Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO MÔN HỌCỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚITRONG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSO

Sinh viên thực hiện : NHÓM 2 THỨ 5 CA 4

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔM HỌC

ỨNG DỤNG KÝ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC

ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSON

TS HUỲNH VĂN BIẾT TRẦN QUẾ ANH 21126279

ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN TRẦN NGỌC CẨM GIANG 21126318

ĐỖ PHƯƠNG UYÊN 21126570

TP Thủ Đức, 10/2023

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

CHƯƠNG 2 XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI 2

2.1 Đối tượng nghiên cứu 2

2.2 Vật liệu nghiên cứu 2

2.3 Phương pháp nghiên cứu 3

2.3.1 Lấy và xử lý mẫu 3

2.3.2 Tách chiết DNA 4

2.3.2.1 Chuẩn bị hoá chất 4

2.3.2.2 Quy trình phân lập và lọc DNA bộ gen từ các mẫu máu bằng máy ly tâm 5

2.3.3 Phân mảnh DNA và chuẩn bị thư viện mẫu 6

2.3.4 Giải trình tự NGS 6

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN 7

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Một số đột biến gây bệnh được ghi nhận ở bệnh nhân Parkinson 7

DANG SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN) dùng tách chiết DNA 2

Hình 2.2 Máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq bằng phương pháp Illumina 3

Hình 2.3 Ống nghiệm EDTA K3 chân không 3

Hình 2.4 Cột quay QIAamp Mini 4

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bệnh Parkinson (Parkinson’s disease – PD) là bệnh lý thoái hoá thần kinh trung ương phổ biến thứ hai sau Alzheimer, ảnh hưởng trực tiếp tới hệ thần kinh vận động với các đặc điểm như run tính trạng, yếu cơ, giảm vận động, mất ổn định tư thế, sa sút trí tuệ hay rối loạn giấc ngủ Các liệu pháp như Dopaminergic, Levodopa không phải không có tác dụng phụ và chỉ có thể kiểm soát đáng kể các triệu chứng

Không có tiêu chuẩn chẩn đoán rõ ràng bệnh PD và nguyên nhân gây bệnh cũng chưa được tìm hiểu rõ Tuy nhiên, các yếu tố như di truyền, môi trường, stress, rối loạn chức năng ty thể…đều được nghiên cứu có liên quan đến sự phát triển của bệnh Việc bản

đồ gen hoàn thành cũng đã cung cấp nhiều thứ như: trình tự gen con người, bản đồ các biến dị di truyền, phân tích các biến thể di truyền Nhờ đó các nghiên cứu đã xác định vai trò của yếu tố di truyền trong việc phát bệnh PD Đến nay đã có 27 gen và locus có được phát hiện có liên quan đến bệnh PD và được đặt tên là gen “PARK” Đột biến trên các gen

“PARK” có thể gây thể bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường hoặc thể bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường

Để phát hiện các yếu tố biến đổi di truyền, các phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) có thể được sử dụng tuy nhiên chỉ phát hiện một số ít đột biến đã được biết trước trên một lượng gen giới hạn và không thể nhận biết những đột biến mới Giải trình tự Sanger cũng là phương pháp thường dùng để phát hiện biến đổi gen tuy nhiên mỗi phản ứng chỉ giải được trình tự một mảnh gen, làm giới hạn trình tự giải được nâng cao giá thành, ngoài ra giải trình tự Sanger cũng không phát hiện đột biến thêm hoặc mất đoạn lớn, chuyển đoạn

Việc ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS – Next generation sequencing) cho phép giải trình tự đồng thời hàng triệu mảnh gen trong một phản ứng giúp phân tích kết quả một cách nhanh chóng, cho hiệu quả cao, giá thành thấp hơn Do

đó việc áp dụng kỹ thuật NGS cho nghiên cứu gen đột biến ở bệnh Parkinson nhằm tìm ra các yếu tố di truyền gây bệnh nhanh chóng và hiệu quả hơn

CHƯƠNG 2 XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ

GEN THẾ HỆ MỚI

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Những bệnh nhận được chẩn đoán mắc bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Parkinson và Rối loạn vận động quốc tế (International Parkinson and Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson’s disease) không có bệnh tâm thần kèm theo hoặc đang điều trị bằng thuốc an thần,…

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Ống nghiệm EDTA – ống nghiệm chứa chất chống đông máu; bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN); máy quang phổ NanoDrop 2000c; bộ kit Nebnext dsDNA fragmentase; máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq (Illumina); bộ hoá chất NextSeq Mid Output kit

Hình 2.1 Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN) dùng tách chiết DNA.

Hình 2.2 Máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq bằng phương pháp Illumina.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Lấy và xử lý mẫu

Đối tượng nghiên cứu được lấy 2ml máu ở tĩnh mạch đựng và bảo quản trong ống nghiệm EDTA, trong đó EDTA là chất chống đông máu vì ít làm biến dạng hay gây co rút hồng cầu và ít làm tăng thể tích tế bào Mẫu máu sau được lấy phải được bảo quản ở nhiệt độ 40C không quá 24 giờ trước khi tiến hành tách chiết DNA

Hình 2.3 Ống nghiệm EDTA K3 chân không.

2.3.2 Tách chiết DNA

Mẫu máu toàn phần được tách chiết DNA bằng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini (QIAGEN) Sau tách chiết sẽ kiểm tra lại bằng máy NanoDrop 2000c để xác định nồng

độ và độ tinh sạch, mẫu sau tách chiết DNA phải đạt tiêu chuẩn tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0

2.3.2.1 Chuẩn bị hoá chất

Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini bao gồm: ống rửa giải (có thể thay thế bằng ống

ly tâm 1,5ml); ống phân giải (có thể thay thế bằng ống ly tâm 1,5ml); ống rửa (có thể thay thế bằng ống ly tâm 2ml đáy tròn); Lysis Buffer; Elution Buffer; Wash Buffer 1; Wash Buffer 2; dung môi Protase; QIAGEN Protase; cột quay QIAamp Mini

Hình 2.4 Cột quay QIAamp Mini.

QIAGEN Protase: Thêm 1,2 ml ung môi Protease vào lọ QIAGEN Protease được đông khô và trộn kỹ bằng cách đảo ngược lọ nhiều lần để tránh tạo bọt Đảm bảo rằng QIAGEN Protease được hòa tan hoàn toàn

Wash Buffer 1: Thêm 25 ml ethanol (96-100%) vào chai chứa 19 ml wash buffer 1

cô đặc Bảo quản wash buffer 1 sau hòa tan ở nhiệt độ phòng từ 15 đến 25°C

Wash Bufffer 2: Thêm 30 ml ethanol (96-100%) vào chai chứa 13 ml wash buffer

2 cô đặc Bảo quản wash buffer 2 sau hòa tan ở nhiệt độ phòng từ 15 đến 25°C

2.3.2.2 Quy trình phân lập và lọc DNA bộ gen từ các mẫu máu bằng máy ly tâm

Bước 1: Hút 20 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L QIAGEN Protease vào ống phân giải

Bước 2: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L mẫu máu vào ống phân giải

Bước 3: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Lysis Buffer vào ống phân giải, đậy nắp và trộn đều bằng Vortex trong 15 giây Phải trộn đều mẫu và chất đệm phân giải để tạo ra dung dịch đồng nhất Ủ ở 56°C trong 10 phút Ly tâm ống phân giải trong 5 giây ở tốc độ tối đa để loại bỏ các giọt bám trên nắp

Bước 4: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L ethanol (96-100%) vào ống phân giải, đậy nắp và trộn kỹ bằng Vortex trong 15 giây Ly tâm ống phân giải trong 5 giây ở tốc độ tối đa để loại bỏ các giọt bám trên nắp

Bước 5: Hút toàn bộ chất phân giải ở bước 4 cho cột quay QIAamp Mini mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng của cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm ở khoảng 8000rpm trong một phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào một ống rửa mới

và thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc

Bước 6: Thêm 500 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Wash Bufffer 1 mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng của cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm ở khoảng 8000rpm trong một phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào một ống rửa mới và thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc

Bước 7: Thêm 500 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Wash Bufffer 2 mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng của cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm ở khoảng 14000rpm trong ba phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào một ống rửa giải và thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc

Bước 8: Thêm 50 đến 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Elution Buffer vào tâm của cột quay QIAamp Mini Đậy nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong một phút Ly tâm ở 8.000 rpm trong một phút để rửa giải DNA Bỏ cột quay QIAamp Mini và giữ lại dung dịch sau ly tâm

Bước 9: Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng máy quang phổ NanoDrop 2000c

2.3.3 Phân mảnh DNA và chuẩn bị thư viện mẫu

DNA sau khi tách chiết sẽ được phân mảnh thành các đoạn DNA có kích thước từ

150 đến 300bp bởi enzyme fragmentase bằng cách sử dụng bộ kit Nebnext dsDNA fragmentase Bộ kit bao gồm: 10X reaction buffer; 100X BSA; dsDNA fragmentase; enzyme fragmentase Các bước tiến hành:

Bước 1: Trộn và hút 5μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.g DNA vào ống epperdorf 1ml

Bước 2: Thêm 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L 10X reaction buffer, 1 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L100X BSA và 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L ; dsDNA fragmentase Trộn đều bằng vortex Ủ 5 phút trên đá

Bước 3: Cho thêm 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L enzyme fragmentase trộn đều và ủ ở 370C trong 30 phút

để cắt thành các đoạn DNA có kích thước từ 150 đến 300bp Tuỳ theo kích thước muốn cắt ta có thể thay đổi nhiệt độ và thời gian ủ

Bước 4: Điện di kiểm tra kích thước rồi chuẩn bị thư viện mẫu

2.3.4 Giải trình tự NGS

Mẫu máu sau khi được tách chiết và phân mảnh DNA, chuẩn bị thư viện mẫu sẽ được tiến hành giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự gene thế hệ mới NextSeq (Illumina) sử dụng bộ hóa chất NextSeq Mid Output Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm tin-sinh học và sẽ tự động so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng dữ liệu

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN

Ứng dụng kĩ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) trên bệnh nhân Parkinson Ghi nhận được các trường hợp có mang đột biến trên các gen LRRK2, GBA và PLA2G6 được thể hiện ở Bảng 3.1 sau:

Bảng 3.1 Một số đột biến gây bệnh được ghi nhận ở bệnh nhân Parkinson.

L444P

2 GBA rs104886460 c.115+1C>T

3 PLA2G6 rs121908685

A80T

4 LRRK2 rs33949390

R1628P

5 LRRK2 rs33949390 R1628P

6 LRRK2 rs33949390 R1628P

7 LRRK2 rs33949390 R1628P

Đột biến được ghi nhận này là yếu tố di truyền quan trọng gây bệnh PD ở nhóm người Hán tại Trung Quốc, Singapore và Đài Loan Hiện nay các nghiên cứu trong bệnh lí Parkinson đã xác định 23 gene hoặc vùng trên nhiễm sắc thể liên quan đến Parkinson có tính gia đình và di truyền theo qui luật Mendel Phân tích sinh hóa ghi nhận sản phẩm của các gene này thường đóng đóng vai trò quan trọng cho quá trình kiểm soát chất lượng protein nội bào cũng như sự dẫn truyền thần kinh, vận chuyển các chất trong tế bào thần kinh Điều này cho thấy sự phức tạp trong sinh bệnh học của PD và chỉ với các công cụ NGS có thể phần nào xác định được nguyên nhân di truyền của bệnh lý này vì chỉ NGS mới cho phép việc giải trình tự tiết kiệm chi phí và hiệu quả nhiều gen, các gen lớn và phức tạp Do đó bước đầu ứng dụng thành công kĩ thuật NGS trong phát hiện các đột biến điểm gây bệnh Parkinson Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán phân loại nhóm bệnh Parkinson Bên cạnh đó, với kết quả chẩn đoán gen giúp thuận lợi trong việc

tư vấn cho gia đình, người bệnh, khu trú gen khảo sát, tầm soát người mang gen bệnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Đức Minh, Đỗ, Lương Bắc An, Lê Gia Hoàng Linh, Trần Ngọc Tài, và Mai Phương Thảo 2022 “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSON” Tạp Chí Y học Việt Nam 508

Nghĩa, Trần Tín, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Hoàng Việt, Phạm Lê Anh Tuấn, và Trần Vân Khánh 2023 “4 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Gen Thế hệ mới Trong xác định đột biến Gen ở bệnh nhân Parkinson” Tạp Chí Nghiên cứu Y học 164 (3):25-32