Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO MÔN HỌCỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚITRONG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CNSH Sinh viên thực : NHÓM THỨ CA Niên khoá : 2021 - 2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔM HỌC ỨNG DỤNG KÝ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSON Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT TRẦN QUẾ ANH ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN TRẦN NGỌC CẨM GIANG ĐỖ PHƯƠNG UYÊN TP Thủ Đức, 10/2023 Mã số sinh viên 21126279 21126318 21126570 MỤC LỤC CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 CHƯƠNG XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Lấy xử lý mẫu 2.3.2 Tách chiết DNA 2.3.2.1 Chuẩn bị hoá chất 2.3.2.2 Quy trình phân lập lọc DNA gen từ mẫu máu máy ly tâm 2.3.3 Phân mảnh DNA chuẩn bị thư viện mẫu 2.3.4 Giải trình tự NGS CHƯƠNG KẾT LUẬN i DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Một số đột biến gây bệnh ghi nhận bệnh nhân Parkinson .7 ii DANG SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN) dùng tách chiết DNA Hình 2.2 Máy giải trình tự gen hệ NextSeq phương pháp Illumina Hình 2.3 Ống nghiệm EDTA K3 chân khơng Hình 2.4 Cột quay QIAamp Mini iii CHƯƠNG MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh Parkinson (Parkinson’s disease – PD) bệnh lý thoái hoá thần kinh trung ương phổ biến thứ hai sau Alzheimer, ảnh hưởng trực tiếp tới hệ thần kinh vận động với đặc điểm run tính trạng, yếu cơ, giảm vận động, ổn định tư thế, sa sút trí tuệ hay rối loạn giấc ngủ Các liệu pháp Dopaminergic, Levodopa tác dụng phụ kiểm sốt đáng kể triệu chứng Khơng có tiêu chuẩn chẩn đoán rõ ràng bệnh PD nguyên nhân gây bệnh chưa tìm hiểu rõ Tuy nhiên, yếu tố di truyền, môi trường, stress, rối loạn chức ty thể…đều nghiên cứu có liên quan đến phát triển bệnh Việc đồ gen hoàn thành cung cấp nhiều thứ như: trình tự gen người, đồ biến dị di truyền, phân tích biến thể di truyền Nhờ nghiên cứu xác định vai trò yếu tố di truyền việc phát bệnh PD Đến có 27 gen locus có phát có liên quan đến bệnh PD đặt tên gen “PARK” Đột biến gen “PARK” gây thể bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường thể bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Để phát yếu tố biến đổi di truyền, phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) sử dụng nhiên phát số đột biến biết trước lượng gen giới hạn nhận biết đột biến Giải trình tự Sanger phương pháp thường dùng để phát biến đổi gen nhiên phản ứng giải trình tự mảnh gen, làm giới hạn trình tự giải nâng cao giá thành, ngồi giải trình tự Sanger không phát đột biến thêm đoạn lớn, chuyển đoạn Việc ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS – Next generation sequencing) cho phép giải trình tự đồng thời hàng triệu mảnh gen phản ứng giúp phân tích kết cách nhanh chóng, cho hiệu cao, giá thành thấp Do việc áp dụng kỹ thuật NGS cho nghiên cứu gen đột biến bệnh Parkinson nhằm tìm yếu tố di truyền gây bệnh nhanh chóng hiệu CHƯƠNG XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI 2.1 Đối tượng nghiên cứu Những bệnh nhận chẩn đoán mắc bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn Hiệp hội Parkinson Rối loạn vận động quốc tế (International Parkinson and Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson’s disease) khơng có bệnh tâm thần kèm theo điều trị thuốc an thần,… 2.2 Vật liệu nghiên cứu Ống nghiệm EDTA – ống nghiệm chứa chất chống đông máu; kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN); máy quang phổ NanoDrop 2000c; kit Nebnext dsDNA fragmentase; máy giải trình tự gen hệ NextSeq (Illumina); hoá chất NextSeq Mid Output kit Hình 2.1 Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN) dùng tách chiết DNA Hình 2.2 Máy giải trình tự gen hệ NextSeq phương pháp Illumina 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Lấy xử lý mẫu Đối tượng nghiên cứu lấy 2ml máu tĩnh mạch đựng bảo quản ống nghiệm EDTA, EDTA chất chống đơng máu làm biến dạng hay gây co rút hồng cầu làm tăng thể tích tế bào Mẫu máu sau lấy phải bảo quản nhiệt độ 40C không 24 trước tiến hành tách chiết DNA Hình 2.3 Ống nghiệm EDTA K3 chân khơng 2.3.2 Tách chiết DNA Mẫu máu toàn phần tách chiết DNA kit QIAamp DNA Blood Mini (QIAGEN) Sau tách chiết kiểm tra lại máy NanoDrop 2000c để xác định nồng độ độ tinh sạch, mẫu sau tách chiết DNA phải đạt tiêu chuẩn tỷ lệ OD260/OD280 nằm khoảng từ 1,8 đến 2,0 2.3.2.1 Chuẩn bị hoá chất Bộ kit QIAamp DNA Blood Mini bao gồm: ống rửa giải (có thể thay ống ly tâm 1,5ml); ống phân giải (có thể thay ống ly tâm 1,5ml); ống rửa (có thể thay ống ly tâm 2ml đáy tròn); Lysis Buffer; Elution Buffer; Wash Buffer 1; Wash Buffer 2; dung mơi Protase; QIAGEN Protase; cột quay QIAamp Mini Hình 2.4 Cột quay QIAamp Mini QIAGEN Protase: Thêm 1,2 ml ung môi Protease vào lọ QIAGEN Protease đông khô trộn kỹ cách đảo ngược lọ nhiều lần để tránh tạo bọt Đảm bảo QIAGEN Protease hịa tan hồn tồn Wash Buffer 1: Thêm 25 ml ethanol (96-100%) vào chai chứa 19 ml wash buffer đặc Bảo quản wash buffer sau hịa tan nhiệt độ phòng từ 15 đến 25°C Wash Bufffer 2: Thêm 30 ml ethanol (96-100%) vào chai chứa 13 ml wash buffer cô đặc Bảo quản wash buffer sau hòa tan nhiệt độ phòng từ 15 đến 25°C 2.3.2.2 Quy trình phân lập lọc DNA gen từ mẫu máu máy ly tâm Bước 1: Hút 20 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L QIAGEN Protease vào ống phân giải Bước 2: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L mẫu máu vào ống phân giải Bước 3: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Lysis Buffer vào ống phân giải, đậy nắp trộn Vortex 15 giây Phải trộn mẫu chất đệm phân giải để tạo dung dịch đồng Ủ 56°C 10 phút Ly tâm ống phân giải giây tốc độ tối đa để loại bỏ giọt bám nắp Bước 4: Thêm 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L ethanol (96-100%) vào ống phân giải, đậy nắp trộn kỹ Vortex 15 giây Ly tâm ống phân giải giây tốc độ tối đa để loại bỏ giọt bám nắp Bước 5: Hút toàn chất phân giải bước cho cột quay QIAamp Mini mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm khoảng 8000rpm phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào ống rửa thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc Bước 6: Thêm 500 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Wash Bufffer mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm khoảng 8000rpm phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào ống rửa thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc Bước 7: Thêm 500 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Wash Bufffer mà không làm ướt thành Tránh chạm màng trắng cột quay QIAamp Mini vào đầu tip pipet Ly tâm khoảng 14000rpm ba phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào ống rửa giải thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc Bước 8: Thêm 50 đến 200 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L Elution Buffer vào tâm cột quay QIAamp Mini Đậy nắp ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 8.000 rpm phút để rửa giải DNA Bỏ cột quay QIAamp Mini giữ lại dung dịch sau ly tâm Bước 9: Kiểm tra độ tinh nồng độ DNA máy quang phổ NanoDrop 2000c 2.3.3 Phân mảnh DNA chuẩn bị thư viện mẫu DNA sau tách chiết phân mảnh thành đoạn DNA có kích thước từ 150 đến 300bp enzyme fragmentase cách sử dụng kit Nebnext dsDNA fragmentase Bộ kit bao gồm: 10X reaction buffer; 100X BSA; dsDNA fragmentase; enzyme fragmentase Các bước tiến hành: Bước 1: Trộn hút μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.g DNA vào ống epperdorf 1ml Bước 2: Thêm 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L 10X reaction buffer, μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L100X BSA 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L ; dsDNA fragmentase Trộn vortex Ủ phút đá Bước 3: Cho thêm 10 μL QIAGEN Protease vào ống phân giải.L enzyme fragmentase trộn ủ 37 0C 30 phút để cắt thành đoạn DNA có kích thước từ 150 đến 300bp Tuỳ theo kích thước muốn cắt ta thay đổi nhiệt độ thời gian ủ Bước 4: Điện di kiểm tra kích thước chuẩn bị thư viện mẫu 2.3.4 Giải trình tự NGS Mẫu máu sau tách chiết phân mảnh DNA, chuẩn bị thư viện mẫu tiến hành giải trình tự hệ thống máy giải trình tự gene hệ NextSeq (Illumina) sử dụng hóa chất NextSeq Mid Output Kết giải trình tự phân tích phần mềm tin-sinh học tự động so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng liệu CHƯƠNG KẾT LUẬN Ứng dụng kĩ thuật giải trình tự hệ (NGS) bệnh nhân Parkinson Ghi nhận trường hợp có mang đột biến gen LRRK2, GBA PLA2G6 thể Bảng 3.1 sau: Bảng 3.1 Một số đột biến gây bệnh ghi nhận bệnh nhân Parkinson STT Gen dbSNP Đột biến GBA rs421016 L444P GBA PLA2G6 rs104886460 rs121908685 LRRK2 rs33949390 c.115+1C>T A80T R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P Đột biến ghi nhận yếu tố di truyền quan trọng gây bệnh PD nhóm người Hán Trung Quốc, Singapore Đài Loan Hiện nghiên cứu bệnh lí Parkinson xác định 23 gene vùng nhiễm sắc thể liên quan đến Parkinson có tính gia đình di truyền theo qui luật Mendel Phân tích sinh hóa ghi nhận sản phẩm gene thường đóng đóng vai trị quan trọng cho q trình kiểm sốt chất lượng protein nội bào dẫn truyền thần kinh, vận chuyển chất tế bào thần kinh Điều cho thấy phức tạp sinh bệnh học PD với cơng cụ NGS phần xác định nguyên nhân di truyền bệnh lý NGS cho phép việc giải trình tự tiết kiệm chi phí hiệu nhiều gen, gen lớn phức tạp Do bước đầu ứng dụng thành công kĩ thuật NGS phát đột biến điểm gây bệnh Parkinson Điều có ý nghĩa quan trọng việc chẩn đốn phân loại nhóm bệnh Parkinson Bên cạnh đó, với kết chẩn đốn gen giúp thuận lợi việc tư vấn cho gia đình, người bệnh, khu trú gen khảo sát, tầm sốt người mang gen bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Đức Minh, Đỗ, Lương Bắc An, Lê Gia Hoàng Linh, Trần Ngọc Tài, Mai Phương Thảo 2022 “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSON” Tạp Chí Y học Việt Nam 508 Nghĩa, Trần Tín, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Hồng Việt, Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Vân Khánh 2023 “4 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Gen Thế hệ Trong xác định đột biến Gen bệnh nhân Parkinson” Tạp Chí Nghiên cứu Y học 164 (3):25-32