Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Trang 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCMKHOA KHOA HỌC SINH HỌCNHÓM 10XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG BEN Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR SEQUENCINGMÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ S

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NHÓM 10

XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG

BEN Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR

SEQUENCING

MÔN HỌC: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS HUỲNH VĂN BIẾT

2

NỘI DUNG BÁO

CÁO

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM MALASSEZIA

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG BEN

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM

MALASSEZIA

4

1.1 Vài nét lịch sử

1.3 Tác động đến bệnh

da

1.2 Đặc điểm 1.4 Một số bệnh lý

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM

MALASSEZIA

5

tế bào hình tròn hoặc bầu dục, vỏ dày, xung quanh

có viền kép, tập trung thành đám ,đặt tên là Malassezia furfur

2004

Các nhà khoa học Nhật Bản công bố một số loài mới: M

Đặc điểm Nội dung

Phân loại khoa

khọc

Thuộc ngành Basidomycota, phân ngành Ustilaginomycotina, lớp Exobasidomycetes, bộ Malasseziales, họ Malasseziacae.

Cấu trúc Đơn bào, có nhân chuẩn.

Hình dạng Hình tròn hoặc hình bầu dục, vách ngăn rộng, không màu, đôi khi gặp dạng sợi hoặc vô định hình.

Kích thước Dao động từ 3-10 mm, thông thường lớn hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn.

Khả năng thích

nghi

+ Thích nghi môi trường đường cao + Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa quả, rau dưa, mật mía.

Sinh sản Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chòi Khi bào tử chòi được sinh ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc goi là giả sợi nấm.

Các loài Có 14 loài Malassezia trên da người và động vật, trong đó 3 loài gặp nhiều nhất là M globosa, M sympodialis, M Furfur.

1.2 Đặc điểm của nấm

Malassezia

7

• Kích thích tế bào viêm và phá hủy nang lông.

1.3 Tác động của Malassezia trong

bệnh da

8

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH

LANG BEN

10

2.1 Khái niệm bệnh lang ben 2.2 Chẩn đoán bệnh lang ben

2.3 Xác định Malassezia trong bệnh lang ben

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG

BEN

11

2.1 Khái niệm bệnh lang

ben

Lang ben (Pityriasis versicolor) là bệnh

nấm nông ở da, căn nguyên do

Malassezia spp

Đặc trưng bởi dát hình tròn hoặc bầu

dục, thay đổi màu sắc da trên có vảy da

ẩm mỏng, các tổn thương có thể đứng

rải rác hoặc liên kết với nhau thành đám,

tập trung chủ yếu ở vùng da giàu bã

nhờn ở phần trên cơ thể kèm theo ngứa.

Hình 2.1 Bệnh lang ben

12

Chẩn đoán lâm sàng

Cận lâm sàng

2.2.Chẩn đoán bệnh lang ben

13

Thương tổn cơ bản: các dát, mảng hình tròn hoặc bầu dục, bắt đầu bằng những chấm màu hồng, nâu hoặc trắng trên da Các chấm lớn dần, lan rộng và liên kết với nhau thành mảng ranh giới rõ rệt với da lành

Thương tổn đặc trưng bởi sự thay đổi màu sắc da, có thể tăng hoặc giảm sắc tố, đôi khi dát hỗn hợp tăng và giảm sắc tố Màu sắc tổn thương hay gặp nhất là màu nâu (tăng sắc tố) và trắng (giảm sắc tố)

Triệu chứng: ngứa, ngứa tăng lên khi ra mồ hôi đôi khi cảm giác ngứa râm ran Có thể không ngứa hoặc cảm giác ngứa thoáng qua.

NUÔI CẤY, ĐỊNH DANH

Dựa trên đoạn DNA đặc trưng nhằm xác định loài nấm

PCR SEQUENCING

2.2.2 Cận lâm sàn

15

2.3.1 Soi trực tiếp tìm nấm 2.3.2 Nuôi cây, định danh 2.3.3 Phân tích phân tử và PCR

2.3 Xác định Malassezia trong bệnh lang

ben

16

2.3.1 Soi trực tiếp tìm

nấm

• Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, kết quả

nhanh và giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đoán sơ

bộ vi nấm gây bệnh

• Nhược điểm: kết quả còn phụ thuộc vào kinh

nghiệm và kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm

• 2 bước quan trọng nhất: bộc lộ lớp vỏ dày

bao quanh tế bào nấm và nhận định hình

thái vi nấm dưới kính hiển vi

• Dung dịch kiềm: KOH 10%, KOH 20%, NaOH

10%

• Thuốc nhuộm: ParkerTM blue black ink,

ParkerTM black ink, Chicago sky blue 6B,

Calcofluor white

Hình 2.3 ”Spaghettie and meatball” soi trực tiếp bằng KOH + ParkerTM Ink 17

THẠCH SABOURAUD THẠCH M-DIXON THẠCH LEEMING - NOTMAN

2.3.2 Nuôi cấy, định danh

Là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định căn nguyên vi sinh vật, trong đó đặc biệt

xác định chính xác loài Malassezia gây bệnh

Bệnh phẩm: vảy da của bệnh nhân lang ben

Môi trường nuôi cấy: thạch Sabouraud, thạch m-Dixon, thạch Leeming-

Notman

18

Phương pháp: “dấu vân

tay” DNA; RAPD; AFLP;

DGGE; PFGE; kỹ thuật

Ưu điểm: đơn giản hơn, bệnh phẩm đươc lấy vào dung dịch đặc biệt, sau đó

sử dụng các kỹ thuật PCR khác nhau để xác định loài

Nhược điểm: độ nhạy không cao, phụ thuộc vào môi trường bảo quản bệnh phẩm.

Ưu điểm: xác định chính xác loài Malassezia với

độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Nhược điểm: cần nhiều thời gian, tính thực tiễn không cao, có thể áp dụng trong các cơ sở có tính nghiên cứu.

Các phương pháp So sánh PCR từ vảy da PCR từ khuẩn lạc

19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

20

có mặt của nấm Malassezia trong mẫu bệnh phẩm.

THIẾT KẾ MỒI

Đưa mẫu bệnh phẩm vảy da được tiến hành PCR, lấy sản phẩm thu được giải trình tự gen.

PCR

Dựa trên bộ gen của loài Malassezia trên ngân hàng gen quốc tế, so sánh trình tự nucleotid thu thập được để xác định các loài Malassezia.

GIẢI TRÌNH TỰ GEN, SO SÁNH

TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN

3.1 Xác định Malassezia bằng PCR

Sequencing

21

Vật liệu

Dụng

cụ

Các bước tiến

hành

3.1 Xác định Malassezia bằng PCR

Sequencing

22

3.1.1.1 Vật liệu cho PCR

3.1.1.2 Vật liệu đo nồng độ ADN của sản

phẩm PCR

3.1.1.3 Vật liệu giải trình tự gen

3.1.1 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu

23

• Máy luân nhiệt tự động

• Máy điều nhiệt tự động

3.1.1.2 Vật liệu đo nồng độ DNA của sản phẩm PCR• Sử dụng máy Bio photometer (Đức)

• Tube chứng: 50 ml dung dịch PBS hoặc nước cất

Đầu tiên nhiệt độ

sẽ được đưa lên

để các đoạn mồi tìm đến ghép cặp

bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.

GHÉP CẶP

Nhiệt độ được đưa lên 72 o C , enzym Taq polymeras kéo các đầu dNTP lại đầu 3’ cua đoạn mồi đang ghép cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp trên mạch bổ sung.

KÉO DÀI

NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG PCR

28

3.1.2.1 KỸ THUẬT ĐIỆN DI SẢN PHẨM

PCR

100mA 30'

29

Đo ở bước sóng 260 nm: 1 đơn vị = 50 mg/ml

Đoc kết quả: Lượng ADN có trong mẫu (mg/ml)

x10x103/103(ml) = nanogam (ng)/ ml (x10: Độ pha loãng 10

lần, x103/103: đổi đơn vị từ mg/ml sang ng/ml).

3.1.2.2 KỸ THUẬT ĐO NỒNG ĐỘ ADN

CỦA SẢN PHẨM PCR

Xác định vi nấm Malassezia Các trình tự nucleotide của gen 5.8S, 26S và 18S được xử lý bằng phan mềm ATGC 7.2

3.1.2.3 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

So sánh trình tự tương đồng trên ngân hàng dữ liệu gen

quốc tế NCBI (GenBank), các trình tự Malassezia tương đồng

có giá trị cao nhất sẽ được lựa chọn.

3.1.2.4 NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

30

CẢM ƠN THẦY

VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG

NGHE !

31