Báo cáo tiểu luận thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

Trang 1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN SALMONELLA TRONG MẪU CÁ TƯƠI BẰNG CÁC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌCTRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC Trang 5 - An toàn thực ph

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN

SALMONELLA TRONG MẪU CÁ

TƯƠI BẰNG CÁC KỸ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 10 năm 2023

Người thực hiện: Nhóm 1

Giảng viên: TS Huỳnh Văn Biết

Ths Trương Quang

Toản

Nguyễn Lan Anh

Chương 1:

MỞ ĐẦU

- An toàn thực phẩm là một trong những vấn đề mà

từ lâu chúng ta đặc biệt quan tâm.

- Đặc biệt là tình trạng nhiễm khuẩn kháng kháng

sinh trong các thực phẩm tươi sống, trong đó có vi

khuẩn Salmonella

ĐẶT VẤN ĐỀ

5

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Phát hiện, định danh và đánh giá khả năng

kháng một số loại kháng sinh ở Salmonella

trong mẫu cá khảo sát.

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella.

NỘI DUNG THỰC HIỆN

sinh bằng SHPT.

3

7

Chương 2:

TỔNG QUAN

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ SALMONELLA

Salmonella

Động vật như phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa

Người gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên

phát

Phát hiện trong chất bài tiết của động vật

lành Gây ra bệnh thương hàn và phó

thương hàn

Salmonella sử dụng tiêm mao để

di chuyển (ngoại trừ S pullorum

và S gallinarum).

11

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

Salmonella là trực khuẩn gram

âm, kích thước trung bình (0,7 - 1,5 × 2,0 - 5,0) μm, không tạo m, không tạo bào tử, không có vỏ.

SỰ PHÂN BỐ CỦA SALMONELLA

Hình 2.2 Tự nhiên Hình 2.3 Ống tiêu hóa của động vật và người bị nhiễm trùng. Hình 2.4 Thực phẩm.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Các chủng Salmonella spp

phân lập từ mẫu cá tươi tại các chợ truyền thống trên địa bàn thành phố Thủ Đức.

Tổng mẫu khảo sát là 40 mẫu (n=40)

NỘI DUNG 1: TIẾN HÀNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

TRONG MẪU CÁ TƯƠI

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

25 g

225 ml BPW Đồng nhất

NỘI DUNG 2: ĐỊNH DANH VI KHUẨN SALMONELLA

TRONG MẪU BẰNG CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường

không chọn lọc TSA được sử dụng cho

các thử nghiệm sinh hóa như sau:

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

Cấy ít nhất

5 khuẩn lạc Môi trường XLD và HE

Môi trường TSA

Hình 3.5 DNA.

Hút 1ml dịch khuẩn

cho vào tube

Ly tâm 5000 rpm trong 2 phút

Thêm 100 μm, không tạo l (I) (Vortex) Thêm 200

μm, không tạo l dd II Thêm 150

μm, không tạo l dd III (giữ lạnh)

Ly tâm 10000 rpm

trong 5 phút

Hút dịch nổi, thêm isopropanol để yên

20’ ở -20oC

Ly tâm 10000 rpm trong 5’ để thu kết

tủa DNA

Thêm 500 μm, không tạo l ethanol 70%, ly tâm, loại bỏ dịch

LY TRÍCH DNA ĐỂ TIẾN HÀNH KHUẾCH ĐẠI M-PCR

Hình 3.6 Phản ứng khuếch đại m-PCR (multiplex PCR) A Khuếch đại đơn mồi, B Khuếch đại đa mồi.

Bảng 3.1 Các mồi đặc hiệu cho từng gen kháng kháng sinh trong m-PCR

23

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM VÀ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ MẪU CÁ TƯƠI

Thành phần phản ứng m-PCR gồm :

AmpliTaq

Gold.

0,2 mM dNTP 1,5 mM MgCl2.

Đệm 1X.

0,5 μL mỗi đoạn mồi (nồng độ 0,625 μM).

1) Chuẩn bị gel polyacrylamide

2) Chạy điện di trên gel 3) Quan sát DNA sau khi điện di

Nếu xuất hiện band nằm trong khoảng gần bằng

600 bp (mồi inVa) thì có

Salmonella trong mẫu

cần kiểm tra.

Các đoạn gen kháng được khuếch đại ứng với các band nhất định.

4) Kết quả

Dùng cho dòng vi khuẩn

S enteritidis

BlaTEMI (827bp) TetA (710bp)

QUY TRÌNH ĐIỆN DI

3) Quan sát DNA sau khi điện di

Bảng 3.2 Đánh giá khả năng đề kháng của mẫu với kháng sinh.

Hình 3.9 Máy m-PCR.

Chương 4:

KẾT QUẢ VÀ

THẢO LUẬN

29

Để có được kết quả như mong muốn:

- Tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy.

- Thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng

- Môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng.

Thảo luận

NỘI DUNG 1: TIẾN HÀNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

TRONG MẪU CÁ TƯƠI

Sau khi test phản ứng sinh hóa, các phản ứng cho kết quả dương tính thì

khẳng định 100% mẫu bị Salmonella.

Thảo luận

31

NỘI DUNG 2: ĐỊNH DANH VI KHUẨN SALMONELLA

TRONG MẪU BẰNG CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

do hóa chất có vấn đề.

Trường hợp 1

Trường hợp 2

NỘI DUNG 3: ĐỊNH DANH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH BẰNG SHPT

Ly trích DNA để tiến hành khuếch đại

sinh hóa dương tính.

Sau khi PCR xong mà không xuất hiện band mục tiêu mà là một band khác thì

Salmonella

Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh

của vi khuẩn Salmonella

phân lập từ thủy sản tươi

Mức độ vấy nhiễm Salmonella spp từ thủy

hải sản tươi sống là bao nhiêu %

Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella

với ít nhất 01 loại kháng sinh

Tỷ lệ Salmonella đa kháng là % kiểu hình

Kháng kháng sinh phổ biến là AM, STR, TE, SXT (%).

cần thói quen ăn uống vệ sinh, an toàn

Để thịt tươi sống riêng biệt với rau và

TÀI LIỆU THAM

KHẢO

1 Truong, H A V., Nguyen, H K T., Chu, V H., & Huynh, Y H (2021) Antimicrobial susceptibility of Salmonella spp isolated from raw meats at traditional markets in Ho Chi Minh city Ministry of

Science and Technology, Vietnam, 8, 55–59 https://doi.org/10.31276/vjst.63(8).55-59.

2 S.K Eng, P Pusparajah, N.S Ab Mutalib, H.L Ser, K.G Chan, L.H Lee (2015), “Salmonella: a review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistance”, Front Life Sci., 8(3), pp.284-293.

3 Popa, G L., & Papa, M I (2021) Salmonella spp infection - a continuous threat worldwide Germs, 11(1), 88–96 https://doi.org/10.18683/germs.2021.1244.

4 Trương Phước Thiên Hoàng và Lê Phước Thọ (2023) Tài liệu thực hành kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm.

5 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2004)

6 Tôn Bảo Linh và Nguyễn Phan Thành (2019) Tài liệu thực hành sinh học phân tử.

7 Tortora GA (2008) Microbiology: An Introduction.

8 Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J., & De Keersmaecker, S C J (2012) Salmonella biofilms: An overview on occurrence, structure, regulation and eradication Food Research

International, 2, 502–531 https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.01.038

9 Rahman, H S., Mahmoud, B M., & Othman, H H (2018a) A Review of History, Definition, Classification, Source, Transmission, and Pathogenesis of Salmonella: A Model for Human Infection

Journal of Zankoy Sulaimani - Part A, 3 & 4, 11–20 https://doi.org/10.17656/jzs.10730

10 Adams, D.R., W.R Stensland, C.H Wang, A.M O'Connor, D.W Trampel, K.M Harmon, E.L Strait, and T.S Frana (2013) Detection of Salmonella Enteritidis in pooled poultry environmental samples using a serotype-specific real-time-polymerase chain reaction assay Avian Dis 57: 22–28.

11 Steve Yan, S., Pendrak, M L., Abela-Ridder, B., Punderson, J W., Fedorko, D P., & Foley, S L (2004) An overview of Salmonella typing Clinical and Applied Immunology Reviews, 3, 189–204

THANK

YOU!

35