Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Tiểu luận môn học Khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium D
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Tiểu luận môn học Khả đối kháng vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium Dimidiatum gây bệnh đốm trắng long Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môn học : Thiết bị kỹ thuật công nghệ sinh học Nhóm thực : Nhóm Niên khóa : 2023 - 2024 TP Thủ Đức, tháng 10 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC Tiểu luận môn học Khả đối kháng vi khuẩn Bacilius với vi nấm Neoscytalidium Dimidiatum gây bệnh đốm trắng long Môn học : Thiết bị kỹ thuật công nghệ sinh học Giảng viên : TS Huỳnh Văn Biết ThS Trương Quang Toản Nhóm thực hiện: Nhóm Thạch Vinh 21126259 Ngơ Ngọc Hải 21126324 Trần Thị Kim Ngân 21126419 TP Thủ Đức, tháng 10 năm 2023 Mục lục Chương 1: Mở đầu 1.1Đặc vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Cây long 2.1.1 Đặc điểm 2.1.2 Đặc tính sinh học 2.1.3 Điều kiện sinh thái 2.2 Vi khuẩn Bacilius 2.2.1 Đặc điểm 2.2.2 Đặc tính sinh học 2.3 Neoscytalidium dimidiatum: 2.3.1 Đặc điểm 2.3.2 Điều kiện phát triển 10 Chương 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 11 3.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 3.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 11 3.2 Phương pháp nghiên cứu 11 3.2.1.Phương pháp phân lập, làm N.dimidiatum, Bacillus 11 3.2.3 Phương pháp thử nghiệm khả gây bệnh chủng N dimidiatum phân lập được: 13 3.2.4 Phương pháp khảo sát khả đối kháng với nấm bệnh N dimidiatum: 14 Chương Kết kết luận 15 4.1 Phân lập sàng lọc chủng vi nấm N dimidiatum: 15 4.2 Kết thử nghiệm khả gây bệnh chủng N dimidiatum phân lập được: 15 4.3 Khả kháng N dimidiatum gây bệnh đốm trắng chủng Bacillus phân lập 17 4.4 Kết định danh phương pháp MALDI – TOF chủng Bacillus tuyển chọn 19 4.5 Kết luận 19 Tài liệu tham khảo 20 Chương 1: Mở đầu 1.1Đặc vấn đề Như biết long một loại nơng sản có tiềm lực phát triển kinh tế cao tạo nguồn thu nhập cao cho bà nông dân chuyên trồng loại nông sản đặt biệt vùng có sản lượng long cao : Bình Thuận , Ninh Thuận Long An ,Tiền Giang số tỉnh ĐBSCL Quả long có vị mát chua Trong chín chứa 80% nước, độ Brix từ 13-15, hàm lượng đường tổng số 11-14%, hàm lượng chất đạm, chất béo axit hữu thấp, tương đối nhiều chất khoáng (Kali, Canxi, Magiê, Phốtpho) Vitamin, đặc biệt Vitamin c (8 mg/lOOg thịt quả) Tuy nhiên nay, tình hình dịch bệnh long diễn nghiêm trọng, đáng ý bệnh đốm trắng Theo ghi nhận Viện Cây ăn miền Nam bệnh đốm trắng xuất rải rác vào năm 2008 Bình Thuận Tiền Giang, từ năm 2011 đến bệnh công mạnh lây lan nhanh Mức độ bệnh vườn, địa phương khác nhau, có vườn bị nhiễm thu hoạch được, thiệt hại lớn cho nhà vườn Bệnh đốm trắng hay gọi tên “đốm nâu”, “đốm tắc kè”, “bệnh ma”, “bệnh loét” hay “thối mục”, bệnh gây thiệt hại lớn suất chất lượng long Nguyên nhân bệnh xác định vi nấm Neoscytalydium dimidiatum Để khắc phục tình trạng nhiều nghiên cứu sử dụng trơng có việc sử dụng vi khuẩn Bacillus sp để ức chế số loài nấm bệnh trồng cho thấy tính hiệu [5] - [8]…, điều cho thấy dịng Bacillus sp có tiềm việc ức chế nấm bệnh N dimidiatum long 1.2 Mục tiêu đề tài Trong nghiên cứu vi khuẩn Bacilius làm gửi định danh phương pháp sử dụng khối phổ protein (MALDI- TOF) MALDI-TOF phương pháp proteomics mạnh mẽ cách nhanh chóng, xác tiết kiệm để xác định phân biệt vi khuẩn, chẳng hạn vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng nấm Công nghệ tạo dấu vân tay phổ khối riêng cho vi sinh vật xác định chúng cách xác cấp độ chi loài Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Cây long 2.1.1 Đặc điểm Quả long có vị mát chua Trong chín chứa 80% nước, độ Brix từ 13-15, hàm lượng đường tổng số 11-14%, hàm lượng chất đạm, chất béo axit hữu thấp, tương đối nhiều chất khoáng (Kali, Canxi, Magiê, Phốtpho) Vitamin, đặc biệt Vitamin c (8 mg/lOOg thịt quả) Mùa thu hoạch long Nam Bộ kéo dài từ tháng đến tháng 10, rộ từ tháng 5-8 Tuổi thọ trung bình 10 – 12 năm, đất tốt chăm bón chu đáo dài 2.1.2 Đặc tính sinh học Cây long thuộc họ Xương rồng (Cactaceae) Là loại thân bò lan: Thân cành màu xanh, có cạnh, bìa cạnh có nhiều thùy nhỏ tạo thành hình gợn sóng Đáy thùy có – gai nhỏ Rễ long chứa nước nên giúp chịu hạn Có loại rễ địa sinh rễ khí sinh Rễ địa sinh loại rễ chính, phát triển từ phần lõi gốc hom bám xuống đất để hút chất dinh dưỡng ni Rễ khí sinh loại rễ phụ mọc dọc theo thân để bám vào chối giúp leo lên giá đỡ Những rễ khí sinh phía gốc thân gần đất dần xuống đất thành rễ Hoa long loại hoa lưỡng tính, tương đối lớn, dài trung bình 25 -35 cm, nhiều đài cánh hoa dính thành ống 2.1.3 Điều kiện sinh thái Khí hậu Thanh long có nguồn gốc vùng nhiệt đới khơ nên chịu nóng chịu hạn tốt Nhiệt độ thích hợp từ 21- 29°c, tối đa không 40°c Đặc biệt long yếu chịu lạnh, không chịu ẩm độ cao mưa nhiều Thích hợp trồng vùng có lượng mưa trung bình có mùa khơ rõ rệt Thanh long ưa cường độ ánh sáng mạnh, bị che nắng số chiếu sáng thân nhỏ yếu chậm hoa Đất đai Cây long không kén đất, cổ thể trồng nhiều loại đất đất xám bạc màu (Bình Thuận), đất phèn (TP Hồ Chí Minh), đất đỏ (Đồng Nai), đất thịt thịt pha cát (Tiền Giang, Long An) Điều chủ yếu phải có tầng đất canh tác dày từ 30 – 50 cm trở lên, thoát nước mùa mưa đủ nguồn nước tưới mùa khô Độ pH thích hợp từ – 2.2 Vi khuẩn Bacilius 2.2.1 Đặc điểm Bacillus chi vi khuẩn gram dương có kích thước lớn, hiếu khí, hình que/ trụ, tìm thấy rộng rãi đất, nước khơng khí Chúng catalase dương tính; nhiều loại có khả lên men hầu hết có tính di động 2.2.2 Đặc tính sinh học Chi bao gồm nhiều lồi - số có lợi cho hệ sinh thái cạn nước, lồi khác có hại sinh vật khác Các thành viên chi bacilius có khả thích nghi cao, nhờ khả hình thành nội bào tử cấu trúc bảo vệ chúng khỏi loạt môi trường tiêu cực Bao gồm nhiệt độ cao, thấp, cực khơ, xạ hóa chất độc hại Bacillus ngưng hoạt động nhiều năm kích hoạt trở lại gặp trúng điều kiện thuận lợi Ngoài nội bào tử, vi khuẩn đáng kinh ngạc có loạt khả sinh lý giúp chúng thích nghi với mơi trường khác chịu đựng nhiều điều kiện gây tử vong cho nhiều sinh vật khác Điều quan trọng bạn phải biết khác biệt chi, lồi chủng chọn chế phẩm sinh học Ví dụ, Bacillus chi vi khuẩn hay coagulans lồi trực khuẩn Tuy nhiên, có nhiều chủng Bacillus khác kèm tác dụng khác Hầu hết chất bổ sung lợi khuẩn mà bạn tìm thấy mạng, cửa hàng cho bạn biết sản phẩm chứa chủng bacillus 2.3 Neoscytalidium dimidiatum: 2.3.1 Đặc điểm Nấm N dimidiatum có phạm vi phân bố rộng toàn giới ký sinh nhiều lồi trồng có múi, chuối, mận, xoài long Nấm N dimidiatum gây triệu chứng héo cành, chết mầm, thối, chảy gôm làm chết Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phát triển nấm N dimidiatum độ ẩm Tản nấm N dimidiatum có dạng tơ sợi, ban đầu màu trắng sau chuyển dần sang xanh oliu đến xám, có tiết sắc tố đen Nấm N dimidiatum có tốc độ phát triển nhanh, mọc kín đĩa petri (f=9cm) ngày Sợi nấm N dimidiatum phân nhánh, có vách ngăn, màu nâu có khả phân cắt thành bào tử đốt Bào tử hình ellip đến hình trứng, hình trụ trịn, kích thước 10.99±0.35 x 5.02±0.44mm, suốt đến nâu tối, thành bào tử dày, có 0-1 vách Nhiệt độ dao động khoảng 20-30oC, điều kiện thuận lợi để nấm N dimidiatum công gây bệnh lây lan mạnh 2.3.2 Điều kiện phát triển Vào mùa mưa, độ ẩm khơng khí cao, nhiệt độ dao động khoảng 20-30oC, điều kiện thuận lợi để nấm N dimidiatum công gây bệnh lây lan mạnh Do khả tạo bào tử đốt mà nấm dễ dàng phát tán theo gió nước mưa, nước tưới Bào tử nấm diện đất, nước, 10 khơng khí vết bệnh, nơi tập trung nhiều ổ bào tử Bệnh phát sinh phát triển mạnh vườn có mực thủy cấp cao, vườn vệ sinh kém, để dây rậm rạp, không cắt tỉa bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân chuồng chưa ủ hoại Chương 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng Bacillus phân lập từ mẫu đất vườn long khỏe mạnh khơng có dấu hiệu bệnh đốm trắng vùng dịch bệnh Chủng vi nấm N dimidiatum gây bệnh đốm trắng long phân lập từ mẫu long bệnh 3.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập, nuôi cấy N dimidiatum thử nghiệm đối kháng: PGA (Potato Glucose Agar): Potato 200 g/l, D – glucose 20 g/l, Agar: 20 g/l, nước cất vừa đủ 1l Môi trường phân lập nuôi cấy Bacillus: LB (Luria – Bertani) Tryptone: 10 g, Cao nấm men: g, NaCl: g, nước cất vừa đủ: 1l, môi trường thạch bổ sung Agar: 20 g/l Các môi trường hấp khử trùng 121oC, 15 phút trước sử dụng 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1.Phương pháp phân lập, làm N.dimidiatum, Bacillus Phân lập, làm N dimidiatum Chọn mô thực vật bị bệnh để phân lập, rửa mẫu nước để loại bỏ bụi tạp chất khác Khử trùng bề mặt sodium hypochloride 1% phút sau rửa lại lần với nước cất vơ trùng Dùng dụng cụ khử trùng cắt miếng nhỏ (khoảng 2x2 mm) từ phần ranh giới mô khỏe mơ bệnh, sau cấy lên mơi trường PGA, ủ 25oC-28oC tối Kiểm tra đĩa cấy ngày, tản nấm phát triển từ mẫu nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi trường PGA Phân lập, làm Bacillus Trước phân lập, mẫu đun nhiệt độ cao (80oC) 10 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng giữ lại chủng có sinh bào tử để chọn lọc làm Bacillus Pha lỗng mẫu đất đến nồng độ thích hợp nước muối sinh lí 0,850,9‰, cấy trải đĩa petri có chứa mơi trường LB – agar ni cấy 37oC 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus tiến hành làm cách cấy ria môi trường LB – agar Các chủng bảo quản -80oC 11 Phương pháp định danh vi khuẩn Bacilius phép thử sinh hóa Các chủng vi khuẩn phát triển môi trường NA quan sát đặc điểm hình thái tế bào kính hiển vi quang học (Olympus BX50, Olympus, Tokyo, Japan) kiểm tra tiêu như: Nhuộm Gram: độ hình thái chủng vi khuẩn quan sát tiêu nhuộm Gram theo phương pháp Hucker and Conn (1923) Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc tách rịng hịa vào giọt nước muối sinh lý tiệt trùng phiến kính, để khơ phịng thí nghiệm Cố định tiêu cách hơ nhanh lửa đèn cồn 2-3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính Sau tiến hành nhuộm với dung dịch tím tinh thể (Crystal Violet) phút, rửa lại nước cất Nhuộm tiếp dung dịch lugol phút, rửa nước cất Nhuộm tiếp dung dịch lugol phút, rửa nước cất Nhỏ 1-2 giọt dung dịch alcohol 95% màu, rửa lại nước cất Sau nhuộm tiếp dung dịch safranin phút, rửa nước cất, để khô Quan sát với giọt dầu vật kính 100 x Nếu nhuộm vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng Phản ứng catalase: que cấy vô trùng dùng để lấy khuẩn lạc phết lên lam kính, sau nhỏ giọt dung dịch H2O2 (3%) lên lame Vi khuẩn cho phản ứng dương tính với catalase có tượng sủi bọt khí ngược lại Phản ứng oxidase: vi khuẩn phết lên đĩa giấy tẩm dung dịch Tetramethyl - p - Phenylendiamin dihydrochlorid (1%) que cấy vô trùng Vi khuẩn cho phản ứng dương tính làm giấy chuyển sang màu đen ngược lại Tính di động: giọt nước cất nhỏ lên lam kính, sau dùng que cấy vơ trùng trải vi khuẩn lên lam, đậy lamen quan sát kính hiển vi vật kính 100 x Phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA vi nấm N dimidiatum: Chủng vi sinh sau định danh hình thái sinh hóa thử nghiệm đối kháng tuyển chọn tiến hành định danh đến loài phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA vi nấm N dimidiatum: Tách chiết gen vi khuẩn kit QIAgen, khuếch đại trình tự phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự sau ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Phản ứng PCR thực 25 µl master mix (Cơng ti Promega) bao gm: 12,5 àl 2X Gotaq đ Colorless Master Mix; loại nồng độ 10 µM; 1,2 µL; 9,1 µL dH2O µL DNA nấm Phản ứng PCR gồm 35 chu kì bao gồm giai đoạn tiền biến tính: 95oC phút; giai đoạn biến tính 95oC 40 giây; giai đoạn bắt cặp mồi: 58oC 60 giây; giai đoạn kéo dài đoạn khuếch đại: 72oC phút giai đoạn kéo dài cuối: 72oC phút Các sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% dung dịch TBE 0,5X Sử dụng µL sản phẩm trộn chung với µL loading dye cho vào giếng Chạy điện di với hiệu điện 12 100 V 25 phút Kết điện di quan sát máy chụp ảnh gel (Bioroad, Hoa Kì) Đoạn khuếch đại PCR vùng ITS mẫu nấm gửi giải trình tự hãng Macrogen (Seoul, Hàn Quốc) Các trình tự nucleotide hồn chỉnh so sánh với ngân hàng liệu gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST Đối với chủng vi khuẩn Bacillus gửi mẫu định danh phương pháp sử dụng công nghệ khối phổ protein (MALDI- TOF) MALDI TOF sử dụng công nghệ khối phổ protein định danh vi sinh vật, so sánh tương đồng phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với sở liệu 8000 chủng vi sinh vật khác Phân tích MALDI TOF cho phép định danh xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn Gram âm, Gram dương, vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc, Mycobacteria Hệ thống máy yêu cầu cán nghiên cứu chun nghiệp, có trình độ cao, thành thạo tay nghề, cho phép định danh vi sinh vật trực tiếp từ môi trường thạch mẫu bệnh phẩm thời gian 30 phút với 96 mẫu vi sinh vật Công nghệ đại khối phổ protein cho kết chẩn đoán nhanh vi sinh vật, độ xác cao, quản lý liệu, cập nhật kết thường xuyên từ ngân hàng vi sinh vật giới, kết có giá trị khoa học cao 3.2.3 Phương pháp thử nghiệm khả gây bệnh chủng N dimidiatum phân lập được: Nuôi cấy nấm bệnh N dimidiatum môi trường PDA (ủ tối 25oC28oC) khoảng 2-4 ngày, sau hịa tan bào tử đưa mật độ 104 CFU/ml Sử dụng kim tiêm vô trùng tiêm 100 μl dịch treo bào tử (105CFU/ml) vào thân long khỏe Nghiệm thức đối chứng tiêm nước cất vô trùng Tất mẫu đoạn thân long sau tiêm đặt hộp nhựa kín 25oC-28oC, ủ 13 điều kiện tối Mỗi thí nghiệm sử dụng 10 đoạn thân long cho lần lặp Mỗi cơng thức thí nghiệm lặp lại lần Ghi nhận kết quả: Quan sát ngày đánh giá biểu bệnh đoạn thân gây bệnh so sánh đặc điểm bệnh tự nhiên Chọn mẫu nấm có khả gây bệnh tương tự mơ tả ngồi tự nhiên để tiếp tục nghiên cứu Tính tỉ lệ gây bệnh: TLB (%) = Số đoạn thân bệnh/tổng số đoạn thân x 100 3.2.4 Phương pháp khảo sát khả đối kháng với nấm bệnh N dimidiatum: Sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp sử dụng phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch để khảo sát đặc tính đối kháng với vi nấm N dimidiatum 14 Với phương pháp đối kháng trực tiếp đánh giá khả đối kháng thông qua hiệu ức chế (%) sau H = (Ddc – D)/ Ddc x 100, theo dõi sau ngày thử nghiệm Trong đó: H: Hiệu ức chế (%); D: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối kháng; Ddc: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối chứng Với phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch đánh giá khả đối kháng sau ngày thử nghiệm đánh giá thơng qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc), tính mm theo cơng thức: Kích thước vịng đối kháng = D – d Trong đó: D (mm) đường kính vịng đối kháng; d (mm) đường kính khuẩn lạc Chương Kết kết luận 4.1 Phân lập sàng lọc chủng vi nấm N dimidiatum: Từ mẫu long bệnh thu tiến hành phân lập N dimidiatum môi trường PGA lựa chọn dịng có đặc tính vi nấm N dimidiatum theo mô tả Võ Thị Thu Oanh cs (2015) như: Tản nấm có màu xám đen đến nâu đen, mặt sau tản nấm có màu đen, khơng có vịng đồng tâm Sợi nấm phân nhánh có màu nâu đến nâu đậm, vươn cao bơng gịn bề mặt mơi trường (Hình 1A) Quan sát kính hiển vi quang học cho thấy sợi nấm phân nhánh có vách ngăn Bào tử hình chữ nhật, hình vng, hình bầu dục, hình trịn hình que (Hình 1B) Kết thí nghiệm chọn chủng MB1 MB3 mang đặc điểm N dimidiatum Hình : Đặc điểm hình thái vi nấm N dimidiatum môi trường PGA (A): Khuẩn lạc vi nấm; (B):Tiêu vi thể quan sát vật kính x100 4.2 Kết thử nghiệm khả gây bệnh chủng N dimidiatum phân lập được: Hai chủng nấm bệnh sau định danh tiến hành thử nghiệm khả gây bệnh thân long Tiến hành thí nghiệm quan sát thời điểm cho thấy: Với nghiệm thức tiêm nấm bệnh, 3-4 ngày sau tiêm 15 số vị trí tiêm nấm bệnh thân mơ bắt đầu xuất đốm bệnh màu vàng ngả dần sang nâu với trũng tròn nhỏ tương tự với mơ tả bệnh (Hình 2B) Đến thời điểm sau tuần gần mẫu thân mơ tiêm nấm bệnh có biểu bệnh, số đoạn thân long thời điểm bị thối hoàn toàn tác động nấm bệnh Trong đó, nghiệm thức đối chứng khơng quan sát thấy tượng nhiễm bệnh sau tuần tiêm (Hình 2A) Tiến hành xác định tỉ lệ bệnh nghiệm thức sau tuần tuần theo dõi thu kết Bảng Hình :Thân long sau tuần tiêm vi nấm A: Thân long bổ đôi nghiệm thức tiêm nước cất vô trùng; B: Thân long sau tiêm MB12 Kết Bảng cho thấy, tỉ lệ bệnh đốm trắng đoạn thân long tăng dần theo thời gian theo dõi sau tiêm chủng vi nấm N dimidiatum Tại thời điểm sau tuần tiêm nấm bệnh, đoạn thân có tỉ lệ bệnh cao dao động từ 80%-90% Ở nghiệm thức đối chứng tiêm nước cất vơ trùng khơng cho tượng bệnh suốt thời gian theo dõi Tại thời điểm sau tuần thí nghiệm hai chủng thử nghiệm cho tỉ lệ bệnh thân đạt 96,67-100% khác biệt thống kê so với đối chứng Từ kết đánh giá khả gây bệnh chủng vi nấm N 16 dimidiatum phân lập lựa chọn dòng nấm MB1 MB3 dịng có độc lực cao gây bệnh đốm trắng long để tiến hành nghiên cứu 4.3 Khả kháng N dimidiatum gây bệnh đốm trắng chủng Bacillus phân lập Việc đánh giá khả kháng N dimidiatum gây bệnh đốm trắng chủng Bacillus phân lập xác định thông qua hiệu ức chế (phương pháp đối kháng trực tiếp) xác định đường kính vịng kháng khuẩn (phương pháp khuếch tán lỗ thạch) Kết thí nghiệm cho thấy cho thấy với phương pháp đối kháng trực tiếp 116/136 chủng khảo sát có hiệu ức chế nấm bệnh N dimidiatum giao động từ đến 36,67 % sau ngày theo dõi Trong đó, số chủng đối kháng phân lập từ mẫu đất vườn 68/116 chủng, số chủng đối kháng phân lập từ mẫu đất rừng 48/116 chủng Chủng đối kháng mạnh ĐV5B6 với hiệu suất đối kháng sau ngày 36, 67 % Phương pháp đối kháng trực tiếp cho biết chủng khảo sát có đối kháng hay không mà rõ chủng thử nghiệm đối kháng có phải sinh hợp chất kháng khuẩn hay cạnh tranh dinh dưỡng Trong phương pháp khuếch tán lỗ thạch cho cho biết chủng có khả sinh chất kháng khuẩn hay khơng Vịng vơ khuẩn xung quanh lỗ thạch chứng tỏ chủng có tiết chất kháng khuẩn ức chế khả sinh trưởng N dimidiatum Hình Từ kết thí nghiệm chọn 107/136 chủng có khả đối kháng với N dimidiatum chiếm tỉ lệ 78,67% Trong đó, số chủng đối kháng phân lập từ mẫu đất vườn 58/107 chủng, số chủng đối kháng phân lập từ mẫu đất rừng 49/107 chủng Chủng ĐV5B6 ĐV2B4 có khả đối kháng mạnh với (D − d) = 21,33mm > 20) 17 Hình 3: Khả N.dimidiatum chủng ĐV5B6 phương pháp đối kháng trực tiếp Hình : Khả kháng N.dimidiatum chủng ĐV5B6 phương pháp khuếch tán lỗ thạch A : Mặt trước ; B : Mặt sau 18 Qua thí nghiệm khảo sát khả đối kháng với N dimidiatum gây bệnh đốm trắng long hai phương pháp đối kháng trực tiếp khuếch tán lỗ thạch cho thấy 104 chủng Bacillus có khả đối kháng với N dimidiatum phương pháp Trong đó, chủng cho kết đối kháng mạnh với N dimidiatum hai phương pháp ĐV5B6 phân lập từ đất vườn long Bình Thuận Chủng ĐV5B6 sử dụng để định danh MALDI – TOF làm sở tiếp tục nghiên cứu hình thành chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đốm trắng long 4.4 Kết định danh phương pháp MALDI – TOF chủng Bacillus tuyển chọn Chủng ĐV5B6 tuyển chọn định danh phương pháp MALDI – TOF Kết định danh cho thấy Bacillus atrophaeus (Bảng 4) Kết phù hợp với nghiên cứu trước đây, chủng Bacillus atrophaeus đánh giá vi khuẩn an toàn cho người, trồng ứng dụng nhiều phòng trừ sinh học, chống lại nhiều nấm bệnh trồng Ngoài khả sản xuất Bacteriocin, sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học protein hoạt động bề mặt sinh học, khả đối kháng với vi khuẩn vi nấm chủng Bacillus atrophaeus giúp trồng tăng trưởng tốt Như vậy, chủng Bacillus atrophaeus ĐV5B6 thích hợp sử dụng nghiên cứu hướng đến việc hình thành chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh đốm trắng long 4.5 Kết luận Từ mẫu long bệnh lấy Bình Thuận phân lập, làm sàng lọc chủng N dimidiatum MB1 MB3 hai chủng cho tỉ lệ bệnh đạt 96,67%-100% sau tuần thử nghiệm thân long Đã phân lập sàng lọc 136 chủng vi khuẩn Bacillus từ mẫu đất lấy Bình Thuận Trong 104 chủng có khả đối kháng với N dimidiatum phương pháp thử nghiệm Chủng ĐV5B6 cho kết đối kháng tốt với hiệu suất đối kháng 36,67% đường kính vịng vơ khuẩn 21,33 mm Kết định danh phương pháp MALDI – TOF cho thấy cho thấy chủng ĐV5B6 Bacillus atrophaeus, có tiềm sử dụng chế phẩm phòng trừ bệnh đốm trắng long 19 Tài liệu tham khảo https://www.biomerieux.com/corp/en/resource-hub/knowledge/scientificlibrary/pharma-microorganisms-library/mass-spectrometry-maldi-toftechnology-species-level-identificat.html https://journal.hcmue.edu.vn/index.php/hcmuejos/article/viewFile/60/53 https://jst.iuh.edu.vn/index.php/jst-iuh/article/download/1036/445 http://thanhlongsaylongchau.com/tin-tuc/gioi-thieu-ve-cay-thanh-long-1.html https://jstf.hufi.edu.vn/uploads/files/so-tap-chi/nam-2023/Tap-23-So1/6_SHMT10_R2_n%E1%BA%A5m%20trai%20thanh%20long_49-61.pdf P Seng, P., Rolain, J.-M., Fournier, P E., La Scola, B., Drancourt, M., & Raoult, D (2010), “MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical microbiology”, Future Microbiology, 5(11), 1733–1754 de Hoffmann and V Stroobant (2001), Mass Spectrometry: Principles and Applications, 2nd ed, Wiley 20