Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG BEN Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR SEQUENCING Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : Nhóm 10 (Chiều thứ 4) Niên khóa : 2021 - 2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH NẤM MALASSEZIA GÂY BỆNH LANG BEN Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR SEQUENCING Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT VÕ HOÀNG PHONG ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN NGUYỄN ĐỨC LỢI VÕ HỒNG PHẨM TP Thủ Đức, 10/2023 LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn kính trọng sâu sắc, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giảng viên Huỳnh Văn Biết Trong trình học tập tìm hiểu mơn Thiết bị Kỹ thuật Công nghệ Sinh học, thầy nỗ lực, tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức bổ ích đến cho chúng em, kiến thức tảng, hành trang quan trọng cho chúng em tương lai Bên cạnh đó, chúng em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Trương Quang Toản, q trình học Thực hành, anh ln nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn bảo chúng em kiến thức kỹ thực hành phòng thí nghiệm Mặc dù khoảng thời gian gắng bó thầy anh không nhiều, xong chúng em trân trọng khoảng thời gian học tập dạy thầy anh Trong trình thực báo cáo này, hiểu biết nhiều hạn chế nên làm khó tránh khỏi thiếu sót Chúng em mong nhận lời góp ý, chỉnh sửa thầy anh để báo cáo chúng em ngày hoàn thiện Cuối lời, chúc thầy anh có thật nhiều sức khỏe, may mắn trì đam mê với cơng việc giảng dạy hệ trẻ Chúng em xin chân thành cảm ơn ! i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iiv DANH SÁCH CÁC HÌNH v DANH SÁCH CÁC BẢNG vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM MALASSEZIA 1.1.Vài nét lịch sử 1.2.Đặc điểm nấm Malassezia 1.3.Tác động Malassezia bệnh da 1.4.Một số bệnh lý nấm Malassezia 1.4.1.Viêm da dầu 1.4.2.Viêm da địa 1.4.3.Viêm nang lông 1.4.4.Nấm móng CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG BEN 2.1 Khái niệm bệnh lang ben 2.2 Chẩn đoán bệnh lang ben 2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng 2.2.2 Cận lâm sàn 2.3 Xác định Malassezia bệnh lang ben 2.3.1 Soi trực tiếp tìm nấm 2.3.2 Nuôi cấy, định danh 2.3.3 Phân tích phân tử PCR CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Xác định Malassezia PCR Sequencing 3.1.1 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 3.1.1.1 Vật liệu cho PCR 3.1.1.2 Vật liệu đo nồng độ ADN sản phẩm PCR 3.1.1.3 Vật liệu giải trình tự gen 3.1.2 Tiến hành nghiên cứu 10 3.1.2.1 Kỹ thuật điện di sản phẩm PCR 10 3.1.2.2 Kỹ thuật đo nồng độ ADN sản phẩm PCR 11 ii 3.1.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 11 3.1.2.4 Nhận định kết 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT M caparae : Malassezia caparae M cuniculi : Malassezia cunniculi M dermatis : Malassezia dermatis M equina : Malassezia equina M furfur : Malassezia furfur M globosa : Malassezia globosa M japonica : Malassezia japonica M nana : Malassezia nana M sympodialis : Malassezia sympodialis M yamatoensis : Malassezia yamatoensis Malassezia spp : Malassezia species plus P orbiculair : Pityrosporum orbiculair P ovale : Pityrosporum ovale PCR : Polymerase Chain Reaction PCR Sequencing : PCR giải trình tự gen RAPD : Random amplification of polymorphic DNA AFLP : Amplified Fragment Length polymorphism DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PFGE : Pulsed-Field Gel Electrophoresis RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism PBS : Photphate Buffered Saline TAE : Tris - Axit Acetate - EDTA iv DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Siêu cấu trúc vi nấm (a),(b) M furfur; (c),(d),(e),(f) M.globosa Hình 1.2 Cơ chế gây bệnh Malassezia Hình 2.1 Đặc điểm lâm sáng thay đổi sắc tố da (a) Dát tăng sắc tố; (b) Dát giảm sắc tố Hình 3.1 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật PCR Sequencing 11 v DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Đặc điểm chung nấm Malassezia vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM MALASSEZIA 1.1.Vài nét lịch sử Năm 1853, Robin phát hình thái sợi nấm thương tổn bệnh nhân lang ben, đặt tên Microsporum furfur Đến năm 1874, Malassez mô tả tác nhân gây bệnh lang ben tế bào hình trịn bầu dục, vỏ dày, xung quanh có viền kép, tập trung thành đám sợi nấm thơ ngan sợi miến vụn (hình ảnh ”mì ong” ”thịt viên”), đặt tên Malassezia furfur Từ hiểu biết ban đau, người ta cho Malassezia dạng sợi nấm, Pityrosporum nấm men Bằng thực nghiệm chứng minh, Gordon nuôi cấy thành công nấm P orbiculare P ovale, Faergemann J thành công gây bệnh thực nghiệm với P orbiculare Như vậy, thực chất Malassezia tồn lưỡng dạng xuất hình thái sợi hay men biến đổi, phân chia vòng đời vi nấm Hai loài P orbiculare P ovale xác nhận thuộc chi Malassezia tên chung M furfur Khi quan sát thể người phịng thí nghiệm nghiêncứu chứng minh đa dạng chi Malassezia hình dạng, siêu cấu trúc nấm men đáp ứng miễn dịch thể Năm 1995-1996, ứng dụng thành công công nghệ sinh hoc phân tử giải mã trình tự gen lồi nấm phụ thuộc lipid, đặt tên chung Malassezia spp Năm 2004, nhà khoa học Nhật Bản công bố so loài mới: M dermatis M japonica phân lập từ thương tổn da bệnh viêm da địa M yamatoensis từ thương tổn da viêm da dầu vùng da lành người khỏe mạnh Một số loài phụ thuộc lipid phân lập từ da động vật có khả gây bệnh cho người mô tả như: M nana, M caparae, M equina, M cuniculi Và tổng số loài Malassezia y văn cơng nhận lên tới 14 lồi 1.2.Đặc điểm nấm Malassezia Malassezia spp nấm men thuộc vi hệ da người động vật máu nóng Ngày người ta phát Malassezia đóng vai trị quan trong c h ế b ệ n h sinh nhiều bệnh lý khác da lang ben, viêm dau dầu, viêm da địa, viêm nang lông, vảy nến, ung thư da… Bảng 1.1 Đặc điểm chung nấm Malassezia Đặc điểm Nội dung Phân loại khoa học Thuộc ngành Basidomycota, phân ngành Ustilaginomycotina, lớp Exobasidomycetes, Malasseziales, họ Malasseziacae Cấu trúc Đơn bào, có nhân chuẩn Hình dạng Hình trịn hình bầu dục, vách ngăn rộng, không màu, gặp dạng sợi vơ định hình Kích thước Dao động từ 3-10 m, thông thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn Khả thích nghi + Thích nghi môi trường đường cao + Tồn thiên nhiên, môi trường chứa đườngnhư hoa quả, rau dưa, mật mía Sinh sản vơ tính theo phương thức nảy chòi Khi bào tử chòi Sinh sản sinh theo dạng tuyến tính khơng phân c ắ t hình thành nên cấu trúc goi giả sợi nấm Có 14 lồi Malassezia da người động vật, lồi Các lồi gặp nhiều M globosa, M sympodialis, M Furfur Hình 1.1 Siêu cấu trúc vi nấm (a),(b) M furfur; (c),(d),(e),(f) M.globosa 1.3.Tác động Malassezia bệnh da Trên da khỏe mạnh, Malassezia sống ký sinh vi hệ , sử dụng chất dinh dưỡng cần thiết cho trình sinh trưởng mà không gây bệnh Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng trở thành tác nhân gây bệnh hội Hình 1.2 Cơ chế gây bệnh Malassezia Tác động nấm men da bao gồm: (a) tồn vi hệ da; (b) tác động chức tế bào sắc tố dẫn đến thay đổi màu sắc dát da; (c) kích thích trình viêm qua đáp ứng miễn dịch dịch thể (trong bệnh viêm da dầu); (d) gây đáp ứng miễn dịch dịch thể (trong bệnh viêm da địa); (e) kích thích tế bào viêm phá hủy nang lơng (trong bệnh viêm nang lơng) Nấm Malassezia thích nghi cách sản xuất enzym sinh lượng bao gồm loại lipase loại phospholipase Những enzym tham gia vào trình thủy phân axit béo trung tính thành axit béo tự gây phản ứng trung gian tế bào kích hoạt đường gây viêm Đồng thời, tổng hợp số chất có hoạt tính sinh học indole hoạt động thông qua thụ thể hydrocacbon (Ahr) tập trung tế bào lớp biểu bì Ngồi ra, Malassezia spp sản xuất số hợp chất khác tham gia đáp ứng miễn dịch hấp thụ tia cực tím như: indirubin indolo carbazone (ICZ) Do đó, có giả thuyết cho Malassezia tiềm gây ung thư da Năm 1988, Christina Schönborn quan sát thấy 35% trường hợp ung thư da có nhiễm nấm, 79,2% trường hợp nhiễm Malassezia spp Năm 2013, Magiatis P cs chứng minh Ahr có vai trị tác nhân quan trong chế gây bệnh nấm Malassezia có khả làm thay đổi cau trúc nội môi gây biểu bệnh lý da Mặt khác, thể ln tìm cách kháng lại Malassezia theo chế bảo vệ: Miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào Trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, HR Ashbee (1994) đánh giá thay đổi so CD4/CD8 khả ức chế di chuyển bạch cầu Kết cho thay, so CD4/CD8 khơng có khác biệt người khỏe mạnh người bệnh lang ben, có thay đổi người viêm da dầu (chỉ so 2/1 người khỏe mạnh 0,6/2,8 người viêm da dầu) Khi tìm hiểu mối quan hệ kháng nguyên Malassezia với kháng thể, tác giả thấy có xuat phản ứng miễn dịch chéo hình thái tế bào nấm men nấm sợi Do cho dù kháng nguyên Malassezia có pha men hay pha sợi chung loại kháng thể huyết bệnh nhân lang ben 1.4.Một số bệnh lý nấm Malassezia 1.4.1.Viêm da dầu Viêm da dầu (Seborrheic Dermatitis - SD) bệnh da mãn tính thường gặp Bệnh chủ yếu trẻ sơ sinh, tuổi dậy độ tuổi 50, nam gặp nhiều nữ Bệnh đặc trưng biểu dát đỏ, ngứa vảy da bóng mỡ xuất vùng nhiều tuyến bã hoạt động: da đau, trán, rãnh mũi má, mí mắt, cung mày, sau tai, ống tai ngoài, vùng trước xương ức, vùng liên bả vai 1.4.2.Viêm da địa Viêm da địa (Atopic Dermatitis) trước gọi chàm thể tạng hay chàm địa bệnh da thường gặp Bệnh gặp lứa tuổi, hay gặp trẻ em, đặc biệt trẻ tuổi Nguyên nhân chế bệnh sinh chưa rõ ràng đa số tác giả cho viêm da địa kết hợp địa dị ứng (Atopy) với tác nhân gây kích thích gây viêm 1.4.3.Viêm nang lơng Bệnh biểu thương tổn thường lành tính triệu chứng thường gặp như: ngứa, mụn mủ, sẩn đỏ nang lông, phân bố chủ yếu thân mình, hay gặp lứa tuổi trung niên 1.4.4.Nấm móng Hầu hết nguyên nấm móng gây lồi nấm sợi Nhưng gần nhiều báo cáo cho thay nấm Malassezia gây bệnh nấm móng Trong điều kiện thơng thường, nấm men thiếu khả sừng hóa (keratolytic) Khi có điều kiện thuận lợi đồng thời xuất biến đổi không bình thường trình sinh trưởng nên chúng xâm chiếm phá hủy móng, chủ yếu móng tay CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ BỆNH LANG BEN 2.1 Khái niệm bệnh lang ben Lang ben (Pityriasis versicolor) bệnh nấm nông da, nguyên Malassezia spp đặc trưng dát hình trịn bầu dục, thay đổi màu sắc da có vảy da ẩm mỏng, tổn thương đứng rải rác liên kết với thành đám, tập trung chủ yếu vùng da giàu bã nhờn phần thể kèm theo ngứa 2.2 Chẩn đoán bệnh lang ben 2.2.1 Chẩn đoán lâm sàng Thương tổn dát, mảng hình trịn bầu dục Bệnh thường bắt đầu chấm màu hồng, nâu trắng da Các chấm lớn dần, lan rộng liên kết với thành mảng ranh giới rõ rệt với da lành Thương tổn có hình bầu dục đa cung Kích thước đám thương tổn từ 1-3 cm, đơi liên kết với tạo thành mảng thương tổn lan rộng Thương tổn đặc trưng thay đổi màu sắc da, tăng sắc tố giảm sắc tố, dát hỗn hợp tăng giảm sắc tố Màu sắc tổn thương hay gặp màu nâu (tăng sắc tố) trắng (giảm sắc tố) vào cá thể với số lượng, loại tế bào hắc tố melanin mức độ hoạt động, diện caroten độ dày lớp sừng Hình 2.1 Đặc điểm lâm sáng thay đổi sắc tố da (a) Dát tăng sắc tố; (b) Dát giảm sắc tố Trên bề mặt thương tổn có phủ lớp vảy da ẩm mỏng “vảy cám”, trường hợp khó phát cạo nhẹ bề mặt tổn thương thấy vảy da bong dễ dàng gọi dấu hiệu “vỏ bào” Dùng đèn Wood soi vùng rìa thương tổn phịng tối có tượng phát quang, xuất màu vàng sáng vàng huỳnh quang Triệu chứng thường gặp ngứa, ngứa tăng lên mồ hôi cảm giác ngứa râm ran Có thể khơng ngứa cảm giác ngứa thoáng qua 2.2.2 Cận lâm sàn - Xét nghiệm trực tiếp: Dùng KOH 20% + ParkerTM blue black ink tỷ lệ (1:2) soi trực tiếp kính hiển vi Nhận định hình thái, số lượng mật độ Malassezia - Ni cấy định danh lồi Malassezia gây bệnh - PCR Sequencing: dựa đoạn DNA đặc trưng nhằm xác định loài nấm 2.3 Xác định Malassezia bệnh lang ben 2.3.1 Soi trực tiếp tìm nấm Đây phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, kết nhanh giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đoán sơ vi nấm gây bệnh Tuy nhiên, kết phụ thuộc vào kinh nghiệm kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm Kỹ thuật soi trực tiếp tìm nấm tiến hành qua nhiều bước, bước quan trọng bộc lộ lớp vỏ dày bao quanh tế bào nấm nhận định hình thái vi nấm kính hiển vi Hóa chất thường dùng có tính kiềm mạnh thấm tốt vào lớp sừng giúp làm mềm tổ chức biểu mơ, bộc lộ hình thái vi nấm Các dung dịch kiềm thường sử dụng bao gồm: KOH 10%, KOH 20%, NaOH 10% Các chất màu sử dụng bao gồm: ParkerTM blue black ink, ParkerTM black ink, Chicago sky blue 6B, Calcofluor white 2.3.2 Nuôi cấy, định danh Nuôi cấy, định loại coi “tiêu chuẩn vàng” xác định nguyên vi sinh vật nói chung, đặc biệt xác định xác lồi Malassezia gây bệnh Bệnh phẩm vảy da bệnh nhân lang ben Các môi trường nuôi cay sử dụng bao gồm: thạch Sabouraud, thạch m-Dixon, thạch Leeming- Notman 2.3.3 Phân tích phân tử PCR Kỹ thuật phân tử áp dụng định danh nấm có nhiều phương pháp bao gồm: phương pháp “dấu vân tay” DNA; kỹ thuật DNA đa hình nhân ngẫu nhiên (RAPD); kỹ thuật đa hình độ dài nhân chọn lọc (AFLP); điện di DNA biến tính gel gradient (DGGE); điện di trường xung điện (PFGE); kỹ thuật thị PCR chuỗi đặc trưng; kỹ thuật PCR đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (RFLP); kỹ thuật PCR đa hình cấu tạo sợi đơn (PCR-SSCP); PCR-Realtime; PCR Sequencing So với nuôi cấy định danh, phương pháp dễ thực hơn, giúp xác định xác lồi Malassezia Bệnh phẩm sử dụng vảy da khuẩn lạc PCR từ vảy da: đơn giản hơn, bệnh phẩm đươc lấy vào dung dịch đặc biệt, sau sử dụng kỹ thuật PCR khác để xác định loài Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy khơng cao nhiều trường hợp vảy da bệnh nhân mỏng, dễ bong, khó lấy được, nữa, cịn phụ thuộc vào mơi trường bảo quản bệnh phẩm PCR từ khuẩn lạc: tác giả áp dụng phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp nuôi cấy Ưu điểm phương pháp xác định xác lồi Malassezia với độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thời gian phải đợi vi nấm phát triển mơi trường ni cấy, sau lấy bệnh phẩm, tính thực tiễn khơng cao, áp dụng sở có tính nghiên cứu CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Xác định Malassezia PCR Sequencing Bài báo cáo nhóm chúng tơi tập trung vào việc trình bày sử dụng kỹ thuật PCR Sequencing từ vảy da bệnh nhân lang ben Bệnh phẩm lấy từ vảy da bệnh nhân lang ben, xử lý thô dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% Chúng thiết kế cặp mồi nhằm phát có mặt nấm Malassezia mẫu bệnh phẩm Tiếp đó, đưa mẫu bệnh phẩm vảy da tiến hành PCR, lấy sản phẩm thu giải trình tự gen Dựa gen loài Malassezia ngân hàng gen quốc tế, chúng tơi so sánh trình tự nucleotid thu thập để xác định loài Malassezia 3.1.1 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 3.1.1.1 Vật liệu cho PCR Thành phan chất tham gia phản ứng (được tối ưu điều kiện nghiên cứu): Nước cất; X 10 PCR buffer; dNTP 1,25 mM; MgCl2 25 mM; Ampli Taq polymerae 5U; Primer (10 μM) Trang thiết bị làm PCR: Máy luân nhiệt tự động (PCR) GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystems, USA); Máy điều nhiệt tự động (PCR) MasterCycler Grandient, Eppendorf (Đức); Máy ly tâm lạnh; Bộ điện di ngang Horizon58 (Gibco-BRL); Máy soi gel Wealtec Corp Model MD-20 (USA); Máy chụp ảnh gel Geldoc (Biorad, Mỹ) 3.1.1.2 Vật liệu đo nồng độ ADN sản phẩm PCR + Sử dụng máy Bio photometer (Đức) + Tube chứng: 50 l dung dịch PBS nước cất + Tube mẫu: l sản phẩm PCR + 45 l dung dịch PBS nước cất 3.1.1.3 Vật liệu giải trình tự gen Chạy phản ứng cho giải trình tự gen: Sử dụng kít Big Dye X Terminator (Mỹ) Pha mix theo hướng dẫn kit: Big Dyeđ Terminator (Ready mix) v3.1 cycle sequencing RR-100: 4,0 l; Big DyeđTerminator v1.1, v3.1 5X sequencing buffer: 2,0 l; Primer (Sử dụng primer R): 1,0 l; ADN template (sản pham PCR): 2,5 l; Nước khử ion: 10,5 l; Tổng thể tích phản ứng: 20,0 l Chứng dương: (1 tube) Thành phần bao gồm: Big Dyeđ Terminator (Ready mix) v3.1 cycle sequencing RR-100: l; Big Dyeđ Terminator v1.1, v3.1 5X sequencing buffer: l; pGEM-3Zf (+): l; Primer F M13(-21) kit: l; Nước khử ion: 12 l; Tổng thể tích phản ứng: 20 l 3.1.2 Tiến hành nghiên cứu Nguyên tắc: PCR thử nghiệm nhân đoạn DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt độ Một chu kỳ nhiệt độ bao gồm giai đoạn Giai đoạn biến tính: đau tiên nhiệt độ đưa lên 94oC, nhiệt độ liên kết hydro mạch đôi DNA bị đi, nhờ DNA đích bị biến tính thành mạch đơn Giai đoạn ghép cặp: kế nhiệt độ hạ đến 55- 65oC nhiệt độ thích hợp để đoạn mồi tìm đến ghép cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích Cuối nhiệt độ đưa lên 72oC nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzym Taq polymerase để kéo đầu dNTP lại đầu 3’ cua đoạn mồi ghép cặp đầu 5’ sợi DNA đích để bắt nguồn cho tổng hợp mạch bổ sung Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao, chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 đến 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tương đương đến hàng tỷ 3.1.2.1 Kỹ thuật điện di sản phẩm PCR - Điện di sản phẩm sau chạy PCR gel Agarose 1,2% với dung dịch đệm TAE - Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: Đun sơi cho tan hồn tồn Agarose đệm TAE lị vi sóng Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 56-600C, trộn 1x thể tích gel red đổ gel vào phiến nhựa điện di (6 x 5,5 cm x 11 cm tuỳ theo so lượng mẫu cần điện di) Phiến đặt thăng mặt phẳng nằm ngang đặt sẵn lược - Để gel đông lại (khoảng 30 phút nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược, đặt gel vào buồng điện di ngang cho chìm hẳn dung dịch đệm TAE - Dùng micropipette cho sản phẩm PCR vào giếng gel.Với gel sử dụng lược nhỏ, dùng 10 l mẫu cho giếng - Điện di với hiệu điện 120V, cường độ dòng điện 100 mA thời gian 30 phút - Các mẫu thực nghiệm điện di song song với chứng âm dương - Ln có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết đọc Bản gel sau điện di soi ánh đèn cực tím, vạch ADN gel phát sáng ánh đèn cực tím 10 Đọc kết máy GelDoc (BioRad) chụp ảnh phần mềm chuyên dụng Hình 3.1 Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật PCR Sequencing 3.1.2.2 Kỹ thuật đo nồng độ ADN sản phẩm PCR - Đo bước sóng 260 nm: đơn vị = 50 g/ml - Đoc kết quả: Lượng ADN có mẫu (g/ml) x10x103/103(l) = nanogam (ng)/ l (x10: Độ pha loãng 10 lần, x103/103: đổi đơn vị từ g/ml sang ng/ l) 3.1.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen Xác định vi nấm Malassezia Các trình tự nucleotide gen 5.8S, 26S 18S xử lý phần mềm ATGC 7.2 11 3.1.2.4 Nhận định kết So sánh trình tự tương đồng ngân hàng liệu gen quốc tế NCBI (GenBank), trình tự Malassezia tương đồng có giá trị cao lựa chọn 12