bởi LAMP, một chất kết tủa trắng bắt nguồn từ magnesiun pyrophosphate - một sản phẩm phụ của phản ứng LAMP - sẽ xuất hiện Có thể quan sát và so sánh độ đục với mẫu âm tính, nếu đục hơn là dương tính; hoặc tiến hành đo độ hấp thụ ở 650 nm, nếu đạt đến 0,1 là dương tính Hình 3 Biểu đồ thể hiện độ đục của sản phẩm LAMP PP là đối chứng dương được lấy từ plasmid chứa gen B1, NC là đối chứng âm chứa H2O Trục tung là độ đục của sản phẩm LAMP, trục hoành là thời gian phản ứng tính bằng phút 3.2 Sử dụng thuốc nhuộm Trong bài viết này, người ta sử dụng thuốc nhuộm Calcein - một chất fluorophore liên kết ion kim loại, được thêm vào trước khi ủ đẳng nhiệt Calcein trong hỗn hợp phản ứng ban đầu kết hợp với ion Mn2+ và không phát tín hiệu Khi phản ứng khuếch đại diễn ra, ion Mn2+ tách khỏi Calcein và kết hợp với pyrophosphate (sản phẩm phụ của phản ứng LAMP) tạo ra phức hợp muối không hòa tan là mangan – pyrophosphate Lúc này có sự phát huỳnh quang Calcein tự do có khả năng kết hợp với ion Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng và tăng cường phát huỳnh quang Có thể dễ dàng quan sát được dưới ánh sáng tia cực tím ở 4 bước sóng 365 nm Phản ứng giữa Mg2+ và Calcein còn làm biến đổi màu từ cam sang xanh, có thể quan sát được bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên Phản ứng LAMP dương tính được biểu thị bằng màu xanh lá cây, trong khi phản ứng LAMP âm tính được biểu thị bằng màu cam Chỉ cần một giờ hoạt động trong môi trường đẳng nhiệt và hiệu ứng khuếch đại có thể nhìn thấy bằng mắt thường Điều quan trọng là không cần phải tháo nắp ống phản ứng để quan sát kết quả và điều này ở một mức độ nhất định có thể tránh được tình trạng ô nhiễm khí dung của mẫu trong quá trình khuếch đại LAMP Hình 4 Sử dụng thuốc nhuộm Calcein để quan sát kết quả của phản ứng LAMP PP là đối chứng dương được lấy từ plasmid chứa gen B1, NC là đối chứng âm chứa H2O 4 Ưu điểm và nhược điểm - Ưu điểm: + Nhanh, đặc hiệu và nhạy +Chỉ cần môi trường ổn nhiệt để thực hiện khuếch đại trong 1 giờ để phát hiện gen mục tiêu + Kết quả có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV + Không yêu cầu thiết bị như máy luân nhiệt, có thể không cần đến năng lượng điện do có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt Phát hiện nhanh, có tính di động cao, hiệu quả kinh tế cao và giảm thời gian vận chuyển - Nhược điểm: dễ bị ô nhiễm khí dung và có khả năng dẫn đến kết quả dương tính giả 5 5 Tài liệu tham khảo 1 Sheng, L., et al (2023) "Rapid and visual detection of Toxoplasma gondii oocyst in cat feces using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay." Scientific Reports 13(1): 17269 2 Wong, Y P., Othman, S., Lau, Y L., Radu, S., & Chee, H Y (2018) Loop- mediated isothermal amplification (LAMP): a versatile technique for detection of micro-organisms Journal of applied microbiology, 124(3), 626–643 https://doi.org/10.1111/jam.13647 6