Báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật cnsh

Trang 1 Nghiên cứu khả năng ứng dụng lâm sàng của xét nghiệm gene trên bệnh nhân ParkinsonGVHD: Ts.. Huỳnh Văn BiếtNhóm: 02KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 2 Trần Quế Anh21126279Trần Ngọc

Nghiên cứu khả năng ứng dụng lâm sàng của xét nghiệm gene

trên bệnh nhân Parkinson

GVHD: Ts Huỳnh Văn BiếtNhóm: 02

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

Trần Quế Anh 21126279 Trần Ngọc Cẩm Giang 21126318

Đỗ Phương Uyên 21126570

Thành viên

0 3

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

0

1

Bệnh Parkinson là

gì ?

- Bệnh lý thoái hoá thần kinh trung ương.

- Các đặc điểm như run tính trạng, yếu cơ, giảm vận động, mất ổn định tư thế, sa sút trí tuệ…

- Các yếu tố như di truyền, môi trường, stress, rối loạn chức năng ty thể…đều được nghiên cứu có liên quan đến sự phát triển của bệnh.

- Đến nay đã có 27 gen và locus có được phát hiện có liên quan đến bệnh PD và được đặt tên là gen “PARK”

3

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC SỬ DỤNG

- Các phương pháp PCR (Polymerase chain reaction): chỉ phát hiện một số ít đột biến đã được biết trước trên một lượng gen giới hạn và không thể nhận biết những đột biến mới.

- Giải trình tự Sanger: mỗi phản ứng chỉ giải được trình tự một mảnh gen; không phát hiện đột biến thêm hoặc mất đoạn lớn, chuyển đoạn

- Vậy nên việc ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS – Next generatio

sequencing) giúp:

+Giải trình tự đồng thời hàng triệu mảnh gen trong một phản ứng.

+ Phân tích kết quả một cách nhanh chóng, cho hiệu quả cao, giá thành thấp hơn

=> Kỹ thuật NGS giúp cho nghiên cứu gen đột biến ở bệnh Parkinson nhằm tìm ra các yếu

tố di truyền gây bệnh nhanh chóng và hiệu quả hơn.

XÁC ĐỊNH GEN ĐỘT BIẾN BỆNH PARKINSON BẰNG PHƯƠNG

PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚi

0

2

5

Các bước chuẩn bị

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Những bệnh nhận được chẩn đoán mắc bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Parkinson và Rối loạn vận động quốc tế (International Parkinson and Movement Disorder Society Clinical Diagnostic Criteria for Parkinson’s disease) không có bệnh tâm thần kèm theo, đang điều trị bằng thuốc an thần,…

7

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Ống nghiệm EDTA

- Bộ kit QIAGEN

- Máy quang phổ NanoDrop 2000c

- Bộ kit Nebnext dsDNAfragmentase

- Máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq (Illumin )

- Bộ hoá chất NextSeq Mid Output kit.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Lấy và xử lý mẫu: Lấy 2ml máu bảo quản trong ống EDTA ở nhiệt

độ 40C không quá 24 giờ trước khi tiến hành tách chiết DNA

Ống nghiệm EDTA

9

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tách chiết DNA

+ Chuẩn bị hoá chất: QIAGEN Protase, Wash Buffer 1, Wash Buffer 2

+ Quy trình phân lập và lọc DNA bộ gen:

B1: Hút lần lượt 20 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L QIAGEN Protease; 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L mẫu máu và 200

μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L Lysis Buffer vào ống phân giải Trộn đều ủ ở 56°C trong 10 phút

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

B2: Thêm 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L ethanol (96-100%) trộn đều Hút toàn bộ dung dịch cho cột quay QIAamp Mini Ly tâm ở khoảng 8000rpm trong một phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào một ống rửa mới và thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc

11

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

B3: Thêm 500 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L Wash Bufffer 1 Ly tâm ở khoảng 8000rpm trong một phút Đặt cột quay QIAamp Mini vào một ống rửa mới và thải bỏ ống rửa có chứa chất lọc Tương tự tiếp tục với Wash Bufffer 2 tuy nhiên ta ly tâm ở 14000rpm trong 3 phút

B4: Thêm 50 đến 200 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L Elution Buffer vào tâm của cột quay

QIAamp Mini Đậy nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong một phút Ly tâm ở 8.000 rpm trong một phút để rửa giải DNA Bỏ cột quay QIAamp Mini và giữ lại dung dịch sau ly tâm Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

13

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phân mảnh DNA bằng bộ kit Nebnext dsDNA fragmentase và chuẩn

bị thư viện mẫu.

+ Bộ kit bao gồm: 10X reaction buffer; 100X BSA; dsDNA fragmentase; enzyme fragmentase

+ Các bước tiến hành:

B1: Hút 5 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 g DNA vào ống epperdorf 1ml

B2: Thêm 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L 10X reaction buffer, 1 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L100X BSA và 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L ; dsDNA fragmentase Trộn đều bằng vortex Ủ 5 phút trên đá

B3: Thêm 10 μL QIAGEN Protease; 200 μL mẫu máu và 200 L enzyme fragmentase trộn đều và ủ ở 370C trong

30 phút

B4: Điện di kiểm tra kích thước rồi chuẩn bị thư viện mẫu

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Giải trình tự NGS

+ Mẫu máu sau khi được tách chiết, phân mảnh và chuẩn bị thư viện mẫu sẽ được tiến hành giải trình tự gen bằng phương pháp Illumina

+ Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm tin-sinh học

và sẽ tự động so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng dữ liệu

15

KẾT LUẬN

03

- Ứng dụng kĩ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) trên bệnh nhân

Parkinson ghi nhận được các trường hợp có mang đột biến trên các gen LRRK2, GBA và PLA2G6 như bảng 3.1

- Các đột biến được ghi nhận này là yếu tố di truyền quan trọng gây

bệnh PD ở nhóm người Hán tại Trung Quốc, Singapore và Đài Loan

- Các công cụ NGS có thể phần nào xác định được nguyên nhân di

truyền của bệnh lý này vì chỉ NGS mới cho phép việc giải trình tự tiết

kiệm chi phí và hiệu quả nhiều gen, các gen lớn và phức tạp

- Với kết quả chẩn đoán gen giúp thuận lợi trong việc tư vấn cho gia

đình, người bệnh, khu trú gen khảo sát, tầm soát người mang gen

bệnh

Đức Minh, Đỗ, Lương Bắc An, Lê Gia Hoàng Linh, Trần Ngọc Tài, và Mai Phương Thảo 2022 “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT

GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH PARKINSON” Tạp Chí Y học Việt

Nam 508 Nghĩa, Trần Tín, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Hoàng Việt, Phạm Lê Anh Tuấn, và Trần Vân Khánh 2023 “4 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự Gen Thế hệ mới Trong xác định đột biến Gen ở bệnh nhân Parkinson” Tạp Chí Nghiên cứu Y học

164 :25-32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

19

THANK YOU FOR LISTENING