Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO TIỂU LUẬNỨng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện virus hội chứng đốm trắng ở tơm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN Ứng dụng kỹ thuật PCR phát virus hội chứng đốm trắng tôm (WSSV) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NHĨM – DH21SHC Niên khóa : 2021 - 2025 Tp Hồ Chí Minh 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN Ứng dụng kỹ thuật PCR phát virus hội chứng đốm trắng tôm (WSSV) Hướng dẫn khoa học Sinh viên TS Huỳnh Văn Biết Hoàng Yến Khanh - 21126371 ThS Trương Quang Toản Nguyễn Mai Hân - 21126326 Nguyễn Thị Mỹ Ly - 21126403 MỤC LỤC MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Tính cấp thiết đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN .5 2.1 Giới thiệu 2.2 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh 2.3 Phạm vi áp dụng 2.4 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.4.1 Nguồn gốc 2.4.2 Thành phần máy Realtime PCR bao gồm: 2.4.3 Trình tự thực kỹ thuật Realtime PCR thực hiên máy luân nhiệt sau: 2.4.4 Nguyên lý hoạt động kỹ thuật real – time PCR 10 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Phương pháp Real – time PCR 11 3.1.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm: 11 3.1.2 Tách chiết: 11 3.1.3 Tiến hành phản ứng real – time PCR 11 3.2 Đọc kết giải thích 12 3.2.1 Đọc kết 12 3.2.2 Giải thích: 12 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐÁNH GIÁ 14 4.1 Kết luận 14 4.2 Đánh giá 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Tính cấp thiết đề tài Cuộc sống người muốn tồn tại, cần thỏa mãn nhu cầu ăn, mặc, ở, lại,… ước mơ để lại cho đời sau Để có yêu tố đó, người phải đấu tranh với tự nhiên cộng đồng xã hội Cuộc đấu tranh thể lĩnh vực sản xuất, kinh doanh, nghiên cứu phát triển Mục tiêu cuối trở thành động lực thúc đẩy xã hội phát triển Đối với nước ta, có khu vực kinh tế quan trọng, khu vực nông, lâm nghiệp thủy sản; khu vực công nghiệp xây dựng; khu vực dịch vụ Đặc biệt khu vực nông, lâm nghiệp thủy sản, khu vực có giao thương buôn bán cao Mặt hàng thủy sản chiếm phần tỉ lệ, có tơm Nhưng mặt hàng tơm gặp khó khăn khác thị trường, bệnh tật tôm Virus hội chứng đốm trắng (WSSV) tơm điển hình bệnh tôm Tại Việt Nam, WSSVV lần gây tình trạng tơm ni chết hàng loạt Bà Rịa – Vũng Tàu (1993), tiếp Phú n, Khánh Hịa (1994) tỉnh Đồng sơng Cửu Long (1993-1994) Đặc biệt, năm 2015 bệnh đốm trắng xảy diện rộng, trải dài từ Quảng Ninh đến Cà Mau (tại 254 xã, 78 huyện thuộc 23 tỉnh, thành phố nước) với tổng diện tích ni tơm bị bệnh 5.200 (Cục Thú y, 2015) Trên giới, WSSV mở rộng phạm vi ảnh hưởng từ Đài Loan (năm 1992) [4], Nhật Bản, Hàn Quốc (năm 1993), Malaysia Ấn Độ (năm 1994), Indonesia (năm 1995) Philippin (năm 1999) – đất nước nằm cách xa nước xảy dịch bệnh vùng Đông Đông Nam Á Không xuất châu Á, bệnh đốm trắng phát Taxes, Bắc Mỹ vào tháng 11/1995, phía nam Carolina năm 1996 Gần nhất, bệnh xuất hộ nuôi tôm thuộc Saudi Arabia, Mozambique Madagascar vào năm 2011 Và để tìm hiểu nguyên nhân, phát nhanh chóng phịng chống bệnh Thì nhà nghiên cứu có nhiều phương pháp khác Trong có phương pháp ứng dụng kỹ thuật PCR để phát bệnh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) nguồn bệnh chủ yếu tôm, diện hầu hết vùng sản xuất gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi Tuy nhiên, giải pháp thức ăn cho thấy giảm mạnh tỷ lệ chết cải thiện sinh trưởng áp lực virus đốm trắng vừa phải Bài tóm tắt lược dịch tạp chí allaboutfeed.net Morgane Piriou biên soạn (2/2019) với tiêu đề “Reducing early impact of WSSV in shrimps” viết tổn thất virus đốm trắng tôm gây tra kết thử nghiệm phòng trị bệnh với chế phẩm Đất sét trao đổi-đồng, cho giải pháp phòng trị bệnh hứa hen tôm nuôi Sau nội dung tóm tắt 2.2 Đặc điểm virus đốm trắng gây bệnh Virus hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus WSSV) loại virus dsDNA thuộc họ Nimaviridae ảnh hưởng đến tất tơm he (Penaeid) Virus có vỏ bọc dẫn đến tỷ lệ chết cao trại nuôi tơm tồn giới dễ lây lan Virus đốm trắng đặc trưng gây đốm trắng nhỏ xuất bề mặt lớp bì cuticle, phần vỏ giáp phần phụ, cho kết rối loạn vỏ bọc này, dẫn đến tích tụ muối canxi lớp biểu bì cuticle Các dấu hiệu lâm sàng bệnh khơng giới hạn đốm trắng vỏ mà kèm với biến màu nâu đỏ thể, hôn mê, giảm cho ăn tăng tỷ lệ tử vong Trong ao nuôi tôm bị nhiễm WSSV, gây tử vong 100% vịng tuần Ngồi tơm, WSSV cịn có nhiều loại vật chủ vật mang mầm bệnh với 93 lồi động vật chân đốt chí giun nhiều tơ nơi quan sát thấy sụ tích tụ WSSV đường tiêu hóa tơm WSSV loại virus dsDNA lớn, có vỏ bọc, có gen ~300kbp Hơn 90% khung đọc mở (ORF) khơng có điểm tương đồng với protein biết Các hạt virion WSSV có hình elip với ba lớp: lớp vỏ chứa lipid, lớp vỏ nucleocapsid bao quanh DNA gen Ảnh chụp vi điện tử hạt virion chuẩn bị theo mô tả, cho thấy số, khơng phải tất cả, virion có cấu trúc giống (Hình a,b) Sau cấu trúc vỏ bị phá vỡ, nucleocapsid mỏng có hình que với protein xếp thành lớp xếp chồng lên thay theo hình xoắn ốc (Hình a,c) Biểu mơ mang, vỏ bì ngồi dày bị tổn hại nghiêm trọng rối loạn chức liên quan dẫn đến chết giai đoạn cuối nhiễm trùng Các triệu chứng lâm sàng khác bao gồm bì cuticle lỏng lẻo, giảm tiêu thụ thức ăn đột ngột hôn mê Các đường lây nhiễm phổ biến thông qua tiếp xúc với mô bị nhiễm bệnh, ăn thịt đồng loại đường nước bị nhiễm trùng Nó truyền theo chiều dọc cho hệ Một virus đạt đến ngưỡng nồng độ, bùng phát nhanh chóng, buộc nông dân phải tiến hành thu hoạch khẩn cấp Do đó, việc phát sớm virus phương pháp định lượng PCR lồng cải thiện hệ miễn dịch vật chủ làm giảm phát triển virus có tầm quan trọng 2.3 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định trình tự, nội dung phương pháp phát virut gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm bố mẹ, tôm giống, tơm ni thương phẩm lồi tơm thuộc chi Tôm he (Penaeus) kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Có thể sử dụng tiêu chuẩn để phát virut gây bệnh đốm trắng cho loài giáp xác khác thuộc Bộ Mười chân (Decapoda) Theo tiêu chuẩn sở số TCCS 01: 2018/TY-TS Cục Thú Y kỹ thuật Realtime PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm Ban hành vào tháng năm 2018: “Quy trình xét nghiệm phát virus WSSV kỹ thuật Real-time PCR Cục Thú y biên soạn ban hành áp dụng tất phòng thử nghiệm đơn vị trực thuộc Cục Thú y; phòng thử nghiệm bệnh thủy sản khác vào điều kiện phịng thử nghiệm đơn vị tham khảo, áp dụng cho phù hợp, hiệu quả.” 2.4 Ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR phát hội chứng đốm trắng (WSSV) 2.4.1 Nguồn gốc Phát minh phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Kary Mullis vào năm 1984 coi cách mạng khoa học Tuy nhiên, kết phản ứng PCR biết sau hoàn thành phải thực số kỹ thuật kèm khác điện di hay đo OD (Optical density) Để khắc phục vấn đề này, PCR cải tiến thành real-time PCR (hay PCR), coi bước nhảy vọt công nghệ vào cuối kỷ 20, Máy real-time PCR lần thương mại hóa Applied Biosystems vào năm 1996 Realtime PCR kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phịng thí nghiệm dựa phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction – PCR), nhằm khuếch đại lúc xác định số lượng phân tử DNA mong muốn Áp dụng kỹ thuật Realtime PCR người dùng không cần thiết phải thực thao tác điện di sản phẩm PCR gel agarose để xác định sản phẩm sau khuếch đại Kỹ thuật Real time PCR gồm hai trình diễn đồng thời: nhân DNA phản ứng PCR đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận nghịch với số đoạn DNA tạo thành Ngồi xác định có mặt trình tự DNA mục tiêu (Real-time PCR định tính), qPCR cịn định lượng DNA mục tiêu (qPCR định lượng) có mẫu ban đầu qua chu kỳ 2.4.2 Thành phần máy Realtime PCR bao gồm: - Phần luân nhiệt - Phần quang học - Phần mềm theo dõi phân tích kết 2.4.3 Trình tự thực kỹ thuật Realtime PCR thực hiên máy luân nhiệt sau: - Các mẫu ADN gắn với mồi có chất phát huỳnh quang - Các mẫu ADN khuếch đại thông qua phản ứng PCR - Máy Realtime PCR chiếu chùm sáng kích thích có bước sóng định vào tube chứa mẫu ADN - Các mẫu ADN gắn mồi huỳnh quang sau bị kích thích, phát chùm sáng phát xạ - Bộ thu liệu (detector) bên máy luân nhiệt thu nhận xác định bước sóng ánh sáng huỳnh quang phát từ phân tử huỳnh quang bị kích hoạt mẫu - Phần mềm phân tích cho kết hình hiển thị 2.4.4 Nguyên lý hoạt động kỹ thuật real – time PCR Nguyên lý kỹ thuật PCR/ Real-time PCR dựa vào khuếch đại đặc hiệu enzyme Taq Polymerase sở bắt cặp xác primer vào DNA mẫu dNTP tự phát quang probe huỳnh quang tự phận ghi nhận tín hiệu ghi nhận tín hiệu phát từ probe Kỹ thuật real-time PCR bao gồm thành phần dNTP, DNA Polymerase, DNA mạch khuôn, cặp mồi dung dịch đệm Điểm khác biệt real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang để máy phát đo cường độ tín hiệu từ chất Khi phản ứng nhân xảy tới chu kỳ định, cường độ tín hiệu huỳnh quang bắt đầu có gia tăng rõ rệt tương quan với số lượng DNA tạo Chu trình nhiệt real-time PCR có giai đoạn tương tự PCR bao gồm: ● Giai đoạn biến tính ● Giai đoạn bắt cặp ● Giai đoạn kéo dài ⇨ Các giai đoạn thực thông qua luân chuyển nhiệt độ chu kỳ Qua chu kỳ, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận có gia tăng tương ứng với lượng DNA nhân lên theo cấp số lũy thừa 10 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp Real – time PCR 3.1.1 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm: Mẫu sử dụng để xét nghiệm với Quy trình thực Kỹ thuật Real – time PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm thường mẫu tươi, ngồi mẫu cố dịnh cồn 90% Các phận như: Giáp đầu ngực, đuôi, mang, chân bơi, máu, bụng ấu trùng (của lồi tơm sú, tơm thẻ chân trắng…) Dùng kẹp kéo vô trùng để thao tác cắt lẫy mẫu Chia làm phần: cho xét nghiệm để lưu trữ Mẫu nghiền nhuyễn dung dịch muối đệm PBS (Phophate Buffered Saline) theo tỷ lệ thể tích 1:9 Cho huyễn dịch vào ống nắp vặn vô trùng đưa vào tủ âm sâu (80oC) tối thiểu tiếng trước tách chiết 3.1.2 Tách chiết: 11 Sử dụng kit thích hợp 3.1.3 Tiến hành phản ứng real – time PCR Phản ứng khuếch đại thực máy real – time PCR theo phương pháp Real- time PCR khuếch đại đoạn gene đặc hiệu virus WSSV sử dụng cặp mồi đặc hiệu WSSV1011F/WSSV1079R đoạn dò WSSV-p 3.2 Đọc kết giải thích 3.2.1 Đọc kết Kết phản ứng Real – time PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct) Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương âm Nếu hệ thống mẫu đối chứng baseline theo 5% tín hiệu huỳnh quang đọc kết theo baseline ● Mẫu đối chứng âm phải cho kết âm tính ● Mẫu đối chứng dương phải cho kết dương tính có giá trị Ct trùng khớp với giá trị Ct mẫu chuẩn độ trước ● Nếu hệ thống mẫu đối chứng khơng phải thực lại xét nghiệm 3.2.2 Giải thích: 12 Giải thích kết phản ứng Real-time PCR phát virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm ● Thực 45 chu kỳ: + Mẫu có giá trị Ct < 40 dương tính + Mẫu khơng có giá trị Ct âm tính + Mẫu có giá trị Ct nằm khoảng 40