Thiết bị và kỹ thuât cnsh

Tổng quan kỹ thuật LAMPLAMP Loop Mediated Isothermal Amplification: Là một phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng khu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT LAMP TRONG XÉT NGHIỆM VÀ XỬ LÝ BỆNH ĐỐM TRẮNG

Giảng viên hướng dẫn: TS Huỳnh Văn Biết

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Mai Phương 21126474

Phạm Thị Thu Thủy 21126532 Lê Thị Ngọc Thi 21126195

Lớp: DH21SM

Thủ Đức, tháng 10/2023

CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT LAMP CHUẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM.112 Bệnh đốm trắng do virus WSSV gây ra trên tôm: 11

2.1 Virus WSSV: 11

2.1.1 Biểu hiện: 11

2.1.2 Nguyên nhân: 11

2.3 Kỹ thuật lamp trong xét nghiệm và chuẩn đoán bệnh tôm: 12

2.3.1 Chuẩn bị virus và DNA mẫu của virus: 12

2.3.2 Thiết kế đoạn mồi: 13

2.3.3 Phát hiện WSSV trong mô tôm bằng LAMP: 14

2.3.4 Kết quả: 14

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 17

2

Danh mục hình ảnh:

Hình 1: Vùng đích của DNA: ba vùng đích “xuôi” (F1, F2, F3) cùng ba vùng đích

“ngược” (B1, B2, B3) và các vùng bổ sung của chúng trên sợi đối diện 5

Hình 2: Tách hai sợi DNA đích bằng cách biến tính 6

Hình 3: F3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết FIP 6

Hình 4: F3 Primer tách sợi mới được hình thành do hoạt động của FIP trong khi nó tổng hợp DNA bổ sung 7

Hình 5: BIP liên kết với sợi mới được giải phóng tại vùng B2c Tổng hợp DNA bổ sung (theo hướng 3 ‘đến 5’) 7

Hình 6 :B3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết BIP (hướng 3’-5’).

Hình 10: Các vòng tổng hợp liên tục dẫn đến sản xuất số lượng lớn DNA, chứa nhiều lần lặp lại trình tự mục tiêu ban đầu 9

Hình 11: Liên kết BIP và sự tổng hợp tiếp tục diễn ra 9

Hình 12: Bệnh đốm trắng trên tôm sú 12

Hình 13: Máy siêu ly tâm Optima L (Beckman) 13

Hình 14: Roto SW 40 Ti 13

Hình 15: ảnh điện di ở các nhiệt độ và thời gian thích hợp của kỹ thuật LAMP 15

Hình 16: Phát hiện WSSV-DNA bằng kỹ thuật LAMP 15

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN KỸ THUẬT LAMP1.Tổng quan:

1.1 Tổng quan kỹ thuật LAMP

LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification): Là một phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng khuếch đại một lượng lớn DNA từ sợi đôi và tự quay vòng trong điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc (loop) được thực hiện bởi một DNA polymerase đặc biệt có hoạt tính tách mạch và ít nhất hai cặp mồi đặc hiệu để nhận biết sáu trình tự khác nhau trên gen mục tiêu Phương pháp này có hiệu quả khuyếch đại cao khoảng 109-1010

lần trong 15-60 phút.

LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm DNA vòng mới được tạo ra và mới phát hiện được Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm DNA vòng sẽ không được tạo ra Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa của phản ứng tạo muối

pyrophotphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm.

1.1.1 Đặc điểm:

 Không cần bước làm tách mạch đôi thành dạng mạch đơn.

 Cả phản ứng khuếch đại xảy ra liên tục dưới điều kiện đẳng nhiệt  Hiệu quả khuếch đại rất cao.

 Thiết kế 4 primers nhận ra 6 đoạn riêng biệt, phương pháp LAMP có thể khuếch đại đặc hiệu đoạn gen quan tâm.

 Tổng giá thành có thể được giảm vì LAMP không đòi hỏi hóa chất đặc biệt và thiết bị phức tạp.

4

1.1.2 Thiết kế Primers:

LAMP sử dụng 4 primers chính “core” để thực hiện quá trình nhân bản và 2 primers phụ “loop” để xúc tác cho quá trình phản ứng Các primer chính chứa 2 vùng trình tự đảo ngược và bổ sung lẫn nhau Trong quá trình phản ứng, các primers này giúp hình thành cấu trúc loop cả 2 đầu cuối của vùng DNA mục tiêu, để hình thành cấu trúc “dumbbell” Cấu trúc này tạo điều kiện để enzyme DNA polymerase có khả năng thay thế tại các điểm primer (priming point), nhân bản lũy thừa các tác nhân đích một cách nhanh chóng Trong khi 4 primers đóng vai trò chính trong LAMP; 2 primer loop còn lại là tùy chọn; chúng có vai trò trong việc tăng tốc phản ứng nhân bản, và giúp phát hiện tín hiệu nhanh bản nhanh chóng hơn, giúp tăng độ nhạy của phản ứng.

1.2 Nguyên lý kỹ thuật LAMP:1.2.1 Nguyên liệu:

 Gene mục tiêu

 Bst DNA polymerase  Các cặp mồi

Có 4 loại LAMP (cặp mồi) được dùng để nhận diện 6 khu vực riêng biệt của các gen mục tiêu khác nhau Bốn loại cặp mồi bao gồm:

 FIP (Forward Inner Primer): Gồm 2 phần: vùng F2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho F2c và được nối với vùng F1c ở đầu 5’.

 BIP (Backward Inner Primer): Gồm 2 phần: vùng B2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho B2c được nối với vùng B1c ở đầu 5’.

 F3 (Forward Outer Primer): Chứa vùng F3, là trình tự bổ sung cho vùng F3c  B3 (Backward Outer Primer): Chứa vùng B3, là trình tự bổ sung cho vùng B3c.

5

1.2.2 Quy trình thực hiện: Quá trình nhân bản DNA

FIP liên kết với vùng F2c.

Polymerase di chuyển dọc theo sợi (theo hướng 3 ‘đến 5‘) thêm các bazơ bổ sung.

Hình 1: Vùng đích của DNA: ba vùng đích “xuôi” (F1, F2, F3) cùng ba vùng đích “ngược”

(B1, B2, B3) và các vùng bổ sung của chúng trên sợi đối diện.

Hình 2: Tách hai sợi DNA đích bằng cách biến tính.

Hình 3: F3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết FIP.

Hình 4: F3 Primer tách sợi mới được hình thành do hoạt động của FIP trong khi nó tổng

hợp DNA bổ sung.

Hình 5: BIP liên kết với sợi mới được giải phóng tại vùng B2c Tổng hợp DNA bổ sung (theo

hướng 3 ‘đến 5’).

Hình 6 :B3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết BIP (hướng 3’-5’).

Hình 8: Các vùng F1/F1c và B1/B1c hiện đã liên kết với nhau tạo hình “quả tạ” với hai

vùng vòng lặp.

Hình 7: Liên kết FIP tại vùng F2c và tự mồi ở vùng F1 / F1c dẫn đến tổng hợp thêm các đoạn

mới.

.2.3 Sản phẩm của phản ứng LAMP:

Kết tủa magnesium pyrophosphate màu trắng đục có thể thấy bằng mắt thường và định lượng bằng việc chuẩn hóa thành phần MgSO4 để tính lượng ion Mg+2 Điện di trên gel agarose bằng thuốc nhuộm E.Bromide hay SYBR Green Gắn huỳnh quang và cũng giống như phương pháp PCR định lượng (real-time PCR) dựa vào hàm lượng phát quang (fluorescence) sinh ra tương ứng với sản phẩm có từ khuôn.

1.3 Ưu điểm kỹ thuật LAMP đối với PCR:

 LAMP là một phương pháp khuếch đại DNA mới, có độ đặc hiệu cao bằng cách tận dụng ưu điểm của Bst Polymerase và một bộ 4 mồi được thiết kế đặc biệt để

Hình 11: Liên kết BIP và sự tổng hợp tiếp tục diễn ra.

Hình 10: Các vòng tổng hợp liên tục dẫn đến sản xuất số lượng lớn DNA, chứa nhiều lần lặp

lại trình tự mục tiêu ban đầu.

nhận từ 2 – 6 trình tự cách xa nhau trên gen đích, do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng

 Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5 – 3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1 – 1,5 giờ Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chuẩn đoán và xác định bệnh nhanh ở động vật, đặc biệt là trên người.

 Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV

 Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt Hơn thế nữa, hệ thồng này không cần đến năng lượng điện (vỉ có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt) Do đó, có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng.

1.4 Ứng dụng:

LAMP đã được biết đến nhiều hơn và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:

 Lĩnh vực chẩn đoán: LAMP được ứng dụng trong việc vận chuyển mẫu đến phòng lab chuyên sâu tốn kém và xa xôi hay bị hạn chế về thời gian trả kết quả.

 Ngành nông nghiệp: Các virus gây bệnh lý ở thực vật có thể phát tán mầm bệnh sang cây trồng LAMP được ứng dụng để chẩn đoán các bệnh lý từ mẫu lá cây một cách nhanh chóng và tiết kiệm.

 Khoanh vùng dịch tễ truyền nhiễm: Sử dụng LAMP để chẩn đoán nhanh hơn các bệnh truyền nhiễm nhiệt đới, phát hiện các vector truyền bệnh như bọ chét, muỗi…

 Ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh:

Bệnh Đốm Trắng trên tôm do WSSV và một số virus gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

Bệnh vàng lá cà chua.

9

Herpes Simplex Virus H5 avian influenza.

Shigella và E.Coli gây bệnh đường ruột.

10

CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT LAMP CHUẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM2 Bệnh đốm trắng do virus WSSV gây ra trên tôm:

2.1 Virus WSSV:

Bệnh đốm trắng do virus (White Spot Syndrome Virus - WSSV) là một trong các bệnh gây nên hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt trong các vùng nuôi tôm tại các địa phương ven biển ở nước ta từ nhiều năm qua.

2.1.1 Biểu hiện:

Khi nhiễm virus tôm có biểu hiện hoạt động kém, ăn nhiều đột ngột sau đó bỏ ăn, bơi lờ đờ ở mặt nước hay dạt vào bờ Quan sát vỏ tôm có nhiều đốm trắng ở giáp đầu ngực, đốt bụng thứ 5, 6 và lan toàn thân, đôi khi tôm cũng có dấu hiệu đỏ thân Khi các đốm trắng xuất hiện, sau 3 – 10 ngày tôm chết hàng loạt với tỉ lệ chết cao và nhanh.

2.1.2 Nguyên nhân:

Bệnh do virus đốm trắng -White Spot Syndrome Virus (WSSV), tăng sinh trong nhân tế bào Virus đốm trắng (WSSV) lây nhiễm trên nhiều loài giáp xác ( nước ngọt, nước lợ và nước mặn) theo chiều ngang ( qua môi trường nước và ăn vật nhiễm bệnh tại ao nuôi) và chiều dọc( từ tôm mẹ nhiễm bệnh sang tôm con trong các trại sản xuất giống) WSSV không lây từ mẹ sang trứng do trứng sẽ không chín khi bị nhiễm virus này Tuy nhiên tôm mẹ thải virus đốm trắng trong môi trường nước và lây nhiễm cho ấu trùng Tất cả các giai đoạn phát triển của tôm đều có thể nhiễm bệnh.

11

Tôm hoang dã là vật mang WSSV, đặc biệt ở các vùng nước ven biển gần khu nuôi tôm của cả các nước Châu Á, nhưng tỷ lệ chết trên tôm hoang dã vẫn chưa được quan sát.

2.3 Kỹ thuật lamp trong xét nghiệm và chuẩn đoán bệnh tôm:2.3.1 Chuẩn bị virus và DNA mẫu của virus:

Các virion (toàn bộ hạt virus truyền nhiễm) WSSV được cô đặc từ dịch tan máu của tôm Kuruma bị nhiễm bệnh nhân tạo sử dụng gradient mật độ liên tục sucrose đã được báo cáo trước đây Tóm lại, lượng máu tan được gộp lại và phân loại-ly tâm ở mức 3000×g trong 10 phút Phần nổi phía trên được lọc qua màng 0,45 m Dịch lọc được lọc siêu ly tâm trong rôto SW 40 Ti trong máy siêu ly tâm Optima L (Beckman) ở mức 100.000 × g trong 1 giờ ở 4 ◦C Sau đó, viên này được ngâm trong một lượng nhỏ dung dịch đệm TE (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ở 4◦C qua đêm Dải virus đã được thu hoạch bằng pipet Pasteur Các virion được rửa bằng dung dịch đệm TE bằng siêu ly tâm ở tốc độ 100.000 × g trong 1 giờ ở 4◦C Viên WSSV được đông lạnh và giữ ở nhiệt độ -80◦C Việc tách DNA từ virus được thực hiện bằng phương pháp chiết nhiệt, sau khi đun nóng

Hình 12: Bệnh đốm trắng trên tôm sú

trong 5 phút ở 95◦C, ly tâm được thực hiện ở 10.600 × g trong 5 phút ở 4◦C Chất nổi phía trên được sử dụng làm DNA mẫu cho mỗi thí nghiệm.

-Lượng máu tan sau đó sẽ được phân loại bằng máy ly tâm ở điều kiện thích hợp.

-Và sản phẩm cuối cùng viên WSSV sẽ được rửa bằng dung dịch đệm TE và được đông lạnh và giữ ở nhiệt dộ -80◦C.

-Tách DNA bằng phương pháp chiết nhiệt Chất nổi phía trên được sử dụng làm DNA mẫu cho mỗi thí nghiệm.

2.3.2 Thiết kế đoạn mồi:

Dựa trên trình tự bộ gen của virus đốm trắng WSSV-DNA đã thiết kế bốn mồi sử dụng Phần mềm Primer Explorer Mồi xuôi bên trong của WSSV (WSSV-FIP) bao gồm trình tự bổ sung (20 nt) của F1, trình liên kết TTTT và F2 (19 nt): 5’-GGGTCGTC

GAATGTTGCCCA-TTTT-GCCTACGCACCAATCTGTG-3’ Lớp mồi ngược bên trong cho WSSV (WSSV-BIP) bao gồm B1c (22 nt), trình liên kết TTTT và phần bổ sung chuỗi

Hình 14: Roto SW 40 TiHình 13: Máy siêu ly tâm Optima L(Beckman)

B2c (20 nt): 5’-AAAGGACAATCCCTCTCCT

GCG-TTTT-AGAACGGAAGAAACTGCCTT-3’ Hai đoạn mồi xuôi và ngược bên ngoài F3 và B3 đối với WSSV (WSSV-F3 và -B3) là ACGGAGGACCCAAATCGA-3’ và

-Mồi xuôi bên ngoài WSSV-F3: 5’-ACGGAGGACCCAAATCGA-3’-Mồi ngược bên ngoài WSSV-B3: 5’-GCCTCTGCAACATCC TTTCC-3’

Hình ảnh:Thiết kế 4 đoạn mồi dựa theo 6 đoạn riêng biệt trên đoạn gen WSSV2.3.3 Phát hiện WSSV trong mô tôm bằng LAMP:

Tách chiết DNA từ mô tôm (tim, dạ dày) và cơ quan bạch huyết bị nhiễm WSSV một cách nhân tạo đã được thực hiện bằng phương pháp chiết nhiệt (Phần 2.1) và bộ chiết

14

DNA theo tiêu chuẩn hướng dẫn của nhà sản xuất LAMP được thực hiện bằng cách sử dụng điều kiện xác định như trên.Sản phẩm được điện di và phân tích ở nồng độ 2% trên gel agarose và nhuộm bằng ethidium bromide.

2.3.4 Kết quả:

LAMP được thực hiện bằng cách sử dụng WSSV-DNA làm mẫu để xác định nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu Sản phẩm được hình thành ở cả 63 và 65◦C Tuy nhiên, 65◦C được sử dụng làm nhiệt độ tối ưu vì nhiệt độ cao hơn sẽ làm tăng độ đặc hiệu của phát hiện (Hình 2A) Không tìm thấy sự khuếch đại của sản phẩm trong thời gian phản ứng 15 và 30 phút Tuy nhiên, ở mức khuếch đại 45 và khuếch đại 60 ở phút 65◦C, nhiều dải có kích cỡ khác nhau từ khoảng 200 bp đến giếng nạp đã được tạo ra (Hình 2 B) Mặc dù có thể phát hiện được hình dạng tốt các dải ở 45 phút, các điều kiện được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65◦C.

Hình 15: ảnh điện di ở các nhiệt độ và thời gian thích hợp của kỹ thuật LAMP.

15

Chú thích: Xác định các điều kiện thích hợp của kỹ thuật LAMP (Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến lượng sản phẩm LAMP.) (A) Nhiệt độ: làn 1 là điểm đánh dấu kích thước phân tử; làn 2–4, được thực hiện lần lượt ở 60, 63 và 65◦C (B) Thời gian: làn 1, chất đánh dấu phân tử; làn 2–5, LAMP thực hiện lần lượt trong 15, 30, 45 và 60 phút Tất

cả sản phẩm đều được điện di trên gel agarose 2% và nhuộm với ethidium bromide.

Chú thích: Phát hiện WSSV-DNA bằng LAMP và PCR lồng nhau từ tim tôm khỏe mạnh

(âm tính) và nhiễm WSSV (dương tính): (A) sản phẩm LAMP Ngõ 1: điểm đánh dấu kích thước phân tử (thang chuẩn 100 bp); lần 1 và 2: Tôm nhiễm WSSV; lần 3 và 4: tôm khỏe mạnh Tất cả các sản phẩm đều được điện di trên gel agarose 2% và nhuộm bằng ethidium bromide trong 60 phút ở 65◦C.

Hình 16: Phát hiện WSSV-DNA bằng kỹ thuật LAMP.

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN

Hội chứng đốm trắng gây thiệt hại nghiêm trọng cho tôm, dẫn đến thiệt hại kinh tế nặng nề Sự hiện diện của virus trong đàn bố mẹ hoang dã của M japonicus và P monodon đã được báo cáo từ các khu vực châu Á như Nhật Bản, Đài Loan.Sự hiện diện của virus ở nhiều loài giáp xác hoang dã cũng đã được báo cáo Các phương pháp phát hiện khác nhau có được phát triển để giám sát và kiểm soát WSSV trong nuôi tôm Phương pháp chẩn đoán tôm bao gồm các phương pháp truyền thống chẩn đoán bệnh và các phương pháp đã được thiết lập ở cá và động vật có vú Một phương pháp mới được gọi là LAMP được sử dụng làm kỹ thuật phát hiện WSSV ở tôm nuôi LAMP là một phương pháp nhạy cảm có thể khuếch đại một số bản sao của DNA tới cường độ 109 CFU trong vòng chưa đầy 1h ở điều kiện đẳng nhiệt phương pháp này là hứa hẹn chẩn đoán nhanh trong trường hợp nhiễm WSSV Trong nghiên cứu này, quy trình chẩn đoán LAMP được mô tả để phát hiện WSSV trên tôm Hai cặp mồi được sử dụng có thể khuếch đại chuỗi 235 bp từ DNA bộ gen của WSSV Điều kiện tối ưu cho phản ứng phát hiện WSSV-DNA được xác định ở 65◦C trong 60 phút Tuy nhiên, chúng tôi đã chỉ ra rằng có thể phát hiện trong vòng 45 phút ở 65◦C Những gợi ý việc phát hiện WSSV có thể thực hiện được trong thời gian rất ngắn (<60 phút) Phương pháp LAMP được sử dụng để phát hiện WSSV có hiệu quả cao nhạy cảm, vì nó phát hiện mẫu WSSV-DNA thấp tới 1 fg Độ nhạy tăng gấp 10 lần được thấy trong LAMP, so với đến PCR hai chu kì trong đó giới hạn phát hiện là 10 fg Các báo cáo khác gợi ý rằng giới hạn phát hiện đối với WSSV-DNA bằng PCR lồng nhau là 100 fg và 1 fg Do đó, có khả năng độ nhạy của LAMP cao hơn PCR một chu kì và gần như tương đương hoặc cao hơn khi so sánh với PCR hai chu kì Tuy nhiên, Thời gian cần thiết để chẩn đoán được coi là rất quan trọng đối với quản lý trang trại và trại giống trong nuôi tôm Vì thế, Việc phát hiện WSSV dựa trên LAMP có độ nhạy cao và cũng tốc độ nhanh chóng của nó làm cho nó trở thành một công cụ hữu ích để chẩn đoán bệnh Báo cáo rằng LAMP có thể phát hiện tar get DNA virus bằng cách sử dụng mẫu chứa 100 bộ gen DNA của con người Vì vậy, chúng tôi kết luận rằng việc phát hiện WSSV bằng LAMP sử dụng DNA tách chiết bằng phương pháp đơn giản chẳng hạn như trích nhiệt từ

17