Trang 1 Nghiên cứu khả năng ứng dụng lâm sàng của xét nghiệm gene trên bệnh nhân ParkinsonGVHD: Ts.. Huỳnh Văn BiếtNhóm: 02KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 2 Trần Quế Anh21126279Trần Ngọc
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Nghiên cứu khả ứng dụng lâm sàng xét nghiệm gene bệnh nhân Parkinson GVHD: Ts Huỳnh Văn Biết Nhóm: 02 Thành viên Trần Quế Anh 21126279 Trần Ngọc Cẩm Giang 21126318 Đỗ Phương Uyên 21126570 NỘI DUNG Đặt vấn đề 0 Kết luận Xác định gen phương pháp 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Parkinson ? Bệnh lý thoái hoá thần kinh trung ương - Các đặc điểm run tính trạng, yếu cơ, giảm vận động, ổn định tư thế, sa sút trí tuệ… - Các yếu tố di truyền, môi trường, stress, rối loạn chức ty thể…đều nghiên cứu có liên quan đến phát triển bệnh - Đến có 27 gen locus có phát có liên quan đến bệnh PD đặt tên gen “PARK” - CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC SỬ DỤNG - Các phương pháp PCR (Polymerase chain reaction): phát số đột biến biết trước lượng gen giới hạn nhận biết đột biến - Giải trình tự Sanger: phản ứng giải trình tự mảnh gen; không phát đột biến thêm đoạn lớn, chuyển đoạn - Vậy nên việc ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS – Next generatio sequencing) giúp: +Giải trình tự đồng thời hàng triệu mảnh gen phản ứng + Phân tích kết cách nhanh chóng, cho hiệu cao, giá thành thấp => Kỹ thuật NGS giúp cho nghiên cứu gen đột biến bệnh Parkinson nhằm tìm yếu tố di truyền gây bệnh nhanh chóng hiệu XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚi Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các bước chuẩn bị Vật liệu nghiên cứu ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Những bệnh nhận chẩn đoán mắc bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn Hiệp hội Parkinson Rối loạn vận động quốc tế (International Parkinson and Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson’s disease) khơng có bệnh tâm thần kèm theo, điều trị thuốc an thần,… VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Ống nghiệm EDTA - Bộ kit QIAGEN - Máy quang phổ NanoDrop 2000c - Bộ kit Nebnext dsDNAfragmentase - Máy giải trình tự gen hệ NextSeq (Illumin ) - Bộ hoá chất NextSeq Mid Output kit - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Lấy xử lý mẫu: Lấy 2ml máu bảo quản ống EDTA nhiệt độ 40C không 24 trước tiến hành tách chiết DNA Ống nghiệm EDTA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Tách chiết DNA + Chuẩn bị hoá chất: QIAGEN Protase, Wash Buffer 1, Wash Buffer + Quy trình phân lập lọc DNA gen: B1: Hút 20 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L QIAGEN Protease; 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L mẫu máu 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L Lysis Buffer vào ống phân giải Trộn ủ 56°C 10 phút 10 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B2: Thêm 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L ethanol (96-100%) trộn Hút toàn dung dịch cho cột quay QIAamp Mini Ly tâm khoảng 8000rpm phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào ống rửa thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc 11 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B3: Thêm 500 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L Wash Bufffer Ly tâm khoảng 8000rpm phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào ống rửa thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc Tương tự tiếp tục với Wash Bufffer nhiên ta ly tâm 14000rpm phút 12 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B4: Thêm 50 đến 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L Elution Buffer vào tâm cột quay QIAamp Mini Đậy nắp ủ nhiệt độ phòng phút Ly tâm 8.000 rpm phút để rửa giải DNA Bỏ cột quay QIAamp Mini giữ lại dung dịch sau ly tâm Kiểm tra độ tinh nồng độ 13 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phân mảnh DNA kit Nebnext dsDNA fragmentase chuẩn bị thư viện mẫu + Bộ kit bao gồm: 10X reaction buffer; 100X BSA; dsDNA fragmentase; enzyme fragmentase + Các bước tiến hành: B1: Hút μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 g DNA vào ống epperdorf 1ml B2: Thêm 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L 10X reaction buffer, μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L100X BSA 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L ; dsDNA fragmentase Trộn vortex Ủ phút đá B3: Thêm 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu 200 L enzyme fragmentase trộn ủ 370C 30 phút B4: Điện di kiểm tra kích thước chuẩn bị thư viện mẫu 14 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Giải trình tự NGS + Mẫu máu sau tách chiết, phân mảnh chuẩn bị thư viện mẫu sẽ tiến hành giải trình tự gen phương pháp Illumina + Kết giải trình tự sẽ phân tích phần mềm tin-sinh học sẽ tự động so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng liệu 15 03 KẾT LUẬN 16 STT Gen GBA GBA dbSNP rs421016 rs104886460 Đột biến L444P c.115+1C>T PLA2G6 rs121908685 A80T LRRK2 rs33949390 R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P LRRK2 rs33949390 R1628P Bảng 3.1 Một số đột biến gây bệnh ghi nhận bệnh nhân Parkinson 17 - Ứng dụng kĩ thuật giải trình tự hệ (NGS) bệnh nhân Parkinson ghi nhận trường hợp có mang đột biến gen LRRK2, GBA PLA2G6 bảng 3.1 - Các đột biến ghi nhận yếu tố di truyền quan trọng gây bệnh PD nhóm người Hán Trung Quốc, Singapore Đài Loan - Các cơng cụ NGS phần xác định nguyên nhân di truyền bệnh lý chỉ NGS cho phép việc giải trình tự tiết kiệm chi phí hiệu nhiều gen, gen lớn phức tạp - Với kết chẩn đoán gen giúp thuận lợi việc tư vấn cho gia đình, người bệnh, khu trú gen khảo sát, tầm sốt người mang gen bệnh 18