Trương Quang Toản Sinh viên: Trang 3 CHƯƠNG 1 Trang 4 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Trang 5 CHƯƠNG 2 Trang 6 2.1.Giới thiệu• Virus gây hội chứng đốm trắng WSSV là nguồn bệnh chủ yếu ở tôm, hiện
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN VIRUS HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG Ở TÔM (WSSV Giảng viên: TS Huỳnh Văn Biết Sinh viên: Nguyễn Mai Hân - 21126326 Hoàng Yến Khanh - 21126371 ThS Trương Quang Toản Nguyễn Thị Mỹ Ly - 21126403 Tp.Thủ Đức Nội dung CHƯƠNG CHƯƠNG MỞ ĐẦU TỔNG QUAN CHƯƠNG CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP KẾT LUẬN VÀ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1.Giới thiệu • Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) nguồn bệnh chủ yếu tôm, diện hầu hết vùng sản xuất gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi • Tuy nhiên, giải pháp thức ăn cho thấy giảm mạnh tỷ lệ chết cải thiện sinh trưởng áp lực virus đốm trắng vừa phải 2.1.Giới thiệu 2.1.1 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh • Virus hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) loại virus dsDNA thuộc họ Nimaviridae ảnh hưởng đến tất tơm he (Penaeid) • Các dấu hiệu lâm sàng bệnh không giới hạn đốm trắng vỏ ngồi mà kèm với biến màu nâu đỏ thể, hôn mê, giảm cho ăn tăng tỷ lệ tử vong 2.1.Giới thiệu 2.1.1 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh • WSSV loại virus dsDNA lớn, có vỏ bọc, có gen ~300kbp Hơn 90% khung đọc mở (ORF) khơng có điểm tương đồng với protein biết Các hạt virion WSSV có hình elip với ba lớp: lớp vỏ chứa lipid, lớp vỏ nucleocapsid bao quanh DNA gen • Ảnh chụp vi điện tử hạt virion chuẩn bị theo mô tả, cho thấy số, khơng phải tất cả, virion có cấu trúc giống (Hình a,b) Sau cấu trúc vỏ bị phá vỡ, nucleocapsid mỏng có hình que với protein xếp thành lớp xếp chồng lên thay theo hình xoắn ốc (Hình a,c) 2.1.Giới thiệu 2.2.2 Phạm vi áp dụng • Tiêu chuẩn quy định trình tự, nội dung phương pháp phát virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm lồi tơm thuộc chi Tơm he (Penaeus) kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) • Có thể sử dụng tiêu chuẩn để phát virus gây bệnh đốm trắng cho loài giáp xác khác thuộc Bộ Mười chân (Decapoda) 2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.1.1 Nguồn gốc • Realtime PCR kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phòng thí nghiệm dựa phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm khuếch đại lúc xác định số lượng phân tử DNA mong muốn Áp dụng kỹ thuật Realtime PCR người dùng không cần thiết phải thực thao tác điện di sản phẩm PCR gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch đại 10 2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.2.2 Thành phần máy Realtime PCR bao gồm: Phần quang học Phần luân nhiệt Phần mềm theo dõi phân tích kết 12 2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.2.3.Trình tự thực kỹ thuật Real-time PCR thực máy luân nhiệt sau: • Các mẫu ADN gắn với mồi có chất phát huỳnh quang • Các mẫu ADN khuếch đại thơng qua phản ứng PCR • Máy Realtime PCR chiếu chùm sáng kích thích có bước sóng định vào tube chứa mẫu ADN • Các mẫu ADN gắn mồi huỳnh quang sau bị kích thích, phát chùm sáng phát xạ • Bộ thu liệu (detector) bên máy luân nhiệt thu nhận xác định bước sóng ánh sáng huỳnh quang phát từ phân tử huỳnh quang bị kích hoạt mẫu 13 2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.2.4 Nguyên lý hoạt động kỹ thuật real – time PCR Chu trình nhiệt real-time PCR có giai đoạn tương tự PCR bao gồm: • Giai đoạn biến tính • Giai đoạn bắt cặp • Giai đoạn kéo dài Các giai đoạn thực thông qua luân chuyển nhiệt độ chu kỳ Qua chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận có gia tăng tương ứng với lượng DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa 14 2.1.Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.2.3.Trình tự thực kỹ thuật Real-time PCR thực máy luân nhiệt sau: • Nguyên lý kỹ thuật PCR/ Real-time PCR dựa vào khuếch đại đặc hiệu enzyme Taq Polymerase sở bắt cặp xác primer vào DNA mẫu dNTP tự phát quang probe huỳnh quang tự phận ghi nhận tín hiệu ghi nhận tín hiệu phát từ probe • Kỹ thuật real-time PCR bao gồm thành phần dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi dung dịch đệm 15 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Phương pháp Real – time PCR 3.1.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm: • Mẫu sử dụng để xét nghiệm với Quy trình thực Kỹ thuật Real – time PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm thường mẫu tươi, ngồi mẫu cố định cồn 90% • Dùng kẹp kéo vô trùng để thao tác cắt lẫy mẫu Chia làm phần: cho xét nghiệm để lưu trữ • Mẫu nghiền nhuyễn dung dịch muối đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) theo tỷ lệ thể tích 1:9 Cho huyễn dịch vào ống nắp vặn vơ trùng đưa vào tủ âm sâu trước tách chiết (-80oC) tối thiểu tiếng 17 3.1 Phương pháp Real – time PCR 3.1.1 Tách chiết: • Sử dụng kit thích hợp 3.1.2 Tiến hành phản ứng real – time PCR Phản ứng khuếch đại thực máy real – time PCR theo phương pháp Real- time PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu virus WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F/ WSSV1079R đoạn dò WSSV-p 18 3.1.Đọc kết giải thích 3.1.1 Đọc kết Kết phản ứng Real – time PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct) Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương âm Nếu hệ thống mẫu đối chứng baseline theo 5% tín hiệu huỳnh quang đọc kết theo baseline • Mẫu đối chứng âm phải cho kết âm tính • Mẫu đối chứng dương phải cho kết dương tính có giá trị Ct trùng khớp với giá trị Ct mẫu chuẩn độ trước 19 3.1.Đọc kết giải thích 3.1.1.Giải thích: 20