Báo cáo tiểu luận thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

Nguyên nhân của hiện trạng này là doviệc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng và điều trị bệnh chưa được kiểm soát hiệuquả.Tuy nhiên, để phân biệt Salmonella có khả năng gây bệnh với các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN SALMONELLA TRONG

MẪU CÁ TƯƠI NGHI NHIỄM BẰNG CÁC KỸ

THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN SALMONELLA TRONG

MẪU CÁ TƯƠI NGHI NHIỄM BẰNG CÁC KỸ

THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN LAN ANH 21126009Ths TRƯƠNG QUANG TOẢN NGUYỄN NHẬT HÒA 21126347

LÊ HOÀNG PHÚC 21126162

TP Thủ Đức, 10/2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 2

2.1.1 Giới thiệu chung về Salmonella 2

2.1.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella 2

2.2 Đặc điểm của Salmonella 2

2.2.1 Đặc điểm hình thái 2

2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 3

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa 3

2.3 Sự phân bố của Salmonella 3

2.3.1 Con đường lây lan 4

2.3.2 Tác hại của vi khuẩn Salmonella 4

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Đặc điểm và thời gian thực hiện 5

3.2 Vật liệu nghiên cứu 5

3.4 Bố trí thí nghiệm 5

3.4.1 Nội dung 1: Tiến hành định tính Salmonella trong mẫu cá tươi 6

3.4.2 Nội dung 2: Định danh vi khuẩn Salmonella trong mẫu bằng các phản ứng sinh hóa 8

3.4.3 Nội dung 3: Định danh và đánh giá khả năng kháng kháng sinh bằng SHPT 10

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Kết quả và thảo luận 17

4.1.1 Tiến hành định tính Salmonella trong mẫu cá tươi 17

4.1.2 Định danh vi khuẩn Salmonella trong mẫu bằng các phản ứng sinh hóa 18

4.1.3 Định danh và đánh giá khả năng kháng kháng sinh bằng SHPT 19

Chương 5 KẾT QUẢ MONG MUỐN VÀ KIẾN NGHỊ 21

5.1 Kết quả mong muốn 21

5.2 Kiến nghị 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella 2

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella 3

Hình 3.1 Hải sản tươi sống ở chợ 5

Hình 3.2 Khuẩn lạc Salmonella trên XLD 7

Hình 3.3 Khuẩn lạc Salmonella trên HE 7

Hình 3.4 Thử nghiệm sinh H2S 8

Hình 3.5 Thử nghiệm Urea (-) 9

Hình 3.6 Thử nghiệm VP 9

Hình 3.7 Các mồi đặc hiệu cho từng gen kháng kháng sinh trong m-PCR 14

Hình 3.8 Cơ chế tác động của kháng sinh vào tế bào vi khuẩn 15

Hình 3.9 Máy Mastercycler (Eppendorf) 15

Hình 4.1 Khuẩn lạc đơn trên HE 16

Hình 4.2 Khuẩn lạc đơn trên XLD 16

Hình 4.3 Khuẩn lạc Salmonella trên XLD 16

Hình 4.4 Khuẩn lạc Salmonella trên HE 16

Hình 4.5 Thử nghiệm sinh H2S 18

Hình 4.6 Thử nghiệm Urea (-) 18

Hình 4.7 Thử nghiệm VP 18

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

An toàn thực phẩm là một trong những vấn đề mà từ lâu chúng ta đặc biệt quantâm, được xem là yếu tố có ý nghĩa lớn về kinh tế - xã hội, sức khỏe cộng đồng, ảnhhưởng trực tiếp đến mục tiêu phát triển bền vững của quốc gia

Đặc biệt là tình trạng nhiễm khuẩn kháng kháng sinh trong các sản phẩm thủy hải

sản tươi sống, trong đó có vi khuẩn Salmonella Nguyên nhân của hiện trạng này là do

việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng và điều trị bệnh chưa được kiểm soát hiệuquả

Tuy nhiên, để phân biệt Salmonella có khả năng gây bệnh với các Salmonella

khác là một việc làm khó khăn, cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp hay chuẩn

mực nào để phân biệt giữa Salmonella có khả năng gây bệnh với Salmonella lành tính.

Do đó, các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam và hầu hết cácnước trên thế giới đều không cho phép có sự hiện diện bất kỳ chủng Salmonella nào cómặt trong thực phẩm mà không phân biệt chủng đó có độc hay không đối với conngười

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Định danh và phát hiện khuẩn Salmonella trong mẫu cá tươi nghi nhiễm bằng các

kĩ thuật công nghệ sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Tiến hành định tính Salmonella trong mẫu cá tươi.

Nội dung 2: Định danh vi khuẩn Salmonella trong mẫu bằng phản ứng sinh hóa.

Nội dung 3: Định danh và đánh giá khả năng kháng kháng sinh bằng SHPT

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Salmonella

2.1.1 Gi i thi u chung v ới thiệu chung về ệu chung về ề Salmonella

Cho đến nay đã phát hiện khoảng 500 loài vi sinh vật khác nhau có thể gây ra

bệnh thương hàn và phó thương hàn cho người và gia súc Salmonella có thể gây bệnh

truyền nhiễm cho động vật như phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa,…

Những bệnh trên do Salmonella gây ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phát hiện được Salmonella trong chất bài tiết của động vật lành.

2.1.2 Phân lo i vi khu n ại vi khuẩn ẩn Salmonella

2.2 Đặc điểm của Salmonella

2.2.1 Đ c đi m hình thái ặc điểm hình thái ểm hình thái

Salmonella là trực khuẩn gram âm, kích thước trung bình (0,7 - 1,5 × 2,0 - 5,0) μ

m, không tạo bào tử, không có vỏ, tế bào có thể dễ dàng nhuộm bằng các thuốc nhuộmthông thường như methylene blue hoặc carbol-fuchsin, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ

6oC – 42oC, thích hợp nhất ở 35oC – 37oC, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2

Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella.

Nguồn: foodpoisonjournal.com

Vi khuẩn Salmonella sử dụng tiêm mao để di chuyển (ngoại trừ S pullorum và S.

gallinarum)

2.2.2 Đ c đi m nuôi c y ặc điểm hình thái ểm hình thái ấy

Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi

cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ Có thểmọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrateagar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế

hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella Khuẩn lạc đặc trưng của

Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn

bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

2.2.3 Đ c đi m sinh hóa ặc điểm hình thái ểm hình thái

Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi Thường

không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môi trườngSimmons

Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên: S typhi

lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường

Simmon, hầu hết các chủng S paratyphi và S cholerasuis không sinh H2S

2.3 Sự phân bố của Salmonella

Hình 2.2 Vi khuẩn Salmonella.

Nguồn: cdc.gov

Salmonella phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thường xuyên phân lập từ ống tiêu

hóa của động vật và người bị nhiễm trùng Ngoài ra, chúng cũng được phân lập từ đất,không khí, nước sông hồ, nước biển và trong thực phẩm

2.3.1 Con đ ường lây lan ng lây lan

Vi khuẩn Salmonella có thể được tìm thấy ở một số nguồn thực phẩm khác nhau

như: thịt, trứng, một số loại rau và cá sống bao gồm cá hồi và cá ngừ… Đây là mộtloại vi khuẩn có thể gây ra bệnh đường tiêu hóa

Vi khuẩn Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn thế giới Hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn Salmonella đều nhẹ, nhưng đôi khi

căn bệnh này đe dọa đến tính mạng Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào các

yếu tố vật chủ và kiểu huyết thanh Salmonella.

2.3.2 Tác h i c a vi khu n ại vi khuẩn ủa vi khuẩn ẩn Salmonella

Salmonella là loại vi khuẩn gây bệnh cho con người và nó còn được gọi là vi

khuẩn thương hàn Chúng có mặt trong các loại thực phẩm và có thể xâm nhập vào cơthể con người qua con đường ăn uống Vi khuẩn thương hàn đi vào hệ tiêu hóa của cơ

thể, sau khi bị chết sẽ giải phóng ra nội độc tố Vi khuẩn Salmonella chết càng nhiều

càng có nhiều độc tố giải phóng tấn công vào cơ thể người nhiễm Nội độc tố của vi

khuẩn Salmonella gây ra ảnh hưởng rất xấu tại ruột, nội độc tố sẽ làm tổn thương niêm

mạc ruột (kích thích ruột gây đau bụng, làm chảy máu, hoặc có thể gây thủng ruột)

Nội độc tố do vi khuẩn Salmonella giải phóng đi vào máu đến hệ thần kinh trung ương

làm tổn thương hệ thần kinh và nhiễm độc toàn thân

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đặc điểm và thời gian thực hiện

Tổng thời gian từ khâu chọn mẫu cho đến tăng sinh mẫu và phân lập dòng vikhuẩn cần định danh khoảng 24 - 48 giờ, sau đó tiến hành các phản ứng sinh hóakhoảng 12 - 24 giờ tiếp theo và khuếch đại PCR hoặc điện di ước tính khoảng mộtngày Tổng thời gian thao tác khoảng từ 3 - 5 ngày tùy vào loại vi khuẩn cũng nhưđiều kiện môi trường phòng thí nghiệm

Phạm vi thực hiện trong phòng thí nghiệm có đầy đủ các dung cụ, tủ cấy vi sinhchuyên dụng an toàn sinh học cấp 1 hoặc 2, và các dung dịch môi trường phù hợp

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng Salmonella spp phân lập từ thủy hải sản tươi sống tại các chợ truyền

thống trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh

3.4.1 N i dung 1: Ti n hành đ nh tính ội dung 1: Tiến hành định tính ến hành định tính ịnh tính Salmonella trong m u cá tẫu cá tươi ươi i

Salmonella có thể phân tích định tính bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh,

tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với

số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài

vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

3.4.1.1 Môi tr ưởng sử dụng ng s d ng ử dụng ụng

- BPW (Buffered Peptone Water )

- RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton)

- XLD (Xylose Lysine Deoxycholate Agar)

- HE (Hektoen Entric Agar)

- TSA (Tryptone Soya Agar)

3.4.1.2 Quy trình đ nh tính ịnh tính Salmonella

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 37oC, 18 – 24giờ Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 42oC, 18 –

24 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE,

BS, SS ), ủ ở 37oC, 24 giờ Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang

BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

- Urea (-), Indol (-), VP (-), LDC (+), ODC (+), Manitol (+), Sorbitol (+)

- Định tính dương tính hay âm với Salmonella trong 25 g thực phẩm.

3.4.1.3 Các b ưới thiệu chung về c ti n hành ến hành định tính

Bước 1: pha môi trường

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường pha

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao nút Hấptiệt trùng 121oC trong 15 phút

Bước 3: tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25 g mẫu trong túi PE vô trùng,

bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30giây Ủ ở 37oC, 18 – 24 giờ Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống,sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản

phẩm chứa cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế

sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt.

Bước 4: tăng sinh chọn lọc

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh

RV đã được ủ ấm 42oC Ủ ở 42oC, 18 – 24 giờ Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủthêm 24 giờ

Bước 5: phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từdịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho

Salmonella như XLD và HE Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:

a Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen

Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn

3.4.2 N i dung 2: Đ nh danh vi khu n ội dung 1: Tiến hành định tính ịnh tính ẩn Salmonella trong m u b ng các ph n ẫu cá tươi ằng các phản ản

ng sinh hóa

ứng sinh hóa

3.4.2.1 Môi tr ường lây lan ng s d ng ử dụng ụng

- KIA (Kliger Iron Agar)

- MR-VP Both (Glucose Phosphate)

- RSU (Rustigian-Stuart Urea Broth)

3.4.2.1 Quy trình ti n hành ến hành định tính

Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạcnghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA Ủ ở 37oC, 18 – 24 giờ Các khuẩn lạcxuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): môi trường kiađược sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,lactose) và khả năng sinh H2S Về nguồn carbon, môi trường kia chứa 2 loại đường là1% lactose và 0.1% glucose thời gian ủ từ 18 – 24 giờ

Thử nghiệm Urea (-): được thực hiện trên môi trường Urea lỏng RSU (Rustigian– Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùngchuyển màu là pH 6,8 - 8,4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạccủa chủng thuần vào ống chứa 3 ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vikhuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ

Hình 3.4 Thử nghiệm sinh H2S

Nguồn: xetnghiemyhocvn.blogspot.com

Thử nghiệm VP: môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trườngMR-VP), pH 6,9 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinhkhối từ thử khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18 – 24 giờ trên môi trường KIA Sau thờigian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Thuốc thử Barritt gồm dungdịch A là 5% α- Naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH.Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dung dịch A và nhỏ 2 giọt dung dịch B Đọc kết quả sau 20phút hoặc chậm nhất 4 giờ.

Hình 3.5 Thử nghiệm Urea (-)

Nguồn: nsrvbiochemicaltests.blogspot.com

Hình 3.6 Thử nghiệm VP

Nguồn: www.triphuc.com

3.4.3 N i dung 3: Đ nh danh và đánh giá kh năng kháng kháng sinh b ng ội dung 1: Tiến hành định tính ịnh tính ản ằng các phản SHPT

3.4.3.1 Ly trích DNA đ ti n hành khu ch đ i PCR ểm hình thái ến hành định tính ến hành định tính ại vi khuẩn

3.4.3.1.1 Ti n hành ly trích DNA ến hành định tính

Để phát hiện sự hiện diện của Salmonella trong các sản phẩm động vật, các kỹ

thuật vi sinh truyền thống có thể mất tới 4 ngày Bao gồm nuôi cấy và nhân giống vikhuẩn – kéo dài khoảng 18 giờ, cộng với 3 ngày nữa để tăng sinh có chọn lọc và ủ

Salmonella trong môi trường chất lỏng bổ sung Việc này gây ra vấn đề lớn đối với các

nhà sản xuất thực phẩm vì việc vận chuyển hàng hóa không thể chờ đợi kết quả kiểmtra lâu đến vậy, dẫn đến chi phí tốn kém khi thu hồi sản phẩm

Để quá trình tách chiết hoặc ly trích axit nucleic thành công đòi hỏi ba bước quantrọng là phá vỡ hiệu quả các tế bào hoặc mô; biến tính của phức hợp nucleoprotein;khử hoạt tính của nuclease Ví dụ, RNase để tách chiết RNA và DNase để tách chiếtDNA; tránh tạp nhiễm, ngoại nghiễm

Quy trình ly trích DNA plasmid (Birnboim và Doly, 1979):

Vi khuẩn E.coli mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (trypton

1%, Yeast extract 0,5%, NaCl 1%) ở 37oC, tốc độ lắc 200 rpm Dịch huyền phù vikhuẩn sau 16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng để ly trích plasmid theo quitrình gồm các bước như sau:

Bước 1: lấy 1 mL dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL

Bước 2: ly tâm dịch khuẩn ở tốc độ 5.000 rpm trong 2 phút

Bước 3: loại bỏ dịch nổi Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trườngkhỏi kết tủa

Bước 4: lặp lại bước 1, 2, 3

Bước 5: thêm 100 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.L dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ

Bước 5: thêm 200 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.L dung dịch II Đảo tube để trộn đều hỗn hợp Không vortex

ở bước này Giữ tube trên đá

Bước 7: thêm 150 μL dung dịch I (được giữ lạnh), vortex kỹ.L dung dịch III (được giữ lạnh) Đảo tube để trộn đều hỗnhợp Giữ tube trên đá khoảng 1 phút

Bước 8: ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút Chuyển dịch nổi sang tube mới (1V).Bước 9: thêm 2V isopropanol, vortex nhẹ; để yên trong 20 phút ở - 20oC