Bao cao thiet bi

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Tiểu luận môn học Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Tiểu luận môn học

Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium Dimidiatum gây bệnh đốm trắng

trên thanh long

Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : Thiết bị kỹ thuật công nghệ sinh học Nhóm thực hiện : Nhóm 7

Niên khóa : 2023 - 2024

TP Thủ Đức, tháng 10 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Tiểu luận môn học

Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium Dimidiatum gây bệnh đốm trắng

trên thanh long

Môn học : Thiết bị kỹ thuật công nghệ sinh học Giảng viên : TS Huỳnh Văn Biết

ThS Trương Quang Toản Nhóm thực hiện: Nhóm 7

Thạch Vinh 21126259 Ngô Ngọc Hải 21126324 Trần Thị Kim Ngân 21126419

TP Thủ Đức, tháng 10 năm 2023

Mục lục

Chương 1: Mở đầu 6

1.1Đặc vấn đề 6

1.2 Mục tiêu đề tài 6

Chương 2: Tổng quan tài liệu 7

2.1 Cây thanh long 7

2.1.1 Đặc điểm 7

2.1.2 Đặc tính sinh học 7

2.1.3 Điều kiện sinh thái 7

2.2 Vi khuẩn Bacilius 8

2.2.1 Đặc điểm 8

2.2.2 Đặc tính sinh học 9

2.3 Neoscytalidium dimidiatum: 9

2.3.1 Đặc điểm 9

2.3.2 Điều kiện phát triển 10

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

3.1 Vật liệu nghiên cứu 11

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

3.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1.Phương pháp phân lập, làm thuần N.dimidiatum, Bacillus 11

3.2.3 Phương pháp thử nghiệm khả năng gây bệnh của chủng N dimidiatum phân lập được: 13

3.2.4 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với nấm bệnh N dimidiatum: 14

Chương 4 Kết quả và kết luận 15

4.1 Phân lập và sàng lọc chủng vi nấm N dimidiatum: 15

4.2 Kết quả thử nghiệm khả năng gây bệnh của chủng N dimidiatum phân lập được: 15

4.3 Khả năng kháng N dimidiatum gây bệnh đốm trắng của các chủng Bacillus phân lập 17

4.4 Kết quả định danh bằng phương pháp MALDI – TOF chủng Bacillus tuyển

chọn 19 4.5 Kết luận 19 Tài liệu tham khảo 20

Chương 1: Mở đầu

1.1Đặc vấn đề

Như chúng ta đã biết thì cây thanh long là một một loại nông sản có tiềm lực phát triển kinh tế cao tạo nguồn thu nhập cao cho bà con nông dân chuyên trồng loại nông sản này đặt biệt là ở những vùng có sản lượng thanh long cao như : Bình Thuận , Ninh Thuận và Long An ,Tiền Giang và một số tỉnh ở ĐBSCL Quả thanh long có vị ngọt mát và hơi chua Trong quả chín chứa trên 80% nước, độ Brix từ 13-15, hàm lượng đường tổng số 11-14%, hàm lượng chất đạm, chất béo và axit hữu cơ thấp, tương đối nhiều chất khoáng (Kali, Canxi, Magiê, Phốtpho) và

Vitamin, đặc biệt là Vitamin c (8 mg/lOOg thịt quả) Tuy nhiên hiện nay, tình hình dịch bệnh trên thanh long diễn ra nghiêm trọng, trong đó đáng chú ý là bệnh đốm trắng Theo ghi nhận của Viện Cây ăn quả miền Nam thì bệnh đốm trắng xuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình Thuận và Tiền Giang, và từ năm 2011 đến nay bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn Mức độ bệnh ở các vườn, địa phương khác nhau, có những vườn bị nhiễm quả không thể thu hoạch được, thiệt hại rất lớn cho nhà vườn

Bệnh đốm trắng hay còn được gọi dưới các tên “đốm nâu”, “đốm tắc kè”,

“bệnh ma”, “bệnh loét” hay “thối mục”, là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn

về năng suất và chất lượng thanh long Nguyên nhân của bệnh được xác định là do

vi nấm Neoscytalydium dimidiatum Để khắc phục tình trạng này thì nhiều nghiên cứu đã được sử dụng trông đó có việc sử dụng vi khuẩn như Bacillus sp để ức chế

một số loài nấm bệnh trên cây trồng đã cho thấy tính hiệu quả của nó [5] - [8]…,

điều này cũng cho thấy dòng Bacillus sp có tiềm năng trong việc ức chế nấm bệnh

N dimidiatum trên thanh long

1.2 Mục tiêu đề tài

Trong nghiên cứu vi khuẩn Bacilius sao khi được làm thuần sẽ gửi định

danh bằng phương pháp sử dụng khối phổ protein (MALDI- TOF) MALDI-TOF

là một trong những phương pháp proteomics mạnh mẽ nhất và là cách nhanh

chóng, chính xác và tiết kiệm để xác định và phân biệt các vi khuẩn, chẳng hạn như vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và nấm Công nghệ này tạo ra các dấu vân tay phổ khối riêng cho từng vi sinh vật và do đó có thể xác định chúng một cách chính xác ở cấp độ chi và loài

Chương 2: Tổng quan tài liệu

2.1 Cây thanh long

2.1.1 Đặc điểm

Quả thanh long có vị ngọt mát và hơi chua Trong quả chín chứa trên 80% nước, độ Brix từ 13-15, hàm lượng đường tổng số 11-14%, hàm lượng chất đạm, chất béo và axit hữu cơ thấp, tương đối nhiều chất khoáng (Kali, Canxi, Magiê, Phốtpho) và Vitamin, đặc biệt là Vitamin c (8 mg/lOOg thịt quả)

Mùa thu hoạch thanh long ở Nam Bộ kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10, rộ nhất từ tháng 5-8 Tuổi thọ trung bình 10 – 12 năm, nếu đất tốt và được chăm bón chu đáo có thể dài hơn

2.1.2 Đặc tính sinh học

Cây thanh long thuộc họ Xương rồng (Cactaceae)

Là loại cây thân bò lan: Thân và cành màu xanh, có 3 cạnh, bìa cạnh có nhiều thùy nhỏ tạo thành hình gợn sóng Đáy mỗi thùy có 3 – 5 gai nhỏ

Rễ cây thanh long chứa rất ít nước nên giúp cây chịu hạn Có 2 loại rễ địa sinh và rễ khí sinh

Rễ địa sinh là loại rễ chính, phát triển từ phần lõi của gốc hom bám xuống đất để hút chất dinh dưỡng nuôi cây

Rễ khí sinh là loại rễ phụ mọc dọc theo thân cây để bám vào cây choái giúp cây leo lên giá đỡ Những rễ khí sinh phía gốc thân gần đất sẽ đi dần xuống đất thành rễ chính

Hoa thanh long là loại hoa lưỡng tính, tương đối lớn, dài trung bình 25 -35

cm, nhiều lá đài và cánh hoa dính nhau thành ống

2.1.3 Điều kiện sinh thái

Khí hậu

Thanh long là cây có nguồn gốc vùng nhiệt đới khô nên chịu nóng và chịu hạn tốt Nhiệt độ thích hợp nhất từ 21- 29°c, tối đa không quá 40°c Đặc biệt thanh long rất yếu chịu lạnh, không chịu ẩm độ cao và mưa nhiều Thích hợp trồng ở vùng có lượng mưa trung bình và có mùa khô rõ rệt Thanh long ưa cường độ ánh sáng mạnh, nếu bị che nắng hoặc số giờ chiếu sáng ít thân cây nhỏ yếu và chậm ra hoa

Đất đai

Cây thanh long không kén đất, cổ thể trồng trên nhiều loại đất như đất xám bạc màu (Bình Thuận), đất phèn (TP Hồ Chí Minh), đất đỏ (Đồng Nai), đất thịt hoặc thịt pha cát (Tiền Giang, Long An) Điều chủ yếu là phải có tầng đất canh tác dày từ 30 –

50 cm trở lên, thoát nước trong mùa mưa và đủ nguồn nước tưới mùa khô Độ pH thích hợp từ 4 – 5

2.2 Vi khuẩn Bacilius

2.2.1 Đặc điểm

Bacillus là một chi vi khuẩn gram dương có kích thước lớn, hiếu khí, hình que/

trụ, được tìm thấy rộng rãi trong đất, nước và không khí Chúng là catalase dương tính; nhiều loại có khả năng lên men và hầu hết đều có tính di động

2.2.2 Đặc tính sinh học

Chi này bao gồm nhiều loài - một số có lợi cho hệ sinh thái trên cạn và dưới nước, trong khi những loài khác có hại đối với các sinh vật khác Các thành viên

của chi bacilius có khả năng thích nghi cao, nhờ khả năng hình thành nội bào tử -

cấu trúc bảo vệ chúng khỏi một loạt các môi trường tiêu cực Bao gồm nhiệt độ rất

cao, rất thấp, cực khô, bức xạ và hóa chất độc hại Bacillus có thể ngưng hoạt động

trong nhiều năm và kích hoạt trở lại khi gặp trúng điều kiện thuận lợi

Ngoài nội bào tử, những vi khuẩn đáng kinh ngạc này có một loạt các khả năng sinh lý giúp chúng thích nghi với các môi trường khác nhau và chịu đựng nhiều điều kiện có thể gây tử vong cho nhiều sinh vật khác Điều quan trọng là bạn phải biết sự khác biệt giữa chi, loài và chủng khi chọn chế phẩm sinh học Ví dụ, Bacillus là một chi vi khuẩn hay coagulans là một loài trực khuẩn Tuy nhiên, có

nhiều chủng Bacillus khác nhau kèm tác dụng khác nhau Hầu hết các chất bổ sung

lợi khuẩn mà bạn tìm thấy trên mạng, cửa hàng rất ít khi cho bạn biết sản phẩm đó

chứa chủng bacillus nào

2.3 Neoscytalidium dimidiatum:

2.3.1 Đặc điểm

Nấm N dimidiatum có phạm vi phân bố rộng trên toàn thế giới và ký sinh

được trên nhiều loài cây trồng như cây có múi, chuối, mận, xoài và nhất là cây

thanh long Nấm N dimidiatum gây các triệu chứng như héo cành, chết mầm, thối,

chảy gôm và làm chết cây Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của

nấm N dimidiatum là độ ẩm

Tản nấm N dimidiatum có dạng tơ bông sợi, ban đầu màu trắng sau chuyển dần sang xanh oliu đến xám, có tiết sắc tố đen Nấm N dimidiatum có tốc độ phát triển nhanh, mọc kín đĩa petri (f=9cm) trong 3 ngày Sợi nấm N dimidiatum phân nhánh, có

vách ngăn, màu nâu và có khả năng phân cắt thành các bào tử đốt Bào tử hình ellip đến hình trứng, hình trụ hoặc tròn, kích thước 10.99±0.35 x 5.02±0.44mm, trong suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách

Nhiệt độ dao động khoảng 20-30oC, đây là điều kiện thuận lợi để nấm N

dimidiatum tấn công gây bệnh và lây lan mạnh

2.3.2 Điều kiện phát triển

Vào mùa mưa, khi độ ẩm trong không khí cao, nhiệt độ dao động khoảng

20-30oC, đây là điều kiện thuận lợi để nấm N dimidiatum tấn công gây bệnh và

lây lan mạnh Do khả năng tạo bào tử đốt mà nấm càng dễ dàng phát tán theo gió

và nước mưa, nước tưới Bào tử nấm hiện diện ở trong đất, trong nước, trong

không khí và nhất là trên các vết bệnh, vì đây là nơi tập trung rất nhiều ổ bào tử Bệnh sẽ phát sinh và phát triển mạnh trên những vườn có mực thủy cấp cao, những vườn vệ sinh kém, để dây rậm rạp, không được cắt tỉa và bị che mát nhiều, vườn

sử dụng nhiều phân đạm hay phân chuồng chưa ủ hoại

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng Bacillus phân lập từ các mẫu đất của vườn thanh long khỏe mạnh không

có dấu hiệu của bệnh đốm trắng trong vùng dịch bệnh

Chủng vi nấm N dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long được phân lập từ

mẫu thanh long bệnh

3.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu

Môi trường phân lập, nuôi cấy N dimidiatum và thử nghiệm đối kháng: PGA

(Potato Glucose Agar): Potato 200 g/l, D – glucose 20 g/l, Agar: 20 g/l, nước cất vừa

đủ 1l

Môi trường phân lập và nuôi cấy Bacillus: LB (Luria – Bertani) Tryptone: 10

g, Cao nấm men: 5 g, NaCl: 5 g, nước cất vừa đủ: 1l, môi trường thạch bổ sung Agar:

20 g/l

Các môi trường trên được hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút trước khi sử dụng

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1.Phương pháp phân lập, làm thuần N.dimidiatum, Bacillus

Phân lập, làm thuần N dimidiatum

Chọn mô thực vật mới bị bệnh để phân lập, rửa mẫu trong nước để loại bỏ bụi

và các tạp chất khác Khử trùng bề mặt bằng sodium hypochloride 1% trong 1 phút sau đó rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng Dùng dụng cụ được khử trùng cắt những miếng nhỏ (khoảng 2x2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cấy lên môi trường PGA, ủ ở 25oC-28oC trong tối Kiểm tra đĩa cấy hằng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những mẫu nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi trường

PGA

Phân lập, làm thuần Bacillus

Trước khi phân lập, mẫu được đun ở nhiệt độ cao (80oC) trong 10 phút để loại

bỏ tế bào sinh dưỡng chỉ giữ lại những chủng có sinh bào tử để chọn lọc và làm thuần

Bacillus Pha loãng mẫu đất đến nồng độ thích hợp bằng nước muối sinh lí

0,85-0,9‰, cấy trải trên đĩa petri có chứa môi trường LB – agar nuôi cấy 37oC trong 24

giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria

trên môi trường LB – agar Các chủng thuần được bảo quản -80oC

Phương pháp định danh vi khuẩn Bacilius bằng phép thử sinh hóa

Các chủng vi khuẩn thuần phát triển trên môi trường NA được quan sát đặc điểm hình thái tế bào bằng kính hiển vi quang học (Olympus BX50, Olympus, Tokyo, Japan) và kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như:

Nhuộm Gram: độ thuần và hình thái của các chủng vi khuẩn được quan sát

bằng tiêu bản nhuộm Gram theo phương pháp Hucker and Conn (1923) Dùng que cấy

vô trùng lấy một ít khuẩn lạc đã tách ròng hòa vào giọt nước muối sinh lý đã tiệt trùng

ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính Sau đó tiến hành nhuộm với dung dịch tím tinh thể (Crystal Violet) trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất Nhỏ 1-2 giọt dung dịch alcohol 95% cho đến khi mất màu, rửa lại bằng nước cất Sau đó nhuộm tiếp dung dịch safranin trong 1 phút, rửa nước cất, để khô Quan sát với giọt dầu ở vật kính 100

x Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng

Phản ứng catalase: que cấy vô trùng được dùng để lấy một ít khuẩn lạc phết

lên lam kính, sau đó nhỏ một giọt dung dịch H2O2 (3%) lên lame Vi khuẩn cho phản ứng dương tính với catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí và ngược lại

Phản ứng oxidase: một ít vi khuẩn được phết lên đĩa giấy đã tẩm dung dịch

Tetramethyl - p - Phenylendiamin dihydrochlorid (1%) bằng que cấy vô trùng Vi khuẩn cho phản ứng dương tính sẽ làm giấy chuyển sang màu đen và ngược lại Tính

di động: một giọt nước cất được nhỏ lên lam kính, sau đó dùng que cấy vô trùng trải đều vi khuẩn lên lam, đậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 100 x

Phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA đối với vi nấm N dimidiatum:

Chủng vi sinh sau khi định danh hình thái và sinh hóa và thử nghiệm đối kháng được tuyển chọn tiến hành định danh đến loài bằng phương pháp giải trình tự vùng

ITS - rDNA đối với vi nấm N dimidiatum: Tách chiết bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit của

QIAgen, khuếch đại trình tự bằng phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự như sau ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)

Phản ứng PCR được thực hiện trong 25 µl master mix (Công ti Promega) bao gồm: 12,5 µl 2X Gotaq ® Colorless Master Mix; mỗi loại nồng độ 10 µM; 1,2 µL; 9,1

µL của dH2O và 1 µL của DNA nấm Phản ứng PCR gồm 35 chu kì bao gồm 2 giai đoạn tiền biến tính: 95oC trong 2 phút; giai đoạn biến tính 95oC trong 40 giây; giai đoạn bắt cặp của các mồi: 58oC trong 60 giây; giai đoạn kéo dài đoạn khuếch đại: 72oC trong 1 phút và giai đoạn kéo dài cuối: 72oC trong 5 phút Các sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch TBE 0,5X Sử dụng 5 µL sản phẩm trộn chung với 1 µL loading dye cho vào từng giếng Chạy điện di với hiệu điện thế

100 V trong 25 phút Kết quả điện di được quan sát bằng máy chụp ảnh gel (Bioroad, Hoa Kì) Đoạn khuếch đại PCR của vùng ITS của từng mẫu nấm được gửi giải trình

tự tại hãng Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST

Đối với chủng vi khuẩn Bacillus được gửi mẫu định danh bằng phương pháp sử dụng

công nghệ khối phổ protein (MALDI- TOF)

MALDI TOF sử dụng công nghệ khối phổ protein định danh vi sinh vật, so sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của hơn 8000 chủng vi sinh vật khác nhau Phân tích MALDI TOF cho phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn Gram âm, Gram dương, vi khuẩn kỵ khí,

vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc, Mycobacteria Hệ thống máy yêu cầu cán bộ

nghiên cứu chuyên nghiệp, có trình độ cao, thành thạo tay nghề, cho phép định danh

vi sinh vật trực tiếp từ môi trường thạch hoặc mẫu bệnh phẩm trong thời gian 30 phút với 96 mẫu vi sinh vật Công nghệ hiện đại khối phổ protein cho kết quả chẩn đoán nhanh vi sinh vật, độ chính xác cao, quản lý dữ liệu, cập nhật kết quả mới thường xuyên từ ngân hàng vi sinh vật thế giới, kết quả có giá trị khoa học cao

3.2.3 Phương pháp thử nghiệm khả năng gây bệnh của chủng N dimidiatum

phân lập được:

Nuôi cấy nấm bệnh N dimidiatum trên môi trường PDA (ủ trong tối ở

25oC-28oC) khoảng 2-4 ngày, sau đó hòa tan bào tử và đưa về mật độ 104 CFU/ml Sử dụng kim tiêm vô trùng tiêm 100 μl dịch treo bào tử (105CFU/ml) vào thân và quả thanh long khỏe Nghiệm thức đối chứng tiêm nước cất vô trùng Tất cả các mẫu đoạn thân

và quả thanh long sau khi tiêm được đặt trong các hộp nhựa kín ở 25oC-28oC, ủ trong