Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO TIỂU LUẬNỨng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện virus hội chứng đốm trắng ở tơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện virus hội chứng đốm trắng ở tôm (WSSV)

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NHÓM 7 – DH21SHC Niên khóa : 2021 - 2025

Tp Hồ Chí Minh 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện

virus hội chứng đốm trắng ở tôm (WSSV)

ThS Trương Quang Toản Nguyễn Mai Hân - 21126326

Nguyễn Thị Mỹ Ly - 21126403

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 5

2.4 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR trong phát hiện hội chứng đốm trắng (WSSV) 8

2.4.3 Trình tự thực hiện kỹ thuật Realtime PCR được thực hiên trong một máy luân nhiệt như

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐÁNH GIÁ 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

1.1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cuộc sống con người muốn tồn tại, cần thỏa mãn các nhu cầu cơ bản là ăn, mặc, ở, đi lại,… và ước mơ để lại cái gì đó cho đời sau Để có được những yêu tố cơ bản đó, con người phải đấu tranh với tự nhiên và cả trong cộng đồng xã hội Cuộc đấu tranh thể hiện ở mọi lĩnh vực sản xuất, kinh doanh, nghiên cứu phát triển Mục tiêu cuối cùng đó là trở thành động lực thúc đẩy xã hội phát triển

Đối với nước ta, có 3 khu vực nền kinh tế quan trọng, khu vực nông, lâm nghiệp và thủy sản; khu vực công nghiệp và xây dựng; khu vực dịch vụ Đặc biệt là khu vực nông, lâm nghiệp và thủy sản, đây là khu vực có sự giao thương buôn bán cao Mặt hàng thủy sản cũng chiếm một phần tỉ lệ, trong đó có tôm Nhưng mặt hàng tôm cũng gặp những khó khăn khác nhau như thị trường, bệnh tật trên tôm Virus hội chứng đốm trắng

(WSSV) ở tôm là một điển hình về bệnh trên tôm

Tại Việt Nam, WSSVV lần đầu tiên gây ra tình trạng tôm nuôi chết hàng loạt ở Bà Rịa – Vũng Tàu (1993), tiếp đó là ở Phú Yên, Khánh Hòa (1994) và các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (1993-1994) Đặc biệt, năm 2015 bệnh đốm trắng đã xảy ra trên diện rộng, trải dài từ Quảng Ninh đến Cà Mau (tại 254 xã, 78 huyện thuộc 23 tỉnh, thành phố trong cả nước) với tổng diện tích nuôi tôm bị bệnh là hơn 5.200 ha (Cục Thú y, 2015) Trên thế giới, WSSV cũng đã mở rộng phạm vi ảnh hưởng từ Đài Loan (năm 1992) [4], Nhật Bản, Hàn Quốc (năm 1993), Malaysia và Ấn Độ (năm 1994), Indonesia (năm 1995)

và Philippin (năm 1999) – một đất nước nằm cách xa các nước đã xảy ra dịch bệnh vùng Đông và Đông Nam Á Không chỉ xuất hiện ở châu Á, bệnh đốm trắng còn được phát hiện tại Taxes, Bắc Mỹ vào tháng 11/1995, phía nam Carolina năm 1996 Gần đây nhất, bệnh xuất hiện ở hộ nuôi tôm thuộc Saudi Arabia, Mozambique và Madagascar vào năm

2011 Và để tìm hiểu nguyên nhân, phát hiện nhanh chóng và phòng chống bệnh Thì những nhà nghiên cứu đã có nhiều phương pháp khác nhau Trong đó có phương pháp ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện ra bệnh

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu

Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là nguồn bệnh chủ yếu ở tôm, hiện diện ở hầu hết các vùng sản xuất và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi Tuy nhiên, một giải pháp thức ăn mới cho thấy sự giảm mạnh tỷ lệ chết và cải thiện sự sinh trưởng ở áp lực virus đốm trắng vừa phải

Bài tóm tắt lược dịch trong tạp chí allaboutfeed.net do Morgane Piriou biên soạn (2/2019) với tiêu đề “Reducing early impact of WSSV in shrimps” viết về tổn thất do virus đốm trắng trên tôm gây tra và các kết quả thử nghiệm phòng trị bệnh với chế phẩm Đất sét trao đổi-đồng, cho một giải pháp phòng trị bệnh hứa hen trên tôm nuôi Sau đây là những nội dung tóm tắt

2.2 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh

Virus hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) là loại virus dsDNA thuộc họ Nimaviridae ảnh hưởng đến tất cả tôm he (Penaeid) Virus có vỏ bọc này dẫn đến tỷ lệ chết cao trong các trại nuôi tôm trên toàn thế giới và rất dễ lây lan Virus đốm trắng đặc trưng gây ra các đốm trắng nhỏ xuất hiện trên bề mặt trong của lớp bì cuticle, phần vỏ giáp và phần phụ, được cho là kết quả của sự rối loạn ở vỏ bọc này, dẫn đến sự tích tụ muối canxi trong lớp biểu bì cuticle

Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh không chỉ giới hạn ở các đốm trắng trên vỏ ngoài mà

có thể đi kèm với sự biến màu nâu đỏ của cơ thể, hôn mê, giảm cho ăn và tăng tỷ lệ tử vong Trong các ao nuôi tôm bị nhiễm WSSV, nó có thể gây tử vong 100% trong vòng một tuần Ngoài tôm, WSSV còn có nhiều loại vật chủ hoặc vật mang mầm bệnh với hơn

93 loài động vật chân đốt và thậm chí cả giun nhiều tơ nơi quan sát thấy sụ tích tụ WSSV trong đường tiêu hóa tôm WSSV là một loại virus dsDNA lớn, có vỏ bọc, có bộ gen

~300kbp Hơn 90% khung đọc mở (ORF) của nó không có điểm tương đồng với các protein đã biết Các hạt virion WSSV có hình elip với ba lớp: lớp vỏ chứa lipid, lớp vỏ và nucleocapsid bao quanh DNA bộ gen Ảnh chụp vi điện tử của các hạt virion được chuẩn

bị theo mô tả, cho thấy rằng một số, nhưng không phải tất cả, các virion có cấu trúc giống đuôi (Hình 2 a,b) Sau khi cấu trúc vỏ bị phá vỡ, nucleocapsid mỏng và có hình que với các protein được sắp xếp thành các lớp xếp chồng lên nhau thay vì theo hình xoắn ốc (Hình 2 a,c)

Biểu mô của mang, vỏ bì ngoài và dạ dày bị tổn hại nghiêm trọng nhất và các rối loạn chức năng liên quan dẫn đến cái chết trong giai đoạn cuối của sự nhiễm trùng này Các triệu chứng lâm sàng khác bao gồm bì cuticle lỏng lẻo, giảm tiêu thụ thức ăn đột ngột và hôn mê Các đường lây nhiễm phổ biến là thông qua tiếp xúc với mô bị nhiễm bệnh, ăn thịt đồng loại và do các đường nước bị nhiễm trùng Nó cũng có thể được truyền theo chiều dọc cho thế hệ con cái

Một khi virus đã đạt đến ngưỡng nồng độ, sự bùng phát cực kỳ nhanh chóng, buộc nông dân phải tiến hành thu hoạch khẩn cấp Do đó, việc phát hiện sớm virus bằng phương pháp định lượng hoặc PCR lồng nhau cũng như cải thiện hệ miễn dịch của vật chủ và làm giảm sự phát triển của virus có tầm quan trọng căn bản

2.3 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện virut gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm của các loài tôm

thuộc chi Tôm he (Penaeus) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR).

Có thể sử dụng tiêu chuẩn này để phát hiện virut gây bệnh đốm trắng cho các loài giáp

xác khác thuộc Bộ Mười chân (Decapoda).

Theo tiêu chuẩn cơ sở số TCCS 01: 2018/TY-TS của Cục Thú Y về kỹ thuật Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm được Ban hành vào tháng 2 năm 2018: “Quy trình xét nghiệm phát hiện virus WSSV bằng kỹ thuật Real-time PCR do Cục Thú y biên soạn và ban hành được áp dụng tại tất cả các phòng thử nghiệm của các đơn vị trực thuộc Cục Thú y; các phòng thử nghiệm bệnh thủy sản khác căn cứ vào điều kiện phòng thử nghiệm của đơn vị mình tham khảo, áp dụng cho phù hợp, hiệu quả.”

2.4 Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR trong phát hiện hội chứng đốm trắng (WSSV)

2.4.1 Nguồn gốc

Phát minh ra phản ứng chuỗi polymerase (PCR) của Kary Mullis vào năm 1984 được coi là một cuộc cách mạng trong khoa học Tuy nhiên, kết quả phản ứng PCR chỉ được biết sau khi hoàn thành và phải thực hiện một số kỹ thuật đi kèm khác như điện di hay đo

OD (Optical density) Để khắc phục được những vấn đề này, PCR đã được cải tiến thành real-time PCR (hay PCR), đây được coi là một bước nhảy vọt về công nghệ vào cuối thế

kỷ 20, Máy real-time PCR lần đầu tiên được thương mại hóa bởi Applied Biosystems vào năm 1996

Realtime PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm khuếch đại

và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA mong muốn Áp dụng kỹ thuật Realtime PCR người dùng không cần thiết phải thực hiện thao tác điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch đại

Kỹ thuật Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA tạo thành

Ngoài ra có thể xác định sự có mặt của trình tự DNA mục tiêu (Real-time PCR định tính), qPCR còn có thể định lượng được DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có trong mẫu ban đầu qua mỗi chu kỳ

2.4.2 Thành phần máy Realtime PCR bao gồm:

- Phần luân nhiệt

- Phần quang học

- Phần mềm theo dõi và phân tích kết quả

2.4.3 Trình tự thực hiện kỹ thuật Realtime PCR được thực hiên trong một máy luân nhiệt như sau:

- Các mẫu ADN được gắn với mồi có chất phát huỳnh quang

- Các mẫu ADN này sẽ được khuếch đại thông qua phản ứng PCR

- Máy Realtime PCR sẽ chiếu một chùm sáng kích thích có bước sóng nhất định vào các tube chứa mẫu ADN này

- Các mẫu ADN gắn mồi huỳnh quang sau khi bị kích thích, sẽ phát ra chùm sáng phát xạ

- Bộ thu dữ liệu (detector) bên trong máy luân nhiệt sẽ thu nhận và xác định bước sóng của ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các phân tử huỳnh quang bị kích hoạt trong mẫu

- Phần mềm sẽ phân tích và cho kết quả trên màn hình hiển thị

2.4.4 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật real – time PCR

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR/ Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vào DNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe Kỹ thuật real-time PCR cũng bao gồm các thành phần cơ bản như dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi và dung dịch đệm

Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy có thể phát hiện và đo được cường độ tín hiệu từ chất này Khi phản ứng nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất định, cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và tương quan với số lượng bản sao DNA được tạo ra

Chu trình nhiệt của real-time PCR cũng có 3 giai đoạn cơ bản tương tự như PCR bao gồm:

● Giai đoạn biến tính

● Giai đoạn bắt cặp

● Giai đoạn kéo dài

⇨ Các giai đoạn này được thực hiện thông qua sự luân chuyển nhiệt độ giữa các chu

kỳ Qua mỗi chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận có sự gia tăng tương ứng với lượng bản sao DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương pháp Real – time PCR

3.1.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

Mẫu được sử dụng để xét nghiệm với Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real – time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm thường là mẫu tươi, ngoài ra có thể là mẫu được cố dịnh trong cồn 90% Các bộ phận như: Giáp đầu ngực, đuôi, mang, chân bơi, máu, cơ bụng hoặc ấu trùng (của các loài như tôm sú, tôm thẻ chân trắng…) Dùng kẹp và kéo vô trùng để thao tác cắt lẫy mẫu Chia làm 2 phần: 1 cho xét nghiệm

và 1 để lưu trữ

Mẫu được nghiền nhuyễn trong dung dịch muối đệm PBS (Phophate Buffered Saline) theo tỷ lệ thể tích 1:9 Cho huyễn dịch vào ống nắp vặn vô trùng và đưa vào tủ âm sâu

(-80oC) tối thiểu 1 tiếng trước khi tách chiết

3.1.2 Tách chiết:

Sử dụng các bộ kit thích hợp

3.1.3 Tiến hành phản ứng real – time PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy real – time PCR theo phương pháp Real- time PCR khuếch đại đoạn gene đặc hiệu của virus WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F/WSSV1079R và đoạn dò WSSV-p

3.2 Đọc kết quả và giải thích

3.2.1 Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng Real – time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct)

Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương và âm Nếu hệ thống mẫu đối chứng đúng thì baseline theo 5% tín hiệu huỳnh quang và đọc kết quả theo baseline này

● Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính

● Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct trùng khớp với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó

● Nếu 1 trong 4 hệ thống mẫu đối chứng không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm

3.2.2 Giải thích:

Giải thích kết quả phản ứng Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm

● Thực hiện 45 chu kỳ:

+ Mẫu có giá trị Ct < 40 là dương tính

+ Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

+ Mẫu có giá trị Ct nằm trong khoảng 40 <= Ct <= 45 được xem là nghi ngờ Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương để khẳng định lại kết quả

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

o Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct)

o Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct = ± 2

Chú ý:

o Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả

o Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương

và mẫu kiểm chứng âm;

o Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐÁNH GIÁ

4.1 Kết luận

Quy trình Real-time PCR vừa định tính vừa định lượng WSSV trên tôm được ứng dụng rất thành công tại các phòng thí nghiệm của viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản Dựa trên phương pháp tách chiết DNA

4.2 Đánh giá

Quy trình có độ nhaỵ cao hơn so với kỹ thuật nested PCR đang sử dụng gấp 100 lần, đồng thời giảm thiểu được sai sót dương tính giả và loại trừ được việc sử dụng một số hoá chất độc hại trong quá trình xét nghiệm Từ đó giúp cho việc phát triển kỹ thuật Real-time PCR trong việc định lượng các tác nhân gây bệnh khác trên động vật và nuôi trồng thuỷ sản

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Việt Nam

1 https://abt-vn.com/benh-dom-trang-tren-tom-cac-phuong-phap-xet-nghiem/

2 https://sti.vista.gov.vn/file_DuLieu/dataTLKHCN//Vd423-2009/2007/Vd423-2009S02007231.pdf

3 https://drtom.vn/ky-thuat-real-time-pcr-la-gi.html

4 https://vjst.vn/vn/tin-tuc/1558/nghien-cuu-su-nhiem-vi-rut-dom-trang-wssv-o-tom- cang-macrobrachium-nipponense-va-kha-nang-lan-truyen-benh-sang-tom-the-chan-trang-.aspx

Tài liệu nước ngoài

1 Čikoš, Š., Bukovská, A., & Koppel, J (2007) Relative quantification of mRNA:

comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis BMC molecular biology, 8, 1-14.

2 Fraga, D., Meulia, T., & Fenster, S (2008) Real‐time PCR Current protocols essential laboratory techniques, (1), 10-3.

3 Hossain, A., Nandi, S P., Siddique, M A., Sanyal, S K., Sultana, M., & Hossain,

M A (2015) Prevalence and distribution of White Spot Syndrome Virus in

cultured shrimp Letters in applied microbiology, 60(2), 128-134.

4 Merino, I., de la Fuente, A., Domínguz-Gil, M., Eiros, J M., Tedim, A P., & Bermejo-Martín, J F (2022) Digital PCR applications for the diagnosis and

management of infection in critical care medicine Critical Care, 26(1), 63.

5 Mullis, K B., & Faloona, F A (1987) [21] Specific synthesis of DNA in vitro via

a polymerase-catalyzed chain reaction In Methods in enzymology (Vol 155, pp

335-350) Academic Press

6 Rebrikov, D V., & Trofimov, D Y (2006) Real-time PCR: a review of

approaches to data analysis Applied biochemistry and microbiology, 42, 455-463.

7 https://doi.org/10.1111/raq.12643