Seminar môn thiết bị kỹ thuật cnsh nhóm 12 t4ca3

Huỳnh Văn BiếtBáo cáo môn kỹ thuật và thiết bị CNSHChủ đề:Phát hiện cụ thể tế bào dương tính với Cytokeratin-20 trong máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng phương pháp High sensitivi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

GV hướng dẫn: TS Huỳnh Văn Biết

Báo cáo môn kỹ thuật và thiết bị CNSH

Chủ đề:

Phát hiện cụ thể tế bào dương tính với Cytokeratin-20

trong máu bệnh nhân ung thư đại trực tràng bằng

phương pháp High sensitivity real-time reverse

transcription PCR

Sinh viên thực hiện: Nhóm 12

01/30/2024

Nội dung

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đặt vấn đề

Nguồn: gco.iarc.fr

• Theo David K WYLD và cộng sự, khoảng 80% bệnh nhân mắc bệnh có thể phẫu thuật cắt bỏ nhưng khoảng một nửa số bệnh nhân này sau đó sẽ chết vì di căn

• Bên cạnh đó, vì 20–30% bệnh nhân không có di căn ở các hạch như vậy sẽ

chết trong vòng 5 năm do di căn xa hoặc tái phát cục bộ, thì rõ ràng

chúng ta cần có phương pháp nhạy hơn để phát hiện khối u nhỏ.(David K

WYLD và cộng sự)

Đặt vấn đề

01/30/2024

Nguồn: medpagetoday.com

Đối tượng nghiên cứu

• Theo Osborn và Weber năm 1983, Cooper và cộng sự

năm 1985, Lane và Alexander năm 1990, vì các tế bào

ác tính thường giữ lại sợi trung gian (IFs) của loại tế

bào tiền thân của chúng và do đó CKs đã được sử dụng

để mô tả đặc điểm của các tế bào tân sinh có nguồn

gốc biểu mô.

Nguồn: cdc.gov

CK19

CK20

6

Đối tượng nghiên cứu

• CK 20 không được phát hiện trong máu ngoại vi bình

thường, tủy xương hoặc hạch bạch huyết (Burchill và cộng

sự năm 1995, Gunn và cộng sự năm 1996, Soeth và cộng sự

năm 1996).

• Tất cả 8 dòng tế bào ung thư ruột kết ở người đều biểu hiện

CK 20 mRNA, được chứng minh bằng cách khuếch đại bản

phiên mã 370-bp CK 20 (David K WYLD và cộng sự, 1998)

Nguồn: SA Burchill và cộng sự, 1995

Nguồn: David K WYLD và cộng sự, 1998 01/30/2024

Phương pháp nghiên cứu

• Máu tĩnh mạch từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở các giai đoạn khác nhau và các tình nguyện viên khỏe mạnh để làm đối chứng.

• Sử dụng tế bào khối u HT29 được duy trì nuôi cấy liên tục trong môi trường McCoy’s

Nguồn: Stankevicius và cộng sự, 2016 Nguồn: cls.shop

01/30/2024

Phương pháp nghiên cứu

• Tất cả bệnh nhân và đối chứng không bị ảnh hưởng bởi tình trạng phản ứng viêm

• 5 ml máu đầu tiên được loại bỏ để tránh nhiễm bẩn tế bào da

• 10 ml máu tiếp theo được thu thập trong ống chân không, có natri citrat và chỉ sử dụng trong vòng 3

giờ Các mẫu máu được pha loãng theo tỷ lệ 1:3 trong RPMI 1640 và các tế bào đơn nhân (MNCs) được tách ra bằng cách phân tách mật độ Ficoll

Nguồn: www.researchgate.net

Tham Khảo từ nghiên cứu của Femke Vlems và cộng sự, 2002

Phương pháp nghiên cứu

• mRNA được chiết xuất từ tế bào HT29 và tế bào đơn nhân từ những người hiến

tặng và bệnh nhân khỏe mạnh bằng cách kết tủa dạng phenol-chloroform

và thu giữ RNA vi hạt.

• cDNA được điều chế bằng cách thêm mRNA chiết xuất vào oligo-dT và enzyme phiên mã ngược của virus gây bệnh bạch cầu Moloney-murine

01/30/2024

Phương pháp nghiên cứu

• RT-qPCR sử dụng Taqman Probe hoặc SYBR-Green và tế bào HT29.

• Single-round RT-qPCR (S-PCR) sử dụng SYBR-Green và tế bào HT29.

• Nested RT-qPCR (N-PCR) sử dụng SYBR-Green trên tế bào HT29 và mẫu lâm sàng.

• Giải trình tự trực tiếp các sản phẩm PCR từ tế bào HT29 và tế bào CK20+ của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Nguồn: Giuliana Giribaldi và cộng sự, 2006

Tài liệu tham khảo

1 https://gco.iarc.fr/today/home

2 Vlems, F A., Diepstra, J H S., Cornelissen, I M H A., Ruers, T J M., Ligtenberg, M J L., Punt, C J A., & Van Muijen,

G N P (2002) Limitations of cytokeratin 20 RT-PCR to detect disseminated tumour cells in blood and bone marrow of

patients with colorectal cancer: expression in controls and downregulation in tumour tissue. Molecular

Pathology, 55(3), 156

3 Moll, R., Franke, W W., Schiller, D L., Geiger, B., & Krepler, R (1982) The catalog of human cytokeratins: patterns of

expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 31(1), 11-24.

4 DA, A (1984) Clinical perspective of human colorectal cancer metastasis. Cancer Metastasis Rev, 3, 303-323.

5 Dimmler, A., Gerhards, R., Betz, C., Günther, K., Reingruber, B., Horbach, T., & Papadopoulos, T (2001) Transcription of cytokeratins 8, 18, and 19 in bone marrow and limited expression of cytokeratins 7 and 20 by

carcinoma cells: inherent limitations for RT-PCR in the detection of isolated tumor cells. Laboratory

investigation, 81(10), 1351-1361.

6 Max, N., Willhauck, M., Wolf, K., Thilo, F., Reinhold, U., Pawlita, M., & Keilholz, U (2001) Reliability of PCR-based

detection of occult tumour cells: lessons from real-time RT-PCR. Melanoma Research, 11(4), 371-378.

7 Soeth, E., Röder, C., Juhl, H., Krüger, U., Kremer, B., & Kalthoff, H (1996) The detection of disseminated tumor cells

in bone marrow from colorectal‐cancer patients by a cytokeratin‐20‐specific nested reverse‐transcriptase‐

polymerase‐chain reaction is related to the stage of disease. International Journal of Cancer, 69(4), 278-282.

8 Effect of Blood Sample Handling and Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction Assay Sensitivity on Detection

of CK20 Expression in Healthy Donor Blood

9 Wyld, D K., Selby, P., Perren, T J., Jonas, S K., Allen‐Mersh, T G., Wheeldon, J., & Burchill, S A (1998) Detection of colorectal cancer cells in peripheral blood by reverse‐transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin

20. International journal of cancer, 79(3), 288-293.

10 Giribaldi, G., Procida, S., Ulliers, D., Mannu, F., Volpatto, R., Mandili, G., & Turrini, F (2006) Specific detection of cytokeratin 20-positive cells in blood of colorectal and breast cancer patients by a high sensitivity real-time reverse

12 01/30/2024