Thiết bị và kỹ thuật cnsh

KỸ THUẬT LAMP TRONG XÉT NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG WSSV TRÊN TÔMGVHD: T.S Huỳnh Văn BiếtTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCMKhoa Khoa Học Sinh Học... Kỹ thuật LAMP• Phát triể

KỸ THUẬT LAMP TRONG XÉT

NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN VIRUS

GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)

TRÊN TÔM

GVHD: T.S Huỳnh Văn Biết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

Khoa Khoa Học Sinh Học

virus WSSV gây bệnh ở

Kết Luận

Tổng quan kỹ

thuật Lamp

I

4

Kỹ thuật LAMP • Phát triển từ PCR truyền thống

• Sử dụng 4 – 6 đoạn mồi đặc hiệu

tạo cấu trúc vòng móc giúp quá trình tổng hợp DNA diễn ra liên tục trong điều kiện đẳng nhiệt.

LAMP (Loop Mediated

Isothermal Amplification)

Video về kỹ thuật LAMP 6

Điểm khác nhau LAMP và PCR

 Sự khuếch đại đặc hiệu cao vì có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng

riêng biệt trên ADN khuôn.

 Trong phương pháp LAMP lượng

ADN tổng hợp được lớn hơn gấp

nhiều lần so với PCR

 Phương pháp LAMP có thể thực

hiện khuếch đại RNA bằng cách bổ

sung thêm enzyme phiên mã ngược vào trong hỗn hợp phản ứng.

Có nên sử dụng LAMP

thay thế PCR không?

Trong các xét nghiệm chẩn đoán, LAMP cho thời gian trả kết quả nhanh, sử dụng trong các xét nghiệm định tính

Tuy nhiên, nếu xét nghiệm yêu cầu định lượng; giải pháp

real – time PCR là lựa chọn tối ưu

8

Ứng dụng của kỹ thuật LAMP

Lĩnh vực chẩn

đoán

Ngành nông nghiệp

Khoanh vùng dịch tễ truyền

nhiễm

Kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán virus WSSV

gây bệnh ở tôm

II

virus gây ra, thường gặp ở các loài thuộc Họ Tôm he

Bệnh có khả năng lây lan cao và gây chết tôm một cách nhanh chóng

Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) là một loại virus

đơn độc thuộc chi Whispovirus, chi duy nhất trong họ

Nimaviridae.Chúng là nguyên nhân gây ra bệnh đốm

trắng ở hầu hết các loài động vật giáp xác.

12

Giai đoạn cận cấp tính Giai đoạn cấp tính

Tôm nhiễm bệnh chết tùy theo chất

lượng nước Tôm nuôi chết rất nhanh ( từ 80% trở lên) trong 1-5

ngày sau khi xuất hiện các dấu hiệu bệnh

Có thể thấy hoặc không thấy

đốm trắng Bơi lội lờ đờ

Tôm ít ăn Ngừng ăn

Bơi lội chậm chạp Tôm hấp hối tập trung gần mặt nước quanh bờ ao

Chết tích lũy 30-80 % Vỏ giáp đầu ngực lơi lỏng

Giai đoạn mãn tính: Ngoại ký sinh bám đầy vỏ và mang.

Tôm không chết Ruột giữa màu trắng chạy dọc theo bụng ở ấu trùng

và tôm giống nhiễm bệnh

Có thể có hay không có đốm Khi bóc tách vỏ giáp đầu ngực, soi dưới ánh sáng sẽ thấy  các đốm

DẤU HIỆU BỆNH LÝ

14

Kỹ thuật LAMP trong xét nghiệm và chẩn

đoán bệnh ở tôm

Chuẩn bị virus và DNA mẫu của

Chuẩn bị virus và DNA mẫu của

virus

Lượng máu tan sau đó sẽ

được phân loại bằng máy

ly tâm ở điều kiện thích

hợp.

Các virion (toàn bộ hạt virus

truyền nhiễm) WSSV được

cô đặc từ dịch tan máu của

tôm Kuruma bị nhiễm bệnh

nhân tạo

Sản phẩm cuối cùng viên WSSV sẽ được rửa bằng dung dịch đệm TE và được đông lạnh và giữ ở nhiệt

dộ -80◦C.

Tách DNA bằng phương pháp chiết nhiệt Chất nổi phía trên được sử dụng làm DNA mẫu cho mỗi thí

Thiết kế đoạn mồi

Mồi xuôi bên trong WSSV-FIP: 5’-GGGTCGTC

Phát hiện WSSV trong

mô tôm bằng LAMP

• Tách chiết DNA từ mô tôm

(tim, dạ dày) và cơ quan bạch

Kết quả

Phát hiện WSSV-DNA bằng LAMP từ

tim tôm khỏe mạnh (âm tính) và

nhiễm WSSV (dương tính)Tất cả các

sản phẩm đều được điện di trên gel

agarose 2% và nhuộm bằng ethidium

bromide trong 60 phút ở 65 ◦C

Kết Luận

III

22

 LAMP là phương pháp hứa

hẹn chẩn đoán nhanh trong trường hợp nhiễm WSSV

 Lamp thường xuyên để

kiểm tra tôm trong trại giống và ao nuôi thương phẩm để có thể tìm thấy tôm mang virus trong

Kết

Luận

Phòng

ngừa

Phòng ngừa bằng cách hạn chế các nguồn nguyên nhân gây bệnh

sau

Hiện tại chưa có biện

pháp nào hiệu quả để

điều trị WSSV Chỉ có

thể duy trì kiểm soát

môi trường ao nuôi tốt

để giảm virus WSSV xuất

hiện trong ao nuôi

Tài liệu tham khảo

• “Dấu hiệu của bệnh đốm trắng ở tôm sú và cách phòng tránh -

điều trịbacsinhanong.com Bác Sĩ Nhà Nông” Retrieved October

21, 2023, from

https://bacsinhanong.com/dau-hieu-cua-benh-dom-trang-o-tom-s

u-va-cach-phong-tranh-dieu-tri/

• Tổng quan về kỹ thuật Loop-mediated Isothermal Amplification

(LAMP) – CÔNG TY TNHH KHOA HỌC NKTBIO (2022, December

19) CÔNG TY TNHH KHOA HỌC NKTBIO Retrieved October 21,

2023, from

https://nktbioscience.com/tong-quan-ve-ky-thuat-loop-mediated-is

othermal-amplification-lamp/

• Tomoya Kono; Ram Savan; Masahiro Sakai; Toshiaki Itami (2004)

Detection of white spot syndrome virus in shrimp by

loop-mediated isothermal amplification , 115(1), 59–65

26