Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Đánh giá này sẽ thảo luận về kiến thức hiện tại về di truyền của các hóasinh đó các hợp chất được coi là yếu tố quyết định chất lượng, được sử dụng làm Trang 6 nền tảng cho nâng cao chấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

Phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta

Ngành học : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Sinh viên thực hiện : Nhóm 1 – DH21SHC

TP Thủ Đức, 10/2023

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

Phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region)

giống cà phê Robusta

LÊ THỊ KIỀU GIANG PHAN TẤN PHÁT CAO NGUYỄN BẢO ÂN

TP Thủ Đức, 10/2023

MỤC LỤC

Trang CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 5

1.1 Đặt vấn đề 5

1.1 Mục tiêu báo cáo 6

1.2 Nội dung thực hiện 6

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

2.1 Tổng quan về cà phê Robusta 8

2.1.1 Khái quát chung 8

2.2.1 Vị trí phân loại 8

2.1.3 Đặc điểm hình thái của cà phê Robusta 8

2.1.4 Thành phần cơ bản trong cà phê Robusta 9

2.2 Giới thiệu về một số hợp chất quan trọng trong cà phê Robusta 9

2.2.1 Các Axit hữu cơ 9

2.2.2 Lipid – dầu trong cà phê 9

2.2.3 Các Alcaloit (Caffein và Trigonelline) 10

2.2.4 Chất khoáng 10

2.2.5 Protein trong cà phê 10

2.2.6 Chất thơm trong cà phê 11

2.3 Phân bố và đặc điểm thực vật học của cà phê Robusta 11

2.3.1 Phân bố 11

2.3.2 Đặc điểm thực vật học 11

2.2.1 Sự đa dạng sinh học 12

2.2.2 Đa dạng di truyền 12

2.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 12

2.3.1 Phương pháp sử dụng dấu hiệu hình thái 12

2.3.2 Phương pháp sử dụng chất đánh dấu isozyme 12

2.3.3 Phương pháp sử dụng marker phân tử 13

2.4 Tổng quan về điểm đánh dấu SCoT 13

2.4.1 Khái niệm về điểm đánh dấu SCoT 13

2.4.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCoT 13

2.5 Kỹ thuật tách chiết DNA thực vật 14

2.5.1 phương pháp tách chiết DNA 14

2.5.2 Phương pháp DNA định tính và định lượng 14

2.6 Phân tích phát sinh loài 14

3

2.7 Tổng quan về điểm đánh dấu SCAR 15

2.7.1 Khái niệm về điểm đánh dấu SCAR 15

2.7.2 Ứng dụng điểm đánh dấu SCAR 15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17

4.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

4.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nông nghiệp đang trên đà phát triển với nhiều loại hình sản xuất Ngoài cây lúa, cao su, điều… thì Việt Nam còn là nước chú trọng trong việc nuôi trồng và sản xuất cây cà phê Cây cà phê đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta Cà phê là một thức uống phổ biến

và ngày càng phát triển trên thế giới Lượng tiêu thụ gần 9.012.540 tấn trên một năm Việt Nam là nước sản xuất Robusta lớn nhất thế giới Theo các báo cáo trước đây, diện tích trồng cà phê ở Việt Nam là 695.600 ha và sản lượng là 1,76 triệu tấn vào năm 2020, trong đó khu vực Tây Nguyên chiếm khoảng 73% diện tích trồng và sản lượng Vì vậy, vùng này được mệnh danh là thủ đô trồng và sản xuất cà phê của Việt Nam Cây cà phê Robusta chỉ cần từ 3 đến 4 tuổi đã có thể bắt đầu thu hoạch Tuổi thọ của cây kéo dài từ 20 đến 30 năm

Cà phê Robusta, còn được biết đến với tên gọi khác là cà phê Canephora

Ở Việt Nam Robusta còn có tên gọi là cà phê Vối Đây là một trong những loại cà phê được bán phổ biến và được ưa chuộng ở thị trường Việt Nam Cây cà phê Robusta lần đầu tiên được phát hiện ở Congo những năm 1800 Sau đó, giống cây này được tự nhiên hóa tại nhiều quốc gia như Borneo, Polynesia, Costa Rica, Nicaragua, Jamaica,… Cây cà phê Robusta du nhập đến Đông Nam Á vào năm

1900 và được nhân giống, trồng trọt rộng rãi Robusta cũng dần du nhập và được trồng phổ biến tại Việt Nam Các tỉnh trồng cà phê Robusta phổ biến nhất gồm có Đăklăk, Đăk Nông, Lâm đồng, Gia Lai với diện tích lên đến 90% trên tổng diện tích canh tác cà phê Những tỉnh nói trên ở Việt Nam sở hữu diện tích lớn đất đỏ bazan trù phú Loại đất này có độ tơi xốp cao, khả năng giữ nước tốt Điều kiện khí hậu, nhiệt độ, ánh sáng thuận lợi cũng góp phần giúp cây hấp thu dinh dưỡng tốt hơn Hằng năm, người ta lại thu hoạch sản lượng lớn hạt cà phê Robusta từ đây và phân phối đến các tỉnh thành khác tại Việt Nam và trên thế giới Chính vì thế, loại cây này phát triển rất tốt và cho năng suất cao mỗi năm Sản lượng Robusta khoảng 30% sản lượng cafe của thế giới, trải khắp Tây và Trung Phi, Đông Nam

Á, các vùng của Nam Mỹ Nền kinh tế sản xuất cà phê đã thay đổi trong những năm gần đây, với giá trên thị trường quốc tế giảm và chi phí đầu vào tăng Đồng thời, nhu cầu về cà phê đặc sản đang ở mức cao nhất mọi thời đại Để sản xuất cà phê bền vững, cần chú ý cải thiện chất lượng cà phê bằng cách tham gia vào các biện pháp canh tác bền vững, thân thiện với môi trường, cuối cùng có thể thu được lợi nhuận ròng cao hơn

Sản xuất các kiểu gen có thuộc tính chất lượng cà phê được cải thiện là mục tiêu chính của các chương trình cải tiến di truyền cà phê Những tiến bộ trong bộ gen là cung cấp các công cụ mới để phân tích chất lượng cà phê ở cấp độ phân tử

Gần đây báo cáo về trình tự bộ gen của cà phê Robusta, Coffea canephora, là một

nghiên cứu quan trọng phát triển trong nghiên cứu cà phê Với những tiến bộ trong công nghệ gen và giải trình tự, khả thi để hiểu bộ gen cà phê và cơ chế di truyền phân tử cơ bản chất lượng cà phê, từ đó giúp nâng cao hiệu quả của chương trình nhân giống Đánh giá này sẽ thảo luận về kiến thức hiện tại về di truyền của các hóa sinh đó các hợp chất được coi là yếu tố quyết định chất lượng, được sử dụng làm

5

nền tảng cho nâng cao chất lượng cà phê bằng cách nhân giống Nguồn gen sẵn có cho việc nghiên cứu di truyền của các hợp chất sinh hóa có khả năng đóng vai trò trong hương vị cà phê cũng sẽ được thảo luận Ngoài ra, giá trị tiềm năng của việc nghiên cứu di truyền cây cà phê chất lượng bằng cách sử dụng trình tự thế hệ tiếp theo và phân tích di truyền liên kết sẽ được cải thiện được xem xét

Những hạn chế về hóa học và hình thái, phương pháp xác thực bằng kính hiển vi đã tạo ra nhu cầu về các phương pháp mới hơn trong việc kiểm soát chất lượng các công thức và thuốc thảo dược SCAR, một điểm đánh dấu dựa trên PCR, đại diện cho một locus xác định về mặt di truyền được xác định bằng cách khuếch đại DNA

bộ gen với một cặp mồi oligonucleotide cụ thể Các điểm đánh dấu SCAR có thể chứa số lượng bản sao cao và trình tự bộ gen đã cạn kiệt trong vùng được khuếch đại Do đó, chúng có giá trị trong các ứng dụng quy mô lớn và dành riêng cho từng địa phương như sàng lọc được hỗ trợ bằng điểm đánh dấu và nhân bản gen dựa trên bản đồ Điểm đánh dấu SCAR, được tạo từ các vùng đa hình có kích thước khác nhau giữa các loài, cho phép xác thực mẫu dựa trên sự thay đổi kích thước SCAR Các dấu hiệu dựa trên DNA khác nhau viz AFLP, SSR, ISSR và RAPD có thể được sử dụng để tạo ra các điểm đánh dấu này Tuy nhiên, độ tin cậy cao của dấu SCAR có thể dẫn đến sự dịch chuyển của AFLP và các dấu hiệu dựa trên DNA khác, tốn kém, mất thời gian và tẻ nhạt và sử dụng một số vật liệu phóng xạ trong bước phát hiện Ngoài ra, độ nhạy phát hiện cao và khả năng điện di có thể tránh được làm cho nó trở thành một công cụ phân tử kinh tế Như vậy, cho đến nay SCAR marker dường như là công nghệ phù hợp nhất để xác thực dược liệu cổ truyền Đặc tính phân tử bằng các dấu hiệu SCAR cho phép xác định và phân biệt các loại thảo mộc một cách hiệu quả và đáng tin cậy với các loại tạp chất và xác định các loại thực phẩm cao cấp Các loài thực vật có hình thái tương tự nhau có thể được phân biệt bằng cách sử dụng các dấu hiệu phân tử này Khi điểm đánh dấu SCAR được phát triển cho một loài cụ thể, nó có thể được sử dụng để phát hiện các công thức giống nhau và không đồng nhất được sử dụng trong hệ thống thuốc truyền thống để xác thực các loại thuốc thảo dược truyền thống

1.1 Mục tiêu báo cáo

Tìm hiểu về vật liệu và phương pháp phát triển SCAR marker (Sequence Characterized Amplified Region) giống cà phê Robusta

1.2 Nội dung thực hiện

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cà phê Robusta

2.1.1 Khái quát chung

Cà phê Robusta (Coffea canephora) có tiếng là dòng cà phê có hương vị mạnh,

nồng đặc trưng Điều làm cho vị cafe robusta khác biệt chính là hàm lượng caffeine

có trong hạt, hàm lượng này cao chiếm từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc Hạt

cà phê Robusta khi còn nguyên sẽ có mùi giống như hạt đậu phộng tươi, khi rang lên

sẽ thơm nồng và có vị đắng đặc trưng khiến người uống thấy sảng khoái, tinh thần phấn chấn Cà phê Robusta phù hợp để trồng trong điều kiện khí hậu nhiệt đới Cây thường được trồng ở độ cao dưới 1000m so với mực nước biển Nhiệt độ lý tưởng dao động từ 24 đến 29 độ C Cây cà phê Robusta là loại cây ưa nước với yêu cầu lượng mưa hàng năm trung bình trên 1000mm Đặc biệt, so với cà phê thông thường, cây cà phê Robusta phải được trồng trong điều kiện ánh sáng thuận lợi hơn

So với các giống cà phê khác, Robusta có khả năng chống các loại sâu bệnh rất tốt, năng suất cao, dễ chăm sóc Tuy nhiên, Robusta có đặc điểm là chịu hẹn, chịu lạnh kém, sản lượng không ổn định

2.2.1 Vị trí phân loại

Cà phê Robusta là một loài thực vật có hoa trong họ Thiến thảo Loài này dược Pierre ex A.Froehner mô tả khoa học đầu tiên năm 1897

 Giới: Plantae

 Ngành Angeosperma

 Lớp: Asteridae

 Bộ: Gentianales

 Họ: Rubiaceae

 Chi: Coffea

 Loài: C Canephora

2.1.3 Đặc điểm hình thái của cà phê Robusta

Đặc điểm của loại cà phê này chính là có quả hình tròn, hạt cà phê Robusta thường nhỏ hơn loại cà phê khác, có hình bầu dục hoặc tròn với phần rãnh ở giữa thường là đường thẳng, nhân nhỏ hơn cà chè và cà mít Thường có 2 nhân trong mỗi quả Hàm lượng caffein 2-4% nhưng ít thơm, khi uống có vị chát và đắng gắt

Cây Robusta là dạng cây bụi kích thước lớn, phát triển tốt ở độ cao khoảng 0 – 800m so với mặt nước biển Do đó, loại cây này rất phù hợp với điều kiện địa hình

và khí hậu Việt Nam Lá cà phê Robusta thường to, cây phát triển nhanh, tán rộng, Mật độ trồng thưa hơn (2,5 – 3,5m) Cây trưởng thành hoang dã có thể cao

Hình 2.1 Hạt cà phê Robusta

đến 8m, còn trong canh tác thường chỉ để từ 2-2,5m Cây thân gỗ dạng bụi, cành nhánh phát triển mạnh Những cây lâu năm thường có nu, chu vi gốc lên đến 80-100cm Lá hình ô van dài từ 15-22cm, rộng 10-14cm, mép lá thường gợn sóng, phiến lá xanh đậm và bóng

2.1.4 Thành phần cơ bản trong cà phê Robusta

Về mặt hóa học, cà phê rất phức tạp và thành phần chính xác của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, điều kiện rang, xay và ủ Sự biến đổi của cà phê được nhấn mạnh bởi một n ghiên cứu gần đây đã phân tích thành phần hóa học của hạt

cà phê bao gồm:

Hàm lượng lớn nhất là hàm lượng carbohydrate không hòa tan chiếm 34-44%

(trong đó bao gồm Hemicelluloses chiếm 3-4% và Xenluloza, β (1-4) mannan

chiếm 32-40%) Kế tiếp là Lipid với hàm lượng 8-12% (trong đó bao gồm sáp chiếm 0.2 – 0.3% và dầu chiếm 8-11.7%) Hàm lượng Cảbonhydrate hòa tan cũng chiếm tỉ lệ không nhỏ 6-11.5% (hỗn hợp bao gồm Monosaccharid 0.2-0.5%, Oligosaccharides 3-7% và Polysaccharid 3-4%) Bên cạnh đó, cà phê Robusta còn các thành phần Axit và Phenol, hỗn hợp này bao gồm Axit không bay hơi chiếm 1.3-2.2% và Axit Chlorogenic chiếm 7.1-12.1% Cung các hợp chất chưa nitơ bao gồm Axit amin tự do 0.2-0.8%, protein 7.5-9.5%, Caffeine 1.7-4%, Trigonelline 0.3-0.9% và khoáng chất 3.0-5.4%

Cà phê Robusta thường chứa một lượng caffeine cao, hàm lượng này cao chiếm

từ 3% – 4% khiến mùi vị cafe đậm đặc

2.2 Giới thiệu về một số hợp chất quan trọng trong cà phê Robusta

2.2.1 Các Axit hữu cơ

Thành phần axit trong cà phê bao gồm một tập hơp khoảng hơn 30 loại axit hữu khác nhau, với một số loại axit quan trọng như: Axit Acetic, axit Citric, axit Chlorogenic, axit Phosphoric Các axit hữu cơ này góp phần tạo nên đặc tính Acidity (độ chua) của cà phê Thành phần, và hàm lượng axit trong cà phê phụ thuộc vào giống cà phê đồng thời thay đổi liên tục trong quá trình chế biến, mà phần lớn là trong quá trình lên men, và rang cà phê một số loại axit sẽ mất đi đáng

kể, một số loại khác lại được sinh ra

2.2.2 Lipid – dầu trong cà phê

Lipid hay gọi đơn giản chất béo, đóng một vai trò quan trọng trong chất lượng tách

cà phê bạn, chủ yếu bao gồm triacylglycerol, sterol và tocopherols (vitamin E).

Hàm lượng lipid trong cà phê khác nhau tùy thuộc vào giống loài Thông thường Arabica chứa nhiều lipit hơn so với người anh em Robusta, trung bình lần lượt là 15-17% và 10-11,5%

2.2.3 Các Alcaloit (Caffein và Trigonelline)

Hạt cà phê có chứa một số loại alkaloids (một hợp chất hữu cơ có chứa ít nhất một nguyên tử nitơ) bao gồm, Caffeine, Putrescine, Theophylline, Trigonelline Trong

số này, Caffeine có trong cả cà phê và trà, nhưng Trigonelline chỉ có trong cà phê là

9

hai alkaloids chính được biết đến như một chất kích thích ở người và làm nên sự

yêu thích đối với cà phê của chúng ta

Caffeine (còn được gọi là trimethylxanthine), một alkaloid có thể là lý do khiến

bạn thích uống cà phê Ancaloit có tác dụng kích thích thần kinh trung ương làm tăng sự tỉnh táo, chúng có hương vị đắng ở dạng tinh khiết Caffeine góp phần tạo

nên sức mạnh tổng thể và vị đắng là đặc trưng của cà phê Tùy thuộc vào loài và

giống, caffeine chiếm từ 0,6 đến 4% khối lượng hạt Đồng thời, trái với niềm tin chung, quá trình rang không làm giảm hàm lượng caffeine trong hạt Trong quả cà phê, Caffeine có vai trò là một chất chống côn trùng, Hàm lượng Caffeine trung bình trong Cà phê Robusta cao hơn so với cà phê Arabcia nên khả năng chống chịu sâu bệnh cũng tốt hơn Mặc dù được nhiều nghiên cứu công nhận là lành tính, và không tác động xấu đến sức khỏe, Song liều lượng sử dụng Caffeine cũng khác nhau với mỗi người tùy thuộc vào cơ địa, mức độ mẫn cảm

Trigonelline là một alkaloid khác được tìm thấy trong hạt cà phê ở nồng độ thấp hơn một chút so với caffeine Nó bắt đầu bị phân hủy ở 60°C nên trong quá trình rang (nóng hơn 200°C), hơn một nửa lượng trigonelline bị biến chất và tạo ra một

số hợp chất, bao gồm cả axit nicotinic, hay được gọi là vitamin B3, phần còn lại của trigonelline khi đi vào chiết xuất tạo ra mùi thơm ngọt, caramel và mùi đất.

2.2.4 Chất khoáng

Không thể không kể đến một lượng rất nhỏ các chất khoáng có trong cà phê, gồm khoảng 3-5% chủ yếu là Kali, Nito , Magie , Photpho, Clo Ngoài ra còn có các chất nhôm, sắt, đồng, lưu huỳnh, chỉ tồn tại dạng vêt Những chất này ảnh hưởng không tốt đến mùi hương cà phê Chất lượng cà phê càng cao thì khoáng chất càng thấp và ngược lại

2.2.5 Protein trong cà phê

Hàm lượng protein trong cà phê không cao nhưng đóng vai trò quan trọng giúp hình thành hương vị của cà phê trong quá trình rang qua phản ứng Maillard với các loại đường có trong cà phê Bằng các phương pháp định tính người ta nhận thấy trong thành phần protein có những axit amin chính

như: cystein, alanie ,phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine

Các axit amin này ít thấy ở dạng tự do, chúng được giải phóng ra và tác dụng với nhau hoặc tác dụng với những chất tạo mùi và vị cho cà phê rang.Trong các chất axit amin kể trên đáng chú ý nhất là những axit amin có chứa lưu huỳnh như

cystein , methionine và proline… chúng góp phần tạo hương đặc trưng của cà phê sau khi rang Đặc biệt , methionine và proline có tác dụng làm giảm oxy hóa

các chất thơm, làm cho cà phê rang giữ được mùi vị khi bảo quản

2.2.6 Chất thơm trong cà phê

Các thành phần của phần này không có chung một đặc tính hóa học, nhưng đặc tính vật lý là dễ bay hơi Đây là nguyên nhân tạo ra phần lớn hương thơm của cà phê và thường đến từ các phản ứng trong quá trình rang, nhưng việc bảo quản cũng có thể ảnh hưởng đến chúng Việc nghiên cứu tất cả các hợp chất này là một công việc phức tạp và vẫn đang được tiến hành, vì có hơn 1000 hợp chất dễ bay hơi được tìm thấy trong một tách cà phê điển hình Chúng dễ bay hơi theo tên gọi và bản chất – chúng có xu hướng bay đi trước khi có thời gian để đo lường chúng Trong cà phê hàm lượng chất thơm rất nhỏ, nó được hình thành và tích lũy trong hạt Sự tích lũy chịu nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu và nhất là chủng loại cà phê Sự tích lũy chất thơm trong hạt nói riêng và cấu trúc hương vị cà phê chịu ảnh hưởng rất lớn bởi độ cao, vì vậy các loại cà phê được trồng càng cao, thì phẩm chất hạt càng tốt hơn