Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Trương Quang Toản Sinh viên: Trang 3 CHƯƠNG 1 Trang 4 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Trang 5 CHƯƠNG 2 Trang 6 2.1.Giới thiệu• Virus gây hội chứng đốm trắng WSSV là nguồn bệnh chủ yếu ở tôm, hiện

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Giảng viên: TS Huỳnh Văn Biết

ThS Trương Quang Toản

1

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN VIRUS HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG Ở TÔM (WSSV)

CHƯƠNG 1

3

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

4

CHƯƠNG 2

5TỔNG QUAN

2.1.Giới thiệu

• Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là nguồn bệnh chủ yếu ở tôm, hiện diện ở hầu hết các vùng sản xuất và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi

• Tuy nhiên, một giải pháp thức ăn mới cho

thấy sự giảm mạnh tỷ lệ chết và cải thiện

sự sinh trưởng ở áp lực virus đốm trắng

vừa phải.

6

• Virus hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) là loại virus dsDNA thuộc họ Nimaviridae ảnh hưởng đến tất cả tôm he (Penaeid)

• Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh không chỉ giới hạn ở các đốm trắng trên vỏ ngoài mà có thể đi kèm với sự biến màu nâu đỏ của cơ thể, hôn mê, giảm cho ăn và tăng tỷ lệ tử vong

2.1.Giới thiệu

2.1.1 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh

• Ảnh chụp vi điện tử của các hạt virion được chuẩn bị theo mô

tả, cho thấy rằng một số, nhưng không phải tất cả, các virion

có cấu trúc giống đuôi (Hình 2 a,b) Sau khi cấu trúc vỏ bị phá

vỡ, nucleocapsid mỏng và có hình que với các protein được sắp xếp thành các lớp xếp chồng lên nhau thay vì theo hình

• WSSV là một loại virus dsDNA lớn, có vỏ bọc, có bộ gen

~300kbp Hơn 90% khung đọc mở (ORF) của nó không

có điểm tương đồng với các protein đã biết Các hạt virion WSSV có hình elip với ba lớp: lớp vỏ chứa lipid, lớp vỏ và nucleocapsid bao quanh DNA bộ gen

2.1.1 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh

2.1.Giới thiệu

2.2.2 Phạm vi áp dụng

9

• Tiêu chuẩn này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV)

trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc chi Tôm he (Penaeus) bằng

kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

• Có thể sử dụng tiêu chuẩn này để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng cho các loài giáp xác khác thuộc

Bộ Mười chân (Decapoda)

2.1.Giới thiệu

2.1.1 Nguồn gốc

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

chứng đốm trắng (WSSV)

• Realtime PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử

dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng

hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm

khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của

phân tử DNA mong muốn Áp dụng kỹ thuật Realtime

PCR người dùng không cần thiết phải thực hiện thao tác

điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định sản

2.1.1 Nguồn gốc

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

chứng đốm trắng (WSSV)

• Kỹ thuật Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng

thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát

huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo

thành

• Ngoài ra có thể xác định sự có mặt của trình tự DNA mục

tiêu (Real-time PCR định tính), qPCR còn có thể định

lượng được DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có trong

mẫu ban đầu qua mỗi chu kỳ 11

2.2.2 Thành phần máy Realtime PCR bao gồm:

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

2.2.3.Trình tự thực hiện kỹ thuật Real-time PCR được thực hiện trong một máy luân nhiệt như sau:

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

chứng đốm trắng (WSSV)

• Các mẫu ADN được gắn với mồi có chất phát huỳnh quang

• Các mẫu ADN này sẽ được khuếch đại thông qua phản ứng PCR

• Máy Realtime PCR sẽ chiếu một chùm sáng kích thích có bước sóng nhất định vào các tube chứa

mẫu ADN này

• Các mẫu ADN gắn mồi huỳnh quang sau khi bị kích thích, sẽ phát ra chùm sáng phát xạ

• Bộ thu dữ liệu (detector) bên trong máy luân nhiệt sẽ thu nhận và xác định bước sóng của ánh sáng

huỳnh quang phát ra từ các phân tử huỳnh quang bị kích hoạt trong mẫu

• Phần mềm sẽ phân tích và cho kết quả trên màn hình hiển thị

13

2.2.4 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật real – time PCR

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

chứng đốm trắng (WSSV)

Chu trình nhiệt của real-time PCR cũng có 3 giai đoạn cơ

bản tương tự như PCR bao gồm:

• Giai đoạn biến tính

• Giai đoạn bắt cặp

• Giai đoạn kéo dài

Các giai đoạn này được thực hiện thông qua sự luân chuyển nhiệt độ giữa các chu kỳ Qua mỗi chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận có sự gia tăng tương ứng với lượng bản sao DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa 14

2.2.3.Trình tự thực hiện kỹ thuật Real-time PCR được thực hiện trong một máy

luân nhiệt như sau:

2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội

• Kỹ thuật real-time PCR cũng bao gồm các thành phần

cơ bản như dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn,

cặp mồi và dung dịch đệm

15

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

16

3.1 Phương pháp Real – time PCR

• Dùng kẹp và kéo vô trùng để thao tác cắt lẫy mẫu Chia làm 2 phần: 1 cho xét nghiệm và 1 để lưu trữ

• Mẫu được nghiền nhuyễn trong dung dịch muối đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) theo tỷ lệ thể

tích 1:9 Cho huyễn dịch vào ống nắp vặn vô trùng và đưa vào tủ âm sâu (-80oC) tối thiểu 1 tiếng

trước khi tách chiết

3.1.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

• Mẫu được sử dụng để xét nghiệm với Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real – time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm thường là mẫu tươi, ngoài ra có thể là mẫu được

cố định trong cồn 90%

17

3.1 Phương pháp Real – time PCR

18

3.1.1 Tách chiết:

• Sử dụng các bộ kit thích hợp

3.1.2 Tiến hành phản ứng real – time PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real – time PCR theo phương pháp

Real- time PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F/

WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p

3.1.Đọc kết quả và giải thích

Kết quả của phản ứng Real – time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm được xác

định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct)

Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương và âm Nếu hệ thống mẫu đối chứng đúng thì baseline theo 5% tín

hiệu huỳnh quang và đọc kết quả theo baseline này

• Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính

• Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct trùng khớp với giá trị Ct của mẫu đã

được chuẩn độ trước đó

• Nếu 1 trong 4 hệ thống mẫu đối chứng không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm

19

3.1.1 Đọc kết quả

3.1.Đọc kết quả và giải thích

20

3.1.1.Giải thích:

3.1.Đọc kết quả và giải thích

Giải thích kết quả phản ứng Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm

• Thực hiện 45 chu kỳ:

+ Mẫu có giá trị Ct < 40 là dương tính

+ Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

+ Mẫu có giá trị Ct nằm trong khoảng 40 <= Ct <= 45 được xem là nghi ngờ Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương để khẳng định lại kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

o Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct)

o Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

21

3.1.1.Giải thích:

3.1.Đọc kết quả và giải thích

22

3.1.1.Giải thích:

Chú ý:

o Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm

tương đương khác để khẳng định kết quả

o Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng

âm;

o Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình

chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

CHƯƠNG 4

23

KẾT LUẬN VÀ ĐÁNH

GIÁ

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐÁNH GIÁ

24

4.1 Kết luận

Quy trình Real-time PCR vừa định tính vừa định lượng WSSV trên tôm được ứng dụng rất thành công

tại các phòng thí nghiệm của viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản Dựa trên phương pháp tách chiết

DNA

4.2 Đánh giá

Quy trình có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật nested PCR đang sử dụng gấp 100 lần, đồng thời giảm

thiểu được sai sót dương tính giả và loại trừ được việc sử dụng một số hoá chất độc hại trong quá trình

xét nghiệm Từ đó giúp cho việc phát triển kỹ thuật Real-time PCR trong việc định lượng các tác nhân

gây bệnh khác trên động vật và nuôi trồng thuỷ sản

Tài liệu tham khảo

Tài liệu nước ngoài

1 Čikoš, Š., Bukovská, A., & Koppel, J (2007) Relative quantification of mRNA: comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis BMC molecular biology, 8, 1-14.

2 Fraga, D., Meulia, T., & Fenster, S (2008) Real‐time PCR Current protocols essential laboratory techniques, (1), 10-3.

3 Hossain, A., Nandi, S P., Siddique, M A., Sanyal, S K., Sultana, M., &

Hossain, M A (2015) Prevalence and distribution of White Spot Syndrome Virus in cultured shrimp Letters in applied microbiology, 60(2), 128-134.

4 Merino, I., de la Fuente, A., Domínguz-Gil, M., Eiros, J M., Tedim, A P.,

& Bermejo-Martín, J F (2022) Digital PCR applications for the diagnosis and management of infection in critical care medicine Critical Care, 26(1), 63.

5 Mullis, K B., & Faloona, F A (1987) [21] Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction In Methods in enzymology (Vol 155, pp 335-350) Academic Press.

6 Rebrikov, D V., & Trofimov, D Y (2006) Real-time PCR: a review of approaches to data analysis Applied biochemistry and microbiology, 42, 455-463.

7 https://doi.org/10.1111/raq.12643

CẢM ƠN THẦY VÀ

CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE

26