Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Block nhiệt 3 Peltier.Công nghệ gradient nhiệt độ: Trang 10 Công nghệ gradient nhiệt độ giúp thực hiện phản ứng PCR cùng lúc với nhiều nhiệtđộ khác nhau nhờ đó tiết kiệm thời gian tối ư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tính theo công thức C1V1 = C2V2 rồi cho tất cả cho vào PCR Tube (lưu

ý bơm những thể tích lớn trước rồi hẳn bơm mồi) và cho vào máy PCR

III Quá trình (diễn ra theo thứ tự)

1 Tiền biến tính (95°C) là bước khởi động, tách chẻ DNA thành sợi đơn

2 Biến tính (95°C) khoảng 15-60 giây

3 Bắt cặp (55°C) khoảng 15-60 giây

4 Kéo dài (72°C) khoảng 15-60 giây

5 Hậu kéo dài (72°C) khoảng 7-10 phút.

- Lặp đi lặp lại 35 chu kỳ

- Công thức tính nhiệt độ biến tính : Tm = 4°C x (G + C) + 2°C x (A +T)

- Công thức tính nhiệt độ bắt cặp: Tα = Tm – 4

IV Cấu tạo máy PCR

4.1 Cấu tạo máy PCR cổ điển

Hình 1.1 Cấu tạo máy PCR.

Thực hiện phản ứng PCR bằng cách di chuyển tube lần lượt qua 3bồn nước có nhiệt độ khác nhau, tương tự với 3 bước: biến tính, bắtcặp, kéo dài

4.2 Cấu tạo máy PCR hiện đại

4.2.1 Bộ phận điều khiển

+ Gồm: bộ phận điều khiển, nguồn điện, bộ phận luân nhiệt

Hình 1.2 Bộ phận điều khiển.

+ Gồm: màn hình, phím bấm, vi mạch điều khiển,

+ Đóng vai trò là bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lậpchương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị.

4.2.2 Nguồn điện

Hình 1.3 Nguồn điện.

+ Gồm:

Biến áp: biến đổi dòng điện

Cầu chì: ngắt dòng điện kịp thời tránh trường hợp cháy nổ và giảmthiệt hại về mức thấp nhất cho máy

Tụ điện

Điện trở: sinh nhiệt

Diot: biến dòng điện xoay chiều thành dòng điện một chiều

+ Đóng vai trò chuyển đổi dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điệnmột chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộphận khác nhau của máy

Hình 1.5 Nguyên lý cặp nhiệt điện.

Hai dây dẫn khác loại nối với nhau và đặt ở hai nhiệt độ khácnhau (tức là có gradient nhiệt) thì tạo ra một điện áp Sự chênh nhiệtdẫn đến dòng nhiệt truyền, làm khuếch tán các hạt mang điện Dòngchảy của các hạt mang điện giữa các vùng nóng và lạnh lại tạo ra mộtđiện áp khác nhau

Năm 1834, Jean Charles Athanase Peltier phát hiện ra hiệu ứngngược lại, rằng một dòng điện chạy qua mối nối nhau của hai dây dẫnkhác loại nhau, thì tùy thuộc vào chiều dòng điện, làm cho nó hoạtđộng như một phần tử làm nóng hoặc làm mát Hiệu ứng được gọi làhiệu ứng Peltier và Bơm nhiệt Peltier hoạt động theo hiệu ứng này

Hình 1.6 Block nhiệt 1 Peltier (sò nóng lạnh).

Hình 1.7 Block nhiệt 1 Peltier (sò nóng lạnh).

Hình 1.8 Block nhiệt 3 Peltier.

Công nghệ gradient nhiệt độ:

Block nhiệt được cấu tạo từ hai sò nóng lạnh trở lên Nhiệt độ trên block được phân

bố theo dải gradient hoặc từng vùng riêng biệt

Công nghệ gradient nhiệt độ giúp thực hiện phản ứng PCR cùng lúc với nhiều nhiệt

độ khác nhau nhờ đó tiết kiệm thời gian tối ưu hóa phản ứng PCR

Công nghệ PCR nhiều vùng block nhiệt:

Nhiều vùng nhiệt: block nhiệt được cấu tạo từ nhiều Peltier Công nghệ này giúp càiđặt nhiệt độ riêng biệt cho từng vùng trên block

Hình 1.9 Phân bố nhiệt đọ trên block nhiệt từng vùng

riêng biệt hoặc theo dải gradient nhiệt độ

Hình 1.10 Kết quả điện di theo công nghệ gradient nhiệt

độ

Nhiều block nhiệt: máy PCR có nhiều block nhiệt riêng biệt, có thể hoạt động độc lậpnhư nhiều máy PCR

Nắp nhiệt:

Bao gồm: điện trở, cảm biến nhiệt,

Đóng vai trò gia nhiệt cho phần nắp của tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi vàngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng

Hình 1.11 Công nghệ PCR nhiều vùng nhiệt, nhiều block nhiệt.

REAL TIME PCR

I Định nghĩa về real time PCR

Phản ứng real time PCR là một kỹ thuật thí nghiệm sinh học phân tửdựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Nó theo dõi sự khuếch đạicủa một phân tử DNA được nhắm mục tiêu trong quá trình PCR (nghĩa

là trong thời gian thực), chứ không phải ở phần cuối của nó như trongPCR thông thường

II Cấu tạo máy RT-PCR

Máy realtime PCR được cấu tạo từ 2 phần cơ bản: Phần nhiệt vàphần quang và hệ thống phần mềm chuyên biệt

2.1 Phần nhiệt

Bộ phận gia nhiệt với khả năng luân nhiệt ở nhiệt độ khác nhautrong khoảng 4°C - 115°C và quá trình lặp đi lặp lại từ 30 – 40 chu kỳ

Sử dụng tube với thể tích khác nhau Số mẫu tối đa là 96 mẫu

Có 3 công nghệ gia nhiệt hiện nay:

- Công nghệ block nhiệt: dựa trên nguyên lý sự dịch chuyển của cácelectron, với công nghệ này tốc độ gia nhiệt là thấp

- Gia nhiệt bằng khí (gia nhiệt bằng roto): nguyên lý là việc thổi khínóng lạnh vào buồng làm việc Tốc độ gia nhiệt tương đối nhanh

- Gia nhiệt bằng cách sử dụng tấm vi mạch MHS và tốc độ gia nhiệt làrất lớn Tuy nhiên ở nước ta hiện nay chưa thực sự phổ biến

Hình 1.12.Nắp

nhiệt

1.1 Phần quang

Dùng để ghi nhận tín hiệu phát huỳnh quang

Hiện nay có 3 kiểu thu nhận tín hiệu huỳnh quang phổ biến:

- Charge Couple Device (CCD): hoạt động bằng cách phát ra một chùmtia cùng lúc và ghi nhận tất cả các tín hiệu và phần mềm sẽ phân táchtín hiệu nhận được

- Photomultipiler tube (PMT): thường dùng với máy gia nhiệt bằng khí,ánh sáng chiếu tới quét qua từng đáy tube khi mẫu đang quay Tín hiệuphát xạ sẽ chuyển đến bộ phận thu nhận và phân tách Đọc lệnh tínhiệu này phải sử dụng phần mềm của hãng

- Công nghệ Photodiode hiện nay đã rất ít được sử dụng trong các dòngmáy Realtime PCR hiện đại

II Cơ chế hoạt động của SYBR Green và Taqman

2.1 Cơ chế hoạt động của SYBR Green

SYBR Green là thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng đểnhuộm axit nucleic, đặc biệt là DNA sợi kép trong Sinh học phân tử

Phương pháp SYBR Green được sử dụng để định lượng sản phẩmPCR trong quy trình realtime PCR Một khi nó liên kết với DNA, phứchợp nhuộm DNA thu được sẽ hấp thụ ánh sáng xanh và phát ra ánhsáng xanh cực mạnh Nó xảy ra do sự thay đổi cấu trúc xảy ra trongphân tử thuốc nhuộm khi liên kết với DNA sợi kép.

Khi PCR tạo ra càng nhiều DNA, càng nhiều phân tử thuốc nhuộmliên kết với DNA, tạo ra nhiều huỳnh quang hơn Do đó, huỳnh quangtăng lên cùng với sự tích lũy sản phẩm PCR Do đó, lượng sản phẩm

PCR có thể được đo định lượng bằng phát hiện huỳnh quang xanhSYBR

2.2 Cơ chế hoạt động của Taqman

 Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligonucleotide dài khoảng 24 30bp với đầu 5' gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) vàđầu 3' còn lại gắn chất hấp thụ (quencher)

-Hình 1.13 Cơ chế hoạt động của SYBR Green.

 Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất

cả ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra Khi phản ứngPCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằnghoạt tính 5' - 3' exonuclease, reporter được giải phóng tín hiệu

huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu

III Máy realtime PCR Applied Biosystems 7500

1 Máy realtime PCR Rotor-Gene Q

Hình 1.14 Cơ chế hoạt động của TagMan

1.1 Cơ chế hoạt động của máy realtime PCR Rotor-Gene Q

- Hệ thống gia nhiệt bằng không khí do không có sò nóng lạnh

- Không có nắp nhiệt, khi xoay chịu lực ly tâm nên không bị bay hơi,không ngưng tụ

Hình 1.15 Cấu tạo bên trong máy Realtime PCR Applied

Biosystems 7500

2 Máy realtime PCR Rotor-Gene Q

Cơ chế hoạt động của máy realtime PCR Rotor-Gene Q

- Hệ thống gia nhiệt bằng không khí do không có sò nóng lạnh

- Không có nắp nhiệt, khi xoay chịu lực ly tâm nên không bị bay hơi,không ngưng tụ

Hình 1.16 Cơ chế hoạt động của máy Realtime PCR Appliced

Biosystems 7500

Hình 1.17 Máy Realtime Rotor-Gene Q.

Hình 1.18 Cấu tạo bên trong máy Realtime Rotor-Gene Q.

Hình 1.19 Cơ chế hoạt động của Realtime Rotor-gene Q.

3 Loại tube sử dụng cho realtime PCR

Hình 1.20 Các loại tube.

Số copies= ng∗6.022∗1023

chiềudài∗109∗650

Hình 1.22 Xây dựng đường chuẩn.

Hình 1.21 Biểu đồ khuêch đại một quy trình Realtime PCR.

Hình 1.23 Phân tích đường cong nóng chảy.

Hiệu chuẩn (Calibration) là hoạt động xác định, thiết lập mối quan hệ giữa giá trị đo củachuẩn đo lường, phương tiện đo với giá trị đo của đại lượng cần đo.

Hiệu chỉnh (Adjustment) là chỉnh sửa những sai sót của máy móc, thiết bị nhằm đạtmột độ chính xác và độ tin cậy cần thiết của máy móc, thiết bị

Bảo trì (Maintenance) là hoạt động chăm sóc kĩ thuật, điều chỉnh, sửa chữa hoặc thaythế một hoặc nhiều chi tiết hay cụm chi tiết nhằm duy trì hoặc khôi phục các thông sốhoạt động, bảo đảm máy móc thiết bị hoạt động với tính năng đã xác định trước

Kiểm định (Verification) là hoạt động kỹ thuật theo một quy trình nhất định nhằmđánh giá và xác nhận sự phù hợp của sản phẩm, hàng hoá với yêu cầu quy định trong quychuẩn kỹ thuật tương ứng

BÀI 2: XÂY DỰNG PHẢN ỨNG PCR

1 Các bước thao tác thiết kế Primer

1.1 Mục đích và nguyên tắc của việc thiết kế Primer

Đoạn mồi (Primer) là một thành phần bắt buộc có và đóng vai trò quan trọng trongphản ứng PCR Primer là những đoạn oligonucleotide ngắn có chiều dài từ 18-25 nu

Nó có trình tự bổ sung với mạch khuôn DNA làm trình tự nhận biết bám vào củaenzyme Taq polymerase

Đoạn mồi được thiết kế dựa vào hai vùng trình tự đã biết, nằm ở hai đầu của đoạngen cần khuếch đại Trong phản ứng PCR bao giờ cũng cần có cặp mồi (mồi xuôi và mồingược), có rất nhiều các tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp mồi như:+ Độ dài đoạn mồi từ 18 – 25 Nucleotide

+ Tỉ lệ G và C (%G+C) dao động trong khoảng từ 40% → 60%

+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Tm= 2(A+T) + 4 (G+C)

+ Nhiệt độ bắt cặp: Ta=Tm – 4

+ TmF và TmR không chênh lệch quá 5 độ C

+ Số lần lặp lại của một nucleotide không quá 4 lần

1.2 Các bước tiến hành

Bước 1: Truy cập vào trang web NCBI

Bước 2: Chọn vùng tìm kiếm là genome và nhập tên đối tượng cần thiết kế primervào

Bước 3: Chọn vào Refseq -> mục FASTA -> tải bộ gene về

Bước 4: Sau khi đã có trình tự của virus ta vào BioEdit và nhấn File Open File trình

tự đã lưu

Bước 5: Đối với mồi F thì ta copy một đoạn mã gen và kiểm tra các điều kiện trêntrang công cụ Tm Calculator

Bước 6: Đối với tạo mồi R ta tiến hành như mồi F nhưng sau khi kiêm tra trên công

cụ Tm Calculator thì phải reverse - complement để có trình tự bổ sung đảo ngược chuẩn.Bước 7: Thực hiện kiểm tra primer đã thiết kế với primer blast, ta thu được kết quảtrình tự mục tiêu chuẩn đối với primer đã thiết kế dành cho virus mục tiêu

2 Xây dựng phản ứng PCR và chương trình nhiệt của phản ứng PCR

Tiền biến tính: Bước biến tính ban đầu là 1 phút ở 95°C được khuyến nghị cho cácmẫu không phức tạp như DNA plasmid hoặc cDNA Đối với các khuôn phức tạp hơn nhưDNA bộ gen của sinh vật nhân chuẩn, thời gian biến tính ban đầu dài hơn lên đến 3 phút

là cần thiết để tạo điều kiện cho DNA tan chảy hoàn toàn

Biến tính: Đề xuất bước biến tính chu kỳ 15 giây ở 95°C, bước này cũng phù hợp vớicác mẫu giàu GC, tuy nhiên đối với các mẫu có hàm lượng GC thấp (40-45%), thời gianbiến tính có thể giảm xuống còn 5 giây

Nhiệt độ và thời gian bắt cặp: Nhiệt độ bắt cặp tối ưu phụ thuộc vào trình tự mồi vàthường là 2-5°C Nhiệt độ và thời gian kéo dài: Bước kéo dài phải được thực hiện ở72°C Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của amplicon và độ phức tạp của mẫu

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt của quy trình PCR

Công thức đơn giản C1xV1 = C2xV2.

Giữ nhiệt độ thành phần ở 0-4°C, không bị hư, thành phần không có phản ứng vớinhau

Sử dụng nước loại 1 thì không có DRNA, được đảm bảo về độ tinh sạch

Biến tính phụ thuộc vào chiều dài đoạn cần khuyếch đại, tỷ lệ G + C

Bắt cặp phụ thuộc vào primer liên kết vào mạch khuôn

Kéo dài phụ thuộc chiều dài đoạn khuyếch đại, tốc độ enzyme DNA pol

BÀI 3: ĐIỆN DI, PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

I Định nghĩa về điện di trên Gel

Tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein) bằng cách cho điqua chất nền là gel trong một điện trường Người ta thường sử dụngcác loại gel agarose hay polyacrylamide

DNA hay RNA thường mang điện tích âm Trong điện di trên gel,mẫu được cho vào những giếng nằm gần cực âm và DNA/RNA sẽ dichuyển về phía cực dương Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thướcphân tử, phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh

II Phân tích kết quả từ mẫu không chứa DNA vi khuẩn

- DNA mẫu phân tích

- DNA mẫu đối chứng dương

- Dye + gelred

- Pipet, đầu tip,

b) Phương pháp

Bước 3: Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100÷120V.

Bước 4: Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả

1.3 Kết quả

- Kết quả điện di cho thấy mẫu phân tích âm tính với heo (band số7)

Lưu ý:

Trộn mẫu dùng nấc 1 của micropipette

Trước khi hút 5µL mẫu DNA nên trộn đều lại

Thang chuẩn và GelRed trộn càng đều và kỹ sẽ ra băng sáng và đẹp

Cho mẫu vào giếng tránh cho dầu pipet đụng vào đáy giếng sẽ làm rách lúc điện di sẽ

bị chạy ra ngoài

Bơm mẫu từ từ vào giếng bơm nhanh mẫu sẽ bị bơm ra ngoài

BÀI 4: THIẾT KẾ PRIMER

Primer ngược ( Reverse Primer): Primer bám trên sợi coding

Trong phản ứng PCR 2 primer này đóng vai trò như nhau vì cả hai mạch đều sử dụnglàm khuôn

Muốn thiết kế primer phải có trình tự của mạch khuôn lấy trên ngân hàng gene (lấytrên ngân hàng gene tải về là sợi coding 5’->3’ mang bộ ba mã hóa)

Thiết kế primer xuôi (trình tự bám trên sợi non-coding) trước bằng cách copy mộtđoạn của sợi coding

Thiết kế primer ngược (trình tự bám trên sợi coding) bằng cách copy một đoạn củasợi non-coding hoặc lấy 1 đoạn của sợi coding rồi bổ sung nó lại

2 Nguyên tắc thiết kế primer

Chú ý: không nhất thiết phải tuân theo Nó chỉ là lời khuyên để có thể tạo primer tối

ưu, hiệu suất PCR tối ưu, không bắt buộc 100% phải đi theo

1 Độ dài của primer: từ 15-30 nucleotide, thường sẽ nằm trong khoảng 18-22nucleotide

2 Nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 50-65°C, nhiệt độ nóng chảy của 2 primerchênh nhau không quá 5°C

3 Tỷ lệ GC: chiếm từ 40-60%, tối ưu là 50%

4 Đầu 3’: Quan trọng vì là vị trí enzyme polymerase gắn nucleotide tiếp theo và kéodài tổng hợp mạch mới -> nucleotide tại đầu 3’ bắt buộc phải dính vào mạch khuôn.Nucleotide tại đầu 3’ nên được kết thúc bằng nu G hoặc C vì có 3 liên kết hydro -> khảnăng liên kết sẽ tốt hơn.

Tuy nhiên: 5 nu cuối cùng không nên chứa quá 3G hoặc 3C vì nếu đầu 3’ chứa quánhiều GC sẽ dẫn đến hiên tượng bắt cặp không đặc hiệu -> khuếch đại ở những đoạnkhông mong muốn -> PCR sẽ tạo ra nhiều bằng ngoài cái băng mình mong muốn -> Tạo

ra những băng không đặc hiệu

5 Lặp: là hiện tượng có vùng trình tự lặp lại nhiều lần trong trình tự ( VD:ATATATATAT…) hoặc GCGCGC…, AAAAA…, … không nên thiết kế primer trênnhững vùng đó sẽ dẫn đến trường hợp bắt cặp bị nhầm ( bắt cặp bị sai) nếu thiết kếprimer trên những vùng trình tự lặp

6 Đảm bảo độ đặc hiệu: primer thiết kế cho đối tượng nào nó chỉ có khả năngkhuếch đại được DNA của đối tượng và không khuếch đại DNA của các đối tượng khác

và khả năng hình thành dimer thấp

Nên kiểm tra xem primer xuôi có bắt cặp với primer ngược hay không? Primer ngược

có tự bắt cặp với primer ngược hay không? Primer xuôi có tự bắt cặp với primer xuôi haykhông? Nếu khả năng bắt cặp của các primer này quá mạnh thì khi phản ứng PCR diễn raprimer sẽ không tham gia hình thành liên kết với mạch khuôn mà chính nó sẽ tự dính lạivới nhau -> hiệu suất phản ứng thấp => nên tránh sự hình thành dimer càng ít càng tốt.Vùng gene bảo tồn: bảo tồn trình tự đó trong các cá thể khác nhau trong cùng 1 loài

và phải khác nhau giữa các loài Thường người ta sẽ chọn các vùng gene trong ty thể ->thường mang tính bảo tồn, không bị biến đổi nhiều