Tieu luan thiet bi va ky thuat cnsh

Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chuẩn đoán bệnh lao Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic ngày càng được sử dụng để phát hiện nhanh bệnh lao, đặc biệt là PCR định lượng dựa trên huỳnh quan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT

HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis

Môn học : Thiết bị và kỹ thuật trong CNSH

Tp Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DROPLET DIGITAL PCR ĐỂ PHÁT

HIỆN NHIỄM TRÙNG VI KHUẨN Mycobacteria tuberculosis

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT MAI CÔNG THÀNH

Th.S TRƯƠNG QUANG TOẢN TRƯỢNG HOÀNG MINH YẾN

LƯU NGUYỄN TỨ ANH

Tp Thủ Đức, ngày 27 tháng 10 năm 2023

DANH SÁCH NHÓM

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH NHÓM i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Muc tiêu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về bệnh lao 2

2.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB) 2

2.1.2 Thực trạng bệnh lao trên toàn thế giới 3

2.2 Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chẩn đoán bệnh lao 4

2.3 Droplet Digital PCR (ddPCR) 4

2.3.1 Droplet Digital PCR – ddPCR là gì? 5

2.3.2 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR 5

2.3.2.1 Nguyên lí cấu tạo 5

2.3.2.2 Nguyên lí hoạt động 5

2.3.3 Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR) 7

CHƯƠNG 3 ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria tuberculos 9

3.1 Định lượng Mycobacterrium tuberculosis 9

3.2 Chuẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV 9

3.3 Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau 10

3.4 Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn 10

3.5 Phát hiện nhiễm trùng Mycobacteria leprae 11

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 12

TÀI LIỆU THAM KHẢO 13

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ddPCR : Droplet Digital PCR

PCR : Polymerase Chain Reaction

TB : Tuberculosis

MTB : Mycobacteria tuberculosis

LTBI : Latent TB infection

WHO : World Health Organization

HIV : Human Immuno-deficiency Virus

RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction DNA : Deoxyribonucleic acid

RNA : Acid ibonucleic

qPCR : Real-time Polymerase Chain Reaction

gyrB : Gyrase subunit B

LAM : Lipoarabinomannan

FFPE : Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue

IGRA : Interferon-Gamma Release Assays

PB : Paucibacillar

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lao phổi xảy ra khi vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (M tuberculosis) trực tiếp

tấn công phổi và phá hủy các mô tế bào của cơ quan này Đây là một căn bệnh đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe con người và giết chết gần hai triệu người mỗi năm

Tuy nhiên, các công nghệ chẩn đoán và xét nghiệm độ nhạy hiện có còn tốn nhiều thời gian và do đó khó đạt được mục tiêu chẩn đoán sớm và phát hiện độ nhạy cảm của thuốc Qua đó sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử đã khắc phục được những hạn chế về thời gian và độ nhạy thấp của phương pháp nhuộm và nuôi cấy nhanh axit để chẩn đoán bệnh lao, do đó có thể dần dần đạt được chẩn đoán bệnh lao nhanh chóng

và chính xác Các công cụ chẩn đoán tiên tiến với độ đặc hiệu, độ nhạy và tự động hóa cao hơn đang được phát triển Bài viết này giới thiệu một kỹ thuật chẩn đoán phân tử mới,

Droplet Digital PCR (ddPCR) và ứng dụng của nó trong bệnh lao, với hy vọng khơi dậy những ý tưởng mới trong phòng ngừa và điều trị bệnh lao

1.2 Mục tiêu

Dùng sinh học phân tử nhằm định lượng, chuẩn đoán sớm và phát hiện ra vi khuẩn

Mycobacteria tuberculosis (M tuberculosis) là nguyên nhân chính gây ra bệnh lao (hay còn

gọi là Lao phổi) bằng phương pháp Droplet Digital PCR là phương pháp định lượng acid nucleoic với độ nhạy cao và không cần đường chuẩn

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh lao

Bệnh lao (TB), do nhiễm Mycobacteria tuberculosis (MTB), thường ảnh hưởng đến

phổi nhất nhưng vi khuẩn lao có thể tấn công bất kỳ bộ phận nào của cơ thể như thận, cột sống và não Không phải ai bị nhiễm vi khuẩn lao cũng bị bệnh Kết quả là tồn tại hai tình trạng liên quan đến bệnh lao: nhiễm lao tiềm ẩn (LTBI) và bệnh lao, là một bệnh truyền nhiễm mãn tính đe dọa sức khỏe cộng đồng trong nhiều năm Bệnh lao lây lan qua không khí khi người mắc bệnh lao phổi ho, hắt hơi hoặc khạc nhổ Một người chỉ cần hít phải một vài vi trùng là có thể bị nhiễm bệnh

2.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis (MTB)

Mycobacteria bệnh lao (MTB), còn được gọi là trực khuẩn Koch, là một loài vi khuẩn

gây bệnh thuộc họ Mycobacteriaceae và là tác nhân gây bệnh lao Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1882 bởi Robert Koch, Mycobacteria bệnh lao có một lớp phủ sáp bất thường trên bề mặt tế bào của nó chủ yếu là do sự hiện diện của axit mycolic Lớp phủ này làm cho

tế bào không bị nhiễm vi khuẩn Gram và kết quả là MTB có thể có biểu hiện Gram dương

yếu

Hình 2.1 Đường lây truyền chủ yếu của bệnh lao

Mycobacterium Tuberculosis là một trực khuẩn dài từ 3 - 5 μm, hai đầu tròn, không

có lông và có đặc điểm là kháng cồn kháng acid (không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của thuốc nhuộm Fuchsin) Khả năng tồn tại trong điều kiện tự nhiên của Vi khuẩn trong khoảng

3 - 4 tháng

Ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn lao có thể ngừng phát triển, ở 100oC vi khuẩn sẽ chết sau

10 phút và bị tiêu diệt bởi cồn 90o

2.1.2 Thực trạng của bệnh lao trên toàn thế giới

Khoảng một phần ba dân số thế giới bị nhiễm MTB Khoảng 8 triệu ca nhiễm mới và

2 triệu ca tử vong do bệnh lao xảy ra hàng năm Năm 2013, ước tính có khoảng 9 triệu ca mắc và 1,5 triệu ca tử vong trên toàn thế giới Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và 194 quốc gia thành viên Liên Hợp Quốc đã thông qua chiến lược của WHO nhằm chấm dứt bệnh lao tại Đại hội đồng Y tế Thế giới năm 2014, nhằm giảm 95% số ca tử vong do bệnh lao và giảm tỷ lệ mắc mới của bệnh lao Tỷ lệ chẩn đoán bệnh lao là 90% trong khoảng thời gian

từ 2015 đến 2035 Theo Báo cáo bệnh lao toàn cầu năm 2020 của WHO, có gần 10 triệu bệnh nhân lao mới và 2 tỷ bệnh nhân lao tiềm ẩn trên toàn thế giới vào năm 2019

Những người bị nhiễm vi khuẩn lao có nguy cơ mắc bệnh lao từ 5–10% trong đời Những người có hệ thống miễn dịch bị tổn hại, chẳng hạn như người nhiễm HIV, suy dinh dưỡng hoặc tiểu đường, hoặc những người sử dụng thuốc lá, có nguy cơ mắc bệnh cao hơn,

Hình 2.2 Vi Khuẩn Mycobacteria tuberculosis

1,3 triệu ca tử vong ở những người âm tính với HIV (phạm vi, 1,2 triệu-1,5 triệu) và 0,38 triệu ca tử vong ở những người dương tính với HIV (phạm vi, 0,32 triệu-0,45 triệu)

2.2 Áp dụng kỹ thuật phân tử vào chuẩn đoán bệnh lao

Các xét nghiệm khuếch đại axit nucleic ngày càng được sử dụng để phát hiện nhanh bệnh lao, đặc biệt là PCR định lượng dựa trên huỳnh quang thời gian thực (real-time PCR),

vì đây có thể là phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy Kết quả RT-PCR cũng được sử dụng như một yếu tố xác nhận có giá trị khi quyết định nên tiếp tục hay bỏ điều trị chống lao Mặc dù RT-PCR vẫn là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic nhưng nó không phù hợp để phát hiện những khác biệt nhỏ Hơn nữa, việc định lượng RT-PCR nhìn chung không chính xác vì nó phụ thuộc vào việc so sánh các mẫu chưa biết với đường cong chuẩn

Do đó dùng một công nghệ mới nổi được gọi là Droplet Digital PCR (ddPCR) là một giải pháp thay thế tiềm năng cho RT-PCR thông thường để phát hiện vi sinh vật

2.3 Droplet Digital PCR (ddPCR)

Hình 2.3 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR

2.3.1 Droplet Digital PCR – ddPCR là gì?

Droplet Digital PCR (ddPCR) là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử

để định lượng và phân tích các mẫu DNA hoặc RNA Đây là phương pháp PCR dựa trên phân vùng, kỹ thuật số, chia mẫu thành hàng nghìn giọt có kích thước nanolit, mỗi giọt chứa một số lượng nhỏ phân tử mục tiêu Sự khuếch đại của các phân tử mục tiêu xảy ra trong mỗi giọt, cho phép định lượng tuyệt đối các phân tử mục tiêu có trong mẫu ban đầu

ddPCR thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền, chẩn đoán và y học chính xác

2.3.2 Máy Bio-Rad® QX100™ Droplet Digital™ PCR

2.3.2.1 Nguyên lí cấu tạo

Máy QX100™ ddPCR bao gồm một phần mô-đun ngưng tụ, phần mô-đun nạp mẫu

và phần mô-đun đọc kết quả

Phần mô-đun ngưng tụ: Đây là phần điều khiển chính của máy và chứa tất cả các thiết

bị điều khiển và cảm biến Nó kiểm soát quá trình polymerase chain reaction (PCR) danh định và tạo ra điều kiện để tạo ra các giọt digital (ddPCR) theo kỹ thuật tạo giọt

Phần mô-đun nạp mẫu: Phần này chứa các ống nạp mẫu và bảng điều khiển đóng/mở van tự động Nó cho phép người dùng nạp mẫu DNA hoặc RNA cùng với các primers, enzym và fluorophore vào hệ thống

Phần mô-đun đọc kết quả: Đây là phần thu nhận tín hiệu quang phổ từ các giọt digital

Nó sử dụng một laser cho phép phân loại các giọt dựa trên sự hiện diện và mức độ fluorescence Kết quả được đưa ra dưới dạng một biểu đồ sốt nhiệt digital cho biết số giọt tích cực và số giọt âm tính, từ đó xác định mật độ của các tín hiệu gen trong mẫu

2.3.2.2 Nguyên lí hoạt động

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Kết hợp mẫu DNA, mồi và đầu dò với supermix Bio-Rad ddPCR để tạo ra tám mẫu

đã chuẩn bị Nạp 20 l mẫu đã chuẩn bị vào các giếng lẻ của hộp tạo giọt nhỏ dùng 1 lần tám kênh

Bước 2: Tạo vi giọt

Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là Droplet Generator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng

1 nL Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như trên và trở thành 1 phản ứng nhỏ Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các

vi giọt này

Bước 3: Thực hiện PCR

Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy PCR thông thường Thực hiện PCR đến điểm cuối (40 chu kỳ) bằng máy quay vòng nhiệt, DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được phân bố vào vi giọt

Bước 4: Đọc giọt

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer Từng vi giọt

trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại và bằng phát hiện quang học hai màu để xác định giọt nào chứa mục tiêu (+) và giọt nào không chứa (-)

Bước 5: Phân tích kết quả

Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm ddPCR đọc các giọt dương tính và âm tính trong mỗi mẫu và vẽ biểu đồ từng giọt huỳnh quang: khoảng 1,4 triệu giọt được đọc trên mỗi đĩa 96 giếng Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm) Tổng số vi giọt âm tính (không chứa) DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng âm)

2.3.3 Ưu điểm của Droplet Digital PCR (ddPCR)

PCR kỹ thuật số giọt vượt qua hiệu suất của các kỹ thuật PCR kỹ thuật số trước đó bằng cách giải quyết tình trạng thiếu công nghệ thực tế và có thể mở rộng trước đây để triển khai PCR kỹ thuật số Việc pha loãng hàng loạt tốn nhiều công sức và có thể xảy ra lỗi khi

sử dụng pipet; các hệ thống dựa trên chip cạnh tranh dựa vào sơ đồ chất lỏng phức tạp để phân vùng PCR kỹ thuật số giọt giải quyết những thiếu sót này bằng cách phân chia hàng loạt mẫu trong pha lỏng trong một bước Việc tạo ra hàng chục nghìn giọt có nghĩa là một

mẫu có thể tạo ra hàng chục nghìn điểm dữ liệu thay vì một kết quả duy nhất, mang sức mạnh của phân tích thống kê vốn có của PCR kỹ thuật số vào ứng dụng thực tế Hệ thống PCR kỹ thuật số giọt dịch của Bio-Rad tự động hóa quy trình làm việc ddPCR bao gồm tạo giọt dịch, chu trình nhiệt, đọc giọt dịch và phân tích dữ liệu, giúp phòng thí nghiệm nghiên cứu đang làm việc có thể tiếp cận công nghệ này

CHƯƠNG 3 ỨNG DỤNG DROPLET DIGITAL PCR

TRONG CHUẨN ĐOÁN NHIỄM VI KHUẨN Mycobacteria

tuberculosis

3.1 Định lượng Mycobacterium tuberculosis

Định lượng mầm bệnh là một chỉ số tiềm năng để xác định kết quả điều trị và dự đoán tái phát, đồng thời định lượng ngày càng được đề xuất như một công cụ giúp quản lý nhiễm trùng lao Việc áp dụng ddPCR cung cấp một phương pháp mới để định lượng chính xác

mầm bệnh MTB Phát hiện và định lượng thành công MTB trong huyết tương bệnh nhân

lao bằng ddPCR ddPCR cũng có thể được sử dụng để định lượng các phân tử mục tiêu có bản sao thấp với độ chính xác và độ nhạy cao hơn sử dụng ddPCR để phát hiện các mục

tiêu DNA đặc hiệu MTB (IS6110) trong các mẫu máu toàn phần Kết quả cho thấy ddPCR

có thể được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu MTB từ máu toàn phần Đây là lần

đầu tiên ddPCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng bệnh lao, tạo cơ sở cho việc khám phá ddPCR như một xét nghiệm chẩn đoán phân tử định lượng đối với các bệnh truyền nhiễm Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu còn áp dụng ddPCR vào chẩn đoán bệnh nhân lao trẻ sơ sinh Họ phát hiện ra rằng ddPCR cũng cho thấy ưu điểm về định lượng tuyệt đối và

độ nhạy cao trong các mẫu máu toàn phần từ những trẻ sơ sinh không có các triệu chứng

hô hấp sớm và khó lấy được đờm

3.2 Chẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân nhiễm HIV

Sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong huyết tương của bệnh nhân bị suy giảm miễn

dịch nặng Phương pháp nhuộm nhanh axit cũng như qPCR của các mẫu đờm, máu và nước

tiểu của bệnh nhân này đều không phát hiện thấy sự hiện diện của MTB, trong khi kết quả ddPCR cho thấy sự khuếch đại dương tính của các trình tự đặc hiệu MTB (IS6110 và gyrB)

Sự hiện diện của nhiễm trùng MTB lan tỏa đã được xác nhận ở bệnh nhân khi khám nghiệm

tử thi sau đó Đồng nhiễm MTB với virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) chiếm

8,2% số ca mắc lao mới và là nguyên nhân gây tử vong phổ biến nhất do bệnh lao Vì nhiều

lý do khác nhau, mẫu đờm của bệnh nhân có thể không có hoặc mẫu đờm âm tính, dẫn đến

việc chẩn đoán bệnh lao không hiệu quả và kịp thời Mặc dù việc phát hiện lipoarabinomannan (LAM) trong nước tiểu đã được áp dụng trong chẩn đoán bệnh lao ở bệnh nhân HIV nhưng các bộ dụng cụ thương mại hiện tại vẫn thiếu độ nhạy

3.3 Phát hiện bệnh lao Mycobacteria trong các mẫu khác nhau

Có thể sử dụng ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu máu toàn phần, các nghiên cứu về việc sử dụng ddPCR cho một loạt nghiên cứu điều tra việc phát hiện MTB trong các

mẫu bệnh lý, exosome và các mẫu vật khác đã được phát triển Các nhà khoa học đã cung

cấp một phương pháp mới để phát hiện trình tự cụ thể MTB trong exosome (IS6110) bằng

ddPCR Họ đã sử dụng ddPCR để phát hiện 190 mẫu đường hô hấp từ những bệnh nhân nghi mắc bệnh lao So với nuôi cấy, ddPCR cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu tốt hơn, và xét nghiệm ddPCR sử dụng exoDNA có độ nhạy cao hơn tổng số DNA

ddPCR còn được sử dụng để phát hiện các trình tự đặc hiệu của MTB (IS6110) trong

65 mẫu bệnh lý và đánh giá độ nhạy của ddPCR để phát hiện MTB trong các mẫu được cố

định bằng formalin và nhúng parafin (FFPE) Trong số 65 mẫu, 45 mẫu được xác định là bệnh nhân có khả năng mắc bệnh lao (giá trị Ct nằm trong khoảng từ 37 đến 40) bằng cách

sử dụng qPCR ddPCR đã cải thiện tỷ lệ dương tính của bệnh nhân lao có thể xảy ra lên

57,8%, điều này cho thấy độ nhạy cao hơn của ddPCR trong việc phát hiện MTB trong các

mẫu FFPE

3.4 Phát hiện nhiễm trùng lao tiềm ẩn

Việc chứa MTB trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi CD34 + giúp khắc phục các điều

kiện bất lợi, bao gồm tình trạng thiếu oxy, tấn công miễn dịch và điều trị bằng thuốc, do đó cho phép hiện diện lâu dài trong vật chủ Các tế bào gốc tạo máu mang glycoprotein CD34

làm chất đánh dấu bề mặt có thể đại diện cho các hốc sinh thái của MTB trong quá trình nhiễm lao tiềm ẩn và việc phát hiện sự hiện diện của MTB trong các tế bào này có thể cung

cấp thông tin có giá trị cho việc chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn Các nhà khoa học đã sử dụng

ddPCR để phát hiện MTB trong tế bào CD34 + đơn nhân máu ngoại vi từ những người

trưởng thành không có triệu chứng có kết quả xét nghiệm dương tính với IGRA Điều này