Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chuẩn đoán bệnh lao Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic ngày càng được sử dụng để phát hiện nhanh bệnh lao, đặc biệt là PCR định lượng dựa trên huỳnh quan
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis Môn học : Thiết bị và kỹ thuật trong CNSH Tp Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện TS HUỲNH VĂN BIẾT MAI CÔNG THÀNH Th.S TRƯƠNG QUANG TOẢN TRƯỢNG HOÀNG MINH YẾN LƯU NGUYỄN TỨ ANH Tp Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023 DANH SÁCH NHÓM STT Họ và tên Mssv Tỉ lệ hoàn thành 21126500 100% 1 Mai Công Thành 21126343 100% 21126274 100% 2 Trượng Hoàng Minh Yến 3 Lưu Nguyễn Tứ Anh i MỤC LỤC Trang DANH SÁCH NHÓM i MỤC LỤC ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Muc tiêu 1 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1 Giới thiệu về bệnh lao 2 2.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB) 2 2.1.2 Thực trạng bệnh lao trên toàn thế giới 3 2.2 Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chẩn đoán bệnh lao 4 2.3 Droplet Digital PCR (ddPCR) 4 2.3.1 Droplet Digital PCR – ddPCR là gì? 5 2.3.2 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR 5 2.3.2.1 Nguyên lí cấu tạo 5 2.3.2.2 Nguyên lí hoạt động 5 2.3.3 Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR) 7 CHƯƠNG 3 ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria tuberculos 9 3.1 Định lượng Mycobacterrium tuberculosis .9 3.2 Chuẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV 9 3.3 Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau 10 3.4 Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn 10 3.5 Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae 11 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN .12 TÀI LIỆU THAM KHẢO .13 ii ddPCR DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT PCR TB : Droplet Digital PCR MTB : Polymerase Chain Reaction LTBI : Tuberculosis WHO : Mycobacteria tuberculosis HIV : Latent TB infection RT-PCR : World Health Organization DNA : Human Immuno-deficiency Virus RNA : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction qPCR : Deoxyribonucleic acid gyrB : Acid ibonucleic LAM : Real-time Polymerase Chain Reaction FFPE : Gyrase subunit B IGRA : Lipoarabinomannan PB : Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue : Interferon-Gamma Release Assays : Paucibacillar iii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lao phổi xảy ra khi vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M tuberculosis) trực tiếp tấn công phổi và phá hủy các mô tế bào của cơ quan này Đây là một căn bệnh đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe con người và giết chết gần hai triệu người mỗi năm Tuy nhiên, các công nghệ chẩn đoán và xét nghiệm độ nhạy hiện có còn tốn nhiều thời gian và do đó khó đạt được mục tiêu chẩn đoán sớm và phát hiện độ nhạy cảm của thuốc Qua đó sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử đã khắc phục được những hạn chế về thời gian và độ nhạy thấp của phương pháp nhuộm và nuôi cấy nhanh axit để chẩn đoán bệnh lao, do đó có thể dần dần đạt được chẩn đoán bệnh lao nhanh chóng và chính xác Các công cụ chẩn đoán tiên tiến với độ đặc hiệu, độ nhạy và tự động hóa cao hơn đang được phát triển Bài viết này giới thiệu một kỹ thuật chẩn đoán phân tử mới, Droplet Digital PCR (ddPCR) và ứng dụng của nó trong bệnh lao, với hy vọng khơi dậy những ý tưởng mới trong phòng ngừa và điều trị bệnh lao 1.2 Mục tiêu Dùng sinh học phân tử nhằm định lượng, chuẩn đoán sớm và phát hiện ra vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M tuberculosis) là nguyên nhân chính gây ra bệnh lao (hay còn gọi là Lao phổi) bằng phương pháp Droplet Digital PCR là phương pháp định lượng acid nucleoic với độ nhạy cao và không cần đường chuẩn 1 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh lao Hình 2.1 Đường lây truyền chủ yếu của bệnh lao Bệnh lao (TB), do nhiễm Mycobacteria tuberculosis (MTB), thường ảnh hưởng đến phổi nhất nhưng vi khuẩn lao có thể tấn công bất kỳ bộ phận nào của cơ thể như thận, cột sống và não Không phải ai bị nhiễm vi khuẩn lao cũng bị bệnh Kết quả là tồn tại hai tình trạng liên quan đến bệnh lao: nhiễm lao tiềm ẩn (LTBI) và bệnh lao, là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đe dọa sức khỏe cộng đồng trong nhiều năm Bệnh lao lây lan qua không khí khi người mắc bệnh lao phổi ho, hắt hơi hoặc khạc nhổ Một người chỉ cần hít phải một vài vi trùng là có thể bị nhiễm bệnh 2.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB) Mycobacteria bệnh lao (MTB), còn được gọi là trực khuẩn Koch, là một loài vi khuẩn gây bệnh thuộc họ Mycobacteriaceae và là tác nhân gây bệnh lao Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1882 bởi Robert Koch, Mycobacteria bệnh lao có một lớp phủ sáp bất thường trên bề mặt tế bào của nó chủ yếu là do sự hiện diện của axit mycolic Lớp phủ này làm cho tế bào không bị nhiễm vi khuẩn Gram và kết quả là MTB có thể có biểu hiện Gram dương yếu 2 Hình 2.2 Vi Khuẩn Mycobacteria tuberculosis Mycobacterium Tuberculosis là một trực khuẩn dài từ 3 - 5 μm, hai đầu tròn, không có lông và có đặc điểm là kháng cồn kháng acid (không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của thuốc nhuộm Fuchsin) Khả năng tồn tại trong điều kiện tự nhiên của Vi khuẩn trong khoảng 3 - 4 tháng Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao có thể ngừng phát triển, ở 100oC vi khuẩn sẽ chết sau 10 phút và bị tiêu diệt bởi cồn 90o 2.1.2 Thực trạng của bệnh lao trên toàn thế giới Khoảng một phần ba dân số thế giới bị nhiễm MTB Khoảng 8 triệu ca nhiễm mới và 2 triệu ca tử vong do bệnh lao xảy ra hàng năm Năm 2013, ước tính có khoảng 9 triệu ca mắc và 1,5 triệu ca tử vong trên toàn thế giới Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và 194 quốc gia thành viên Liên Hợp Quốc đã thông qua chiến lược của WHO nhằm chấm dứt bệnh lao tại Đại hội đồng Y tế Thế giới năm 2014, nhằm giảm 95% số ca tử vong do bệnh lao và giảm tỷ lệ mắc mới của bệnh lao Tỷ lệ chẩn đoán bệnh lao là 90% trong khoảng thời gian từ 2015 đến 2035 Theo Báo cáo bệnh lao toàn cầu năm 2020 của WHO, có gần 10 triệu bệnh nhân lao mới và 2 tỷ bệnh nhân lao tiềm ẩn trên toàn thế giới vào năm 2019 Những người bị nhiễm vi khuẩn lao có nguy cơ mắc bệnh lao từ 5–10% trong đời Những người có hệ thống miễn dịch bị tổn hại, chẳng hạn như người nhiễm HIV, suy dinh dưỡng hoặc tiểu đường, hoặc những người sử dụng thuốc lá, có nguy cơ mắc bệnh cao hơn, 3 1,3 triệu ca tử vong ở những người âm tính với HIV (phạm vi, 1,2 triệu-1,5 triệu) và 0,38 triệu ca tử vong ở những người dương tính với HIV (phạm vi, 0,32 triệu-0,45 triệu) 2.2 Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chuẩn đoán bệnh lao Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic ngày càng được sử dụng để phát hiện nhanh bệnh lao, đặc biệt là PCR định lượng dựa trên huỳnh quang thời gian thực (real-time PCR), vì đây có thể là phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy Kết quả RT-PCR cũng được sử dụng như một yếu tố xác nhận có giá trị khi quyết định nên tiếp tục hay bỏ điều trị chống lao Mặc dù RT-PCR vẫn là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic nhưng nó không phù hợp để phát hiện những khác biệt nhỏ Hơn nữa, việc định lượng RT-PCR nhìn chung không chính xác vì nó phụ thuộc vào việc so sánh các mẫu chưa biết với đường cong chuẩn Do đó dùng một công nghệ mới nổi được gọi là Droplet Digital PCR (ddPCR) là một giải pháp thay thế tiềm năng cho RT-PCR thông thường để phát hiện vi sinh vật 2.3 Droplet Digital PCR (ddPCR) Hình 2.3 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR 4 2.3.1 Droplet Digital PCR – ddPCR là gì? Droplet Digital PCR (ddPCR) là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử để định lượng và phân tích các mẫu DNA hoặc RNA Đây là phương pháp PCR dựa trên phân vùng, kỹ thuật số, chia mẫu thành hàng nghìn giọt có kích thước nanolit, mỗi giọt chứa một số lượng nhỏ phân tử mục tiêu Sự khuếch đại của các phân tử mục tiêu xảy ra trong mỗi giọt, cho phép định lượng tuyệt đối các phân tử mục tiêu có trong mẫu ban đầu ddPCR thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền, chẩn đoán và y học chính xác 2.3.2 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR 2.3.2.1 Nguyên lí cấu tạo Máy QX100™ ddPCR bao gồm một phần mô-đun ngưng tụ, phần mô-đun nạp mẫu và phần mô-đun đọc kết quả Phần mô-đun ngưng tụ: Đây là phần điều khiển chính của máy và chứa tất cả các thiết bị điều khiển và cảm biến Nó kiểm soát quá trình polymerase chain reaction (PCR) danh định và tạo ra điều kiện để tạo ra các giọt digital (ddPCR) theo kỹ thuật tạo giọt Phần mô-đun nạp mẫu: Phần này chứa các ống nạp mẫu và bảng điều khiển đóng/mở van tự động Nó cho phép người dùng nạp mẫu DNA hoặc RNA cùng với các primers, enzym và fluorophore vào hệ thống Phần mô-đun đọc kết quả: Đây là phần thu nhận tín hiệu quang phổ từ các giọt digital Nó sử dụng một laser cho phép phân loại các giọt dựa trên sự hiện diện và mức độ fluorescence Kết quả được đưa ra dưới dạng một biểu đồ sốt nhiệt digital cho biết số giọt tích cực và số giọt âm tính, từ đó xác định mật độ của các tín hiệu gen trong mẫu 2.3.2.2 Nguyên lí hoạt động Bước 1: Chuẩn bị mẫu 5 Kết hợp mẫu DNA, mồi và đầu dò với supermix Bio-Rad ddPCR để tạo ra tám mẫu đã chuẩn bị Nạp 20 l mẫu đã chuẩn bị vào các giếng lẻ của hộp tạo giọt nhỏ dùng 1 lần tám kênh Bước 2: Tạo vi giọt Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là Droplet Generator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng 1 nL Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như trên và trở thành 1 phản ứng nhỏ Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này Bước 3: Thực hiện PCR Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy PCR thông thường Thực hiện PCR đến điểm cuối (40 chu kỳ) bằng máy quay vòng nhiệt, DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được phân bố vào vi giọt Bước 4: Đọc giọt Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer Từng vi giọt 6 trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại và bằng phát hiện quang học hai màu để xác định giọt nào chứa mục tiêu (+) và giọt nào không chứa (-) Bước 5: Phân tích kết quả Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm ddPCR đọc các giọt dương tính và âm tính trong mỗi mẫu và vẽ biểu đồ từng giọt huỳnh quang: khoảng 1,4 triệu giọt được đọc trên mỗi đĩa 96 giếng Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm) Tổng số vi giọt âm tính (không chứa) DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng âm) 2.3.3 Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR) PCR kỹ thuật số giọt vượt qua hiệu suất của các kỹ thuật PCR kỹ thuật số trước đó bằng cách giải quyết tình trạng thiếu công nghệ thực tế và có thể mở rộng trước đây để triển khai PCR kỹ thuật số Việc pha loãng hàng loạt tốn nhiều công sức và có thể xảy ra lỗi khi sử dụng pipet; các hệ thống dựa trên chip cạnh tranh dựa vào sơ đồ chất lỏng phức tạp để phân vùng PCR kỹ thuật số giọt giải quyết những thiếu sót này bằng cách phân chia hàng loạt mẫu trong pha lỏng trong một bước Việc tạo ra hàng chục nghìn giọt có nghĩa là một 7 mẫu có thể tạo ra hàng chục nghìn điểm dữ liệu thay vì một kết quả duy nhất, mang sức mạnh của phân tích thống kê vốn có của PCR kỹ thuật số vào ứng dụng thực tế Hệ thống PCR kỹ thuật số giọt dịch của Bio-Rad tự động hóa quy trình làm việc ddPCR bao gồm tạo giọt dịch, chu trình nhiệt, đọc giọt dịch và phân tích dữ liệu, giúp phòng thí nghiệm nghiên cứu đang làm việc có thể tiếp cận công nghệ này 8 CHƯƠNG 3 ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis 3.1 Định lượng Mycobacterium tuberculosis Định lượng mầm bệnh là một chỉ số tiềm năng để xác định kết quả điều trị và dự đoán tái phát, đồng thời định lượng ngày càng được đề xuất như một công cụ giúp quản lý nhiễm trùng lao Việc áp dụng ddPCR cung cấp một phương pháp mới để định lượng chính xác mầm bệnh MTB Phát hiện và định lượng thành công MTB trong huyết tương bệnh nhân lao bằng ddPCR ddPCR cũng có thể được sử dụng để định lượng các phân tử mục tiêu có bản sao thấp với độ chính xác và độ nhạy cao hơn sử dụng ddPCR để phát hiện các mục tiêu DNA đặc hiệu MTB (IS6110) trong các mẫu máu toàn phần Kết quả cho thấy ddPCR có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu MTB từ máu toàn phần Đây là lần đầu tiên ddPCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng bệnh lao, tạo cơ sở cho việc khám phá ddPCR như một xét nghiệm chẩn đoán phân tử định lượng đối với các bệnh truyền nhiễm Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu còn áp dụng ddPCR vào chẩn đoán bệnh nhân lao trẻ sơ sinh Họ phát hiện ra rằng ddPCR cũng cho thấy ưu điểm về định lượng tuyệt đối và độ nhạy cao trong các mẫu máu toàn phần từ những trẻ sơ sinh không có các triệu chứng hô hấp sớm và khó lấy được đờm 3.2 Chẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV Sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong huyết tương của bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch nặng Phương pháp nhuộm nhanh axit cũng như qPCR của các mẫu đờm, máu và nước tiểu của bệnh nhân này đều không phát hiện thấy sự hiện diện của MTB, trong khi kết quả ddPCR cho thấy sự khuếch đại dương tính của các trình tự đặc hiệu MTB (IS6110 và gyrB) Sự hiện diện của nhiễm trùng MTB lan tỏa đã được xác nhận ở bệnh nhân khi khám nghiệm tử thi sau đó Đồng nhiễm MTB với virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) chiếm 8,2% số ca mắc lao mới và là nguyên nhân gây tử vong phổ biến nhất do bệnh lao Vì nhiều lý do khác nhau, mẫu đờm của bệnh nhân có thể không có hoặc mẫu đờm âm tính, dẫn đến 9 việc chẩn đoán bệnh lao không hiệu quả và kịp thời Mặc dù việc phát hiện lipoarabinomannan (LAM) trong nước tiểu đã được áp dụng trong chẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân HIV nhưng các bộ dụng cụ thương mại hiện tại vẫn thiếu độ nhạy 3.3 Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau Có thể sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu máu toàn phần, các nghiên cứu về việc sử dụng ddPCR cho một loạt nghiên cứu điều tra việc phát hiện MTB trong các mẫu bệnh lý, exosome và các mẫu vật khác đã được phát triển Các nhà khoa học đã cung cấp một phương pháp mới để phát hiện trình tự cụ thể MTB trong exosome (IS6110) bằng ddPCR Họ đã sử dụng ddPCR để phát hiện 190 mẫu đường hô hấp từ những bệnh nhân nghi mắc bệnh lao So với nuôi cấy, ddPCR cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn, và xét nghiệm ddPCR sử dụng exoDNA có độ nhạy cao hơn tổng số DNA ddPCR còn được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu của MTB (IS6110) trong 65 mẫu bệnh lý và đánh giá độ nhạy của ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu được cố định bằng formalin và nhúng parafin (FFPE) Trong số 65 mẫu, 45 mẫu được xác định là bệnh nhân có khả năng mắc bệnh lao (giá trị Ct nằm trong khoảng từ 37 đến 40) bằng cách sử dụng qPCR ddPCR đã cải thiện tỷ lệ dương tính của bệnh nhân lao có thể xảy ra lên 57,8%, điều này cho thấy độ nhạy cao hơn của ddPCR trong việc phát hiện MTB trong các mẫu FFPE 3.4 Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn Việc chứa MTB trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi CD34 + giúp khắc phục các điều kiện bất lợi, bao gồm tình trạng thiếu oxy, tấn công miễn dịch và điều trị bằng thuốc, do đó cho phép hiện diện lâu dài trong vật chủ Các tế bào gốc tạo máu mang glycoprotein CD34 làm chất đánh dấu bề mặt có thể đại diện cho các hốc sinh thái của MTB trong quá trình nhiễm lao tiềm ẩn và việc phát hiện sự hiện diện của MTB trong các tế bào này có thể cung cấp thông tin có giá trị cho việc chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn Các nhà khoa học đã sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong tế bào CD34 + đơn nhân máu ngoại vi từ những người trưởng thành không có triệu chứng có kết quả xét nghiệm dương tính với IGRA Điều này cho thấy việc phát hiện DNA MTB trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi có tiềm năng ứng 10 dụng trong chẩn đoán, theo dõi và điều trị dự phòng nhiễm lao tiềm ẩn Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải phân lập từng tế bào có nhân riêng lẻ, điều này rất phức tạp và hạn chế ứng dụng lâm sàng 3.5 Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae Ứng dụng ddPCR trong chẩn đoán nhiễm Mycobacteria leprae cũng đã được nghiên cứu Các nhà khoa học đã phát triển phương pháp phát hiện ddPCR để chẩn đoán bệnh phong bằng cách sử dụng qPCR và ddPCR để phát hiện hai mục tiêu DNA nhạy cảm (RLEP và GroEL) của trực khuẩn bệnh phong và sau đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Họ nhận thấy độ nhạy của ddPCR cao hơn so với qPCR trong việc phát hiện Mycobacteria leprae trong các mẫu sinh thiết da có lượng vi khuẩn ít trực khuẩn (PB) từ bệnh nhân (79,5% so với 36,4%) 11 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN Sự kết hợp giữa công nghệ vi lỏng và PCR mang lại cho ddPCR những đặc tính độc đáo và ngày càng được sử dụng trong các lĩnh vực lâm sàng như bệnh truyền nhiễm, khối u, phân tích số lượng bản sao virus ddPCR là phương pháp định lượng để phát hiện axit nucleic với độ nhạy cao, độ tái lập cao và không có đường chuẩn Việc áp dụng ddPCR trong chẩn đoán bệnh lao để phát hiện các trình tự đặc hiệu MTB trong các mẫu có thể trở thành một phương pháp mới để chẩn đoán bệnh lao và chuẩn đoán ở những bệnh nhẫn nhiễm HIV Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế cần khắc phục để sử dụng rộng rãi ddPCR trong môi trường lâm sàng Thứ nhất, mặc dù các dụng cụ và thuốc thử cho ddPCR đều có sẵn trên thị trường nhưng giá thành cao hạn chế việc sử dụng rộng rãi Thứ hai, việc lựa chọn mục tiêu phát hiện và thiết lập ngưỡng phát hiện cũng là thách thức đối với việc ứng dụng ddPCR vào thực hành lâm sàng Việc thiết lập các đường ngưỡng cho giọt dương và giọt âm có thể làm sai lệch kết quả Để làm cho ddPCR trở nên hữu ích hơn trong việc phát hiện MTB, phải đặt ngưỡng phát hiện phù hợp Ngoài ra, tầm quan trọng của việc phát hiện ddPCR dấu vết DNA trong chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa các bệnh lâm sàng cần được khám phá thêm Tóm lại, việc giảm chi phí và tiêu chuẩn hóa các quy trình và điều kiện ddPCR là cần thiết để ddPCR được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng Mặc dù có một số hạn chế, ddPCR có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sự lây truyền bệnh lao qua không khí, nhưng cần có những nỗ lực lớn hơn để khám phá phương pháp này nhằm ngăn chặn MTB và bảo vệ sức khỏe con người 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Fan Y, Chen J, Liu M, et al Application of Droplet Digital PCR to Detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae Infections: A Narrative Review Infect Drug Resist 2022;15:1067-1076 Published 2022 Mar 15 doi:10.2147/IDR.S349607 Labrador, Jorge & Garberi, Federico & Garberi, Juan & Peneipil, Julian & Garberi, Miguel & Scigliano, Luis & Troncoso, Alcides (2011) Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis using molecular biology technology Asian Pacific journal of tropical biomedicine 1 89- 93 10.1016/S2221-1691(11)60002-6 https://hellobacsi.com/ho-va-benh-duong-ho-hap/benh-lao/lao-phoi/ http://www.sinhhocphantu.net/2018/07/27/pcr-ky-thuat-so-la-gi/ https://diamet.lv/files/QX100_System.pdf 13