bc thiết bị và kỹ thuật cnsh nhóm 8

Do sự chênh lệch về kháng thể, các khối u chứa nhiều protein cyclin D1 có liên quan đến khả năng kháng lại liệu pháp nội tiết và thời gian sống sót tái phát nhanh hơn của bệnh nhân giải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CYCLIN D1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

Khoa : Khoa khoa học sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CYCLIN D1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

Vương Thục Quyên - 21126485

TS Huỳnh Văn Biết Nguyễn Minh Nhật - 21126436 Lê Thị Bảo Ngân - 21126414

TP Thủ Đức, 10/2023

1.2 Biểu hiện quá mức của cyclin D1 4

2 Kĩ thuật Western blot 5

2.1 Định nghĩa 5

2.2 Nguyên lý của phương pháp Western blot 6

2.3 Ưu điểm của phương pháp Western blot 6

2.4 Nhược điểm của phương pháp Western blot 7

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

1 Vật liệu 8

2 Phương pháp nghiên cứu 8

3 Kết quả mong muốn 10

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 11

TÀI LIỆU THAM KHẢO 12

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Chu trình tế bào của cyclin D1 (Knudsen, 2006) 3Hình 2.2 Sơ đồ minh họa các cơ chế nhắm mục tiêu Cyclin D1 trong các tế bào ung

thư vú dương tính với thụ thể estrogen α (Erα) (Montalto & De Amicis, 2020) 4

Hình 2.3 Tổng quan về kỹ thuật Western blot 7Hình 3.1 Kỹ thuật phân tích Western blot của protein 9

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮC

CDK : Cyclin - Dependent Kinase Rb : Retinoblastoma

Erα : Estrogen α

DAX1 : Corepressor Complex Component ARE : Androgen Responsive Element HDAC1 : Histone Deacetylases

Basal TM : Basal Transcriptional Machinery Adipo R1 : Adiponectin Receptor 1

P/CAF : P300/CBP-Associated Factor PVDF : Polyvinylidene Difluoride

HER2 : Human Epidermal Growth Factor Receptor 2

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ECL : Extended collective licensing

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo (WHO, 2023) ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới và cũng là nguyên nhân gây tử vong thứ hai do ung thư ở phụ nữ Theo công bố mới nhất của WHO, năm 2020 có đến 2,3 triệu phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú và có đến 685.000 ca tử vong trên toàn cầu Bên cạnh đó, khoảng 0,5 - 1% tỷ lệ ung thư vú diễn ra ở nam giới Các nhà nghiên cứu dự đoán rằng đến năm 2040, gánh nặng ung thư vú sẽ tăng lên hơn 3 triệu ca mắc mới mỗi năm (tăng 40%) và hơn 1 triệu ca tử vong mỗi năm (tăng 50%) (WHO, 2022)

Hình 1.1 Tỉ lệ ung thư ở nữ năm 2020 (Observatory, 2020)

Ở Việt Nam, ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ, chiếm khoảng 25,8% số ca ung thư mới ở phụ nữ Theo báo cáo của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), vào năm 2020, Việt Nam có khoảng 21.555 ca ung thư vú mới và 9.345 ca tử vong do ung thư vú Nhìn chung, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư vú ở Việt Nam thấp hơn so với các nước Trung Quốc, Hàn Quốc, nhưng đây vẫn là con số đáng báo động và cần được chú tâm

2 Mục tiêu

Trên thế giới đã có những nghiên cứu nhất định được thực hiện nhằm phát hiện ung vú một cách nhanh chóng, giảm tỷ lệ tử vong Trong đó có thể kể đến các nghiên cứu như cyclin D1 trong ung thư vú (Barnes & Gillett, 1998) Biểu hiện cyclin D1 ở bệnh nhân ung thư vú được điều trị bổ trợ dựa trên Tamoxifen (Rudas, 2008) Vai trò của cyclin D1 trong ung thư biểu mô tuyến vú (Barnes & Gillett, 1998), Cyclin D1 từ

lâu đã được xác định là một protein quan trọng trong nghiên cứu về ung thư, đặc biệt là ung thư vú Cyclin D1 có thể được đánh giá bằng các phương pháp khác nhau như phân tích tế bào theo dòng chảy, Real- time PCR, hay thông thường là hóa mô miễn dịch, Trong bài báo cáo sử dụng phương pháp Western Blot nhờ tính chính xác và có thể bán định lượng biểu hiện cyclin D1 qua từng giai đoạn

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Cyclin D1 1.1 Định nghĩa

Cyclin là protein ( protein 36-kDa được mã hóa bởi gen CCND1) có trọng lượng phân tử trên 5000 Cyclin D1 hầu hết được biết đến với vai trò trong nhân, là chất điều hòa sự phát triển của chu kỳ tế bào Cyclin D1 điều chỉnh quá trình chuyển từ pha G1 sang pha S thông qua hoạt động của nó như là bộ điều chỉnh dị lập thể của Cyclin - Dependent Kinase 4 (CDK) và CDK6 Phức hợp Cyclin D1/CDK4 hoạt động chuyển vào nhân, protein phosphorylates u nguyên bào võng mạc (Rb) cùng với Cyclin E/CDK2, và loại bỏ tác động ức chế lên yếu tố phiên mã E2F, yếu tố này điều chỉnh quá

trình phiên mã của các gen cụ thể cần thiết cho tăng sinh tế bào Cyclin D1 được hình

thành khá sớm bởi các yếu tố tăng trưởng; tiếp theo nó ngăn chặn nghiêm trọng một số con đường nội bào kiểm soát sự tăng sinh tế bào Rối loạn điều hòa phiên mã, tích lũy và phổ biến Cyclin D1, cũng như sự lắp ráp và tăng cường hoạt động của CDK nhận thức của nó, dẫn đến sự phát triển tế bào không kiểm soát được Do đó, Cyclin D1 thực hiện vai trò trung tâm trong cơ chế bệnh sinh của bệnh ung thư (Montalto & De Amicis, 2020)

Hình 2.1 Chu trình tế bào của cyclin D1 (Knudsen, 2006)

1.2 Biểu hiện quá mức của cyclin D1

Biểu hiện của cyclin D1 làm rút ngắn pha G1 của chu kỳ tế bào, giảm thể tích tế bào và giảm sự phụ thuộc vào nguyên phân Các tế bào bước vào pha S sớm hơn dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát được, biến đổi sau hơn và xuất hiện ung thư

Cyclin D1 được biểu hiện quá mức trong tới 50% trường hợp ung thư vú và việc khuếch

đại gen CCND1 có liên quan đến kết quả điều trị kém ở bệnh nhân Trong các khối u

vú, tỷ lệ dương tính với Cyclin D1 cao hơn tương ứng với tỷ lệ dương tính với ER (thụ

ra sự biểu hiện quá mức) Tuy nhiên, sự biểu hiện quá mức của protein Cyclin D1 hoặc

khuếch đại gen CCDN1 liên quan đến khả năng sống sót của bệnh nhân ung thư Do sự

chênh lệch về kháng thể, các khối u chứa nhiều protein cyclin D1 có liên quan đến khả năng kháng lại liệu pháp nội tiết và thời gian sống sót tái phát nhanh hơn của bệnh nhân

giải thích bằng số lượng bản sao gen tăng lên, cho thấy rằng sự kích hoạt gây bệnh của cyclin D1 có thể xảy ra ở các cấp độ phân tử khác nhau, bao gồm rối loạn điều hòa phiên mã và sau phiên mã

Hình 2.2 Sơ đồ minh họa các cơ chế nhắm mục tiêu Cyclin D1 trong các tế bào ung

thư vú dương tính với thụ thể estrogen α (Erα) (Montalto & De Amicis, 2020)

Trong các dòng tế bào ung thư vú có biểu hiện quá mức cyclin D1, người ta đã chứng minh rằng cyclin D1 liên kết trực tiếp và kích hoạt Erα Hiệu ứng này được tái tạo với các đột biến cyclin D1 không có khả năng liên kết với CDK4 hoặc pRb, cho thấy rằng nó độc lập với CDK và pRb Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng cyclin D1 tương tác với các chất đồng hoạt hóa thụ thể steroid trong các dòng tế bào ung thư vú

Do đó, vai trò chính của cyclin D1 trong quá trình nguyên phân do estrogen gây ra ở tế bào ung thư vú không phụ thuộc vào CDK Hơn nữa, sự hiện diện của các hoạt động độc lập với CDK của cyclin D1 trong các khối u ở người đã được xác nhận Hiện tại, rõ ràng là cyclin D1 góp phần vào quá trình hình thành khối u và tiến triển ung thư vú không chỉ bằng cách kích hoạt CDK4/6 và cô lập p21/p27 mà còn bằng cách điều chỉnh hoạt động của các phân tử khác nhau trong các tương tác độc lập với CDK

1.3 Cơ chế

Sự khuếch đại cyclin D1 và biểu hiện quá mức như động lực trong ung thư vú ở người, khoảng 13% - 20% bệnh ung thư vú có DNA khuếch đại gấp 3 đến hơn 10 lần Việc khuếch đại, sao chép bổ sung của một vùng nhiễm sắc thể giới hạn (bộ khuếch đại) xuất hiện trong một tế bào do lỗi sao chép DNA Sự khuếch đại DNA mang lợi thế chọn lọc tế bào và thế hệ con cháu, khuếch đại cuối cùng sẽ xuất hiện như một dòng vô tính có thể quan sát sự thay đổi trong bộ gen của khối u (một gen gây ung thư) Các khó khăn về bộ khuếch đại thường lớn chứa nhiều gen được khuếch đại thụ động và không mang lợi thế chọn lọc

Trên nhiều khối u, cyclin D1 luôn được tìm thấy trong phạm vi của bộ khuếch đại Với sự phát triển, cyclin D1 biểu hiện quá mức mạnh mẽ khi được khuếch đại Cyclin D1 biểu hiện quá mức gây ra ung thư ở mô hình invitro (về mặt sinh lý) Tuy nhiên, vai trò của cyclin D1 là tác nhân gây bệnh ung thư ở người Sự tham gia thường xuyên và nhất quán của cyclin D1 làm cho vai trò rõ ràng của nó như là một dòng vô tính gen gây ung thư bị xáo trộn trong các khối u nguyên phát ở người Ở 50% số ca ung thư vú ở người đều tìm thấy sự biểu hiện quá mức protein cyclin D1 Trong nhiều khối u, tăng số lượng bản sao gen thì sự kích hoạt gây bệnh của cyclin D1 xảy ra thông qua cơ chế bổ sung, rối loạn điều hòa phiên mã và sau phiên mã

2 Kĩ thuật Western blot 2.1 Định nghĩa

Western blotting là một kỹ thuật phân tích cơ bản trong nghiên cứu protein Western blot, đôi khi được gọi là immunoblot protein, là một kỹ thuật dựa trên kháng thể được sử dụng để phát hiện sự hiện diện, kích thước và mức độ phong phú của các protein cụ thể trong một mẫu

Kỹ thuật này được phát triển vào 1979 bởi Harry Towbin và các đồng nghiệp và sau đó được đặt tên là “Western blot” do kỹ thuật này tương tự như Southern blotting

Tóm lại, protein trong mẫu nước được phân tách bằng điện di Sau khi chuyển sang màng thích hợp, các mẫu được thử nghiệm bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu với mục tiêu Những kháng thể này có thể được phát hiện, đồng thời đánh giá kích thước và mức độ phong phú của các protein liên kết so với các tiêu chuẩn hoặc biện pháp kiểm soát đã biết

2.2 Nguyên lý của phương pháp Western blot

Western Blot là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để phân tích và xác định sự hiện diện của một protein cụ thể trong mẫu Đầu tiên, protein trong mẫu được phân tách theo kích thước thông qua điện di gel Sau đó, protein được chuyển từ gel sang một miếng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) Miếng này sau đó được chặn để ngăn chặn sự gắn kết không đặc hiệu của kháng thể Kháng thể chính (đặc hiệu với protein mục tiêu) sau đó được thêm vào và cho phép gắn kết với protein mục tiêu Bất kỳ kháng thể chính nào không gắn kết sẽ được rửa sạch Kháng thể phụ, thường được gắn với một enzyme sinh quang hoặc phát quang, sau đó được thêm vào và cho phép gắn kết với kháng thể chính Cuối cùng, enzyme trên kháng thể phụ được kích hoạt, tạo ra một tín hiệu có thể được phát hiện và định lượng

2.3 Ưu điểm của phương pháp Western blot

Phương pháp Western Blot có nhiều ưu điểm khi được sử dụng trong việc chẩn đoán ung thư vú:

- Độ nhạy cao: Phương pháp này có khả năng phát hiện ít nhất 0.1 nanogram protein trong một mẫu, do đó, nó có thể phục vụ như một công cụ chẩn đoán sớm hiệu quả, cảm nhận được phản ứng miễn dịch ngay cả khi nhỏ nhất từ một virus hoặc vi khuẩn trong mẫu của bệnh nhân.

- Độ đặc hiệu cao: Phương pháp Western Blot có độ đặc hiệu cao nhờ hai yếu tố chính Đầu tiên, gel điện di chia mẫu thành các protein có kích thước, điện tính và cấu trúc khác nhau Quá trình này đã là một bước lớn về phát hiện, vì các dải hình thành trong gel đã cho biết gợi ý về kích thước của protein hoặc polypeptide quan tâm Sự tương tác đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên là yếu tố lớn thứ hai.

- Phát hiện HER2: Trong ung thư vú, HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) - là các thụ thể kiểm soát cách tế bào phát triển và phân chia, đóng vai trò trung tâm như một dấu hiệu tiên lượng và dự đoán Đánh giá HER2 đáng

tin cậy là trung tâm để xác định sự phù hợp của bệnh nhân mắc ung thư vú với các liệu pháp chống HER2 như trastuzumab và lapatinib.

2.4 Nhược điểm của phương pháp Western blot

Theo nhận định của (MacPhee, 2010) thì phương pháp Western blot vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như sau:

- Ly giải: chưa tối ưu hóa bộ đệm (VD: nồng độ chất tẩy rửa, nồng độ muối, nồng độ EDTA,pH), các protein chưa được chiết xuất hiệu quả

- Điện di: tối ưu hóa điều kiện tách biệt (VD:% polyacrylamide, bisacrylamide, tỉ lệ acrylamide), lượng protein cần nạp để phát hiện

- Khóa màng: chọn vật liệu hỗ trợ màng tốt nhất (VD: kích thước lỗ chân lông thích hợp, khả năng liên kết, độ bền, hiệu quả với ECL, nền huỳnh quang) Hiệu quả của việc chuyển giao với một dấu vết có thể đảo ngược

- Blot stripping: tối ưu hóa pha loãng kháng thể sơ cấp và thứ cấp, dung dịch blocking, số lượng rửa trong đệm hoặc nước, nhiệt độ để ủ kháng thể Mức độ phơi sáng trong điều kiện tối ưu hóa

- Stripping: mỗi kháng thể chỉ nhận dạng cụ thể protein quan tâm trên vết thấm Cần kiểm tra phương pháp có thực sự hiệu quả không

Lưu trữ và lặp lại: nhiệt độ để bảo quản kéo dài phải điều chỉnh từ 20°C hoặc -70°C

Hình 2.3 Tổng quan về kỹ thuật Western blot

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu

- Vật liệu: Bình nón, ống đong, cốc thủy tinh, đĩa petri, khay nhuộm,… - Thiết bị: Thiết bị điện di protein, thiết bị thấm, Power pack, gel roker, micropopetted, tips,…

2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp Western Blot là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để phát hiện và định lượng protein trong một mẫu Dưới đây là các bước chính để sử dụng Western Blot để đánh giá biểu hiện của gen Cyclin D1:

1 Chuẩn bị mẫu: Trước hết, mẫu protein cần được chuẩn bị Điều này thường bao

gồm việc tách các tế bào và sau đó ly giải chúng để giải phóng protein

2 Điện di: Protein sau đó được phân tách theo kích thước thông qua điện di gel

3 Chuyển protein: Sau khi điện di, protein được chuyển từ gel sang một miếng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride)

4 Blocking: Miếng nitrocellulose hoặc PVDF sau đó được chặn để ngăn chặn sự

gắn kết không đặc hiệu của kháng thể

5 Gắn kết kháng thể chính (kháng thể sơ cấp): Kháng thể chính (đặc hiệu với

Cyclin D1) sau đó được thêm vào và cho phép gắn kết với protein mục tiêu

6 Rửa: Bất kỳ kháng thể chính nào không gắn kết sẽ được rửa sạch

7 Gắn kết kháng thể phụ (kháng thể thứ cấp): Kháng thể phụ thường được gắn với

một enzyme phát tín hiệu quang, sau đó được thêm vào và cho phép gắn kết với kháng thể chính

8 Phát hiện: Cuối cùng, enzymee trên kháng thể phụ được kích hoạt, tạo ra một tín

hiệu có thể được phát hiện và định lượng

Hình 3.1 Kỹ thuật phân tích Western blot của protein

Trong trường hợp cụ thể của Cyclin D1, nghiên cứu đã chỉ ra rằng biểu hiện Cyclin D1 có liên quan đến các giai đoạn lâm sàng, kích thước khối u và sự liên quan của hạch bạch huyết Do đó, biểu hiện Cyclin D1 được phát hiện bằng Western Blot có thể được xem như là một bước tiến mới trong việc xác định ung thư vú nói chung, cũng như trong việc chẩn đoán bệnh học

Có một số kháng thể cho Cyclin D1 có thể được sử dụng trong kỹ thuật Western Blot:

1 Kháng thể Cyclin D1 từ Cell Signaling Technology

2 Kháng thể Recombinant Anti-Cyclin D1 [EPR2241] - C-terminal từ Abcam Kháng thể này phản ứng với chuột, chuột lang, và người

3 Kháng thể Cyclin D1 (A-12) từ Santa Cruz Biotechnology Đây là một kháng thể monoclonal chuột IgG2b κ phát hiện protein Cyclin D1 của chuột, chuột lang và người bằng WB, IP, IF, IHC (P), FCM và ELISA

4 Kháng thể Rabbit anti Human cyclin D1 từ Bio-Rad phát hiện một dải 36 kDa Kháng thể này đã được kiểm chứng rộng rãi cho kỹ thuật Western blotting sử dụng toàn bộ lysate tế bào

3 Kết quả mong muốn

Kết quả đạt được sau khi thực hiện tốt các bước của phương pháp Western blot sẽ được như sau:

- Phân tách protein: Cyclin D1, một protein có trọng lượng phân tử khoảng 36 kDa, được phân tách ra từ mẫu bằng điện di gel

- Chuyển protein lên màng: Cyclin D1 sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc PVDF

- Phát hiện protein: Sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận diện Cyclin D1 Kháng thể sơ cấp nhận diện Cyclin D1 và kháng thể thứ cấp nhận diện kháng thể sơ cấp

- Tạo ra tín hiệu: Kháng thể thứ cấp, khi kết hợp với cơ chất thích hợp, sẽ tạo ra tín hiệu có thể phát hiện được

Nếu các bước thực hiện được diễn ra chính xác, sẽ thu nhận được một dải ở vị trí tương ứng với trọng lượng phân tử của Cyclin D1 (khoảng 36 kDa) trên tấm màng PVDF ở mẫu của bệnh nhân ung thư vú Độ sáng của dải này cho phép bạn định lượng được mức độ biểu hiện của Cyclin D1 có trong mẫu Điều này rất quan trọng trong việc nghiên cứu quá trình chu kỳ tế bào, bởi Cyclin D1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình này