Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBáo cáo seminarTHIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌCGVHD: TS.Huỳnh Văn Biết Th.S: Trương Quang ToảnThực hiện bởi: Nhóm 11Thủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Báo cáo seminar THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS.Huỳnh Văn Biết

Th.S: Trương Quang Toản

Thực hiện bởi: Nhóm 11

Thủ Đức, ngày 28, tháng 10, năm 2023

Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mũ gan

trên cá tra bằng phương pháp PCR

Các thành viên:

Lê Quốc Khánh 21126372

Đoàn Gia Hạo 21126334

Mu Ham Mách Ro Hia 21126336

Các nội dung chính

1.ĐẶT VẤN ĐỀ

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

5 KẾT LUẬN

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

• Giới thiệu

– Bệnh mủ gan trên cá tra là một bệnh truyền

nhiễm cấp tính gây ra bởi vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri Bệnh xảy ra ở tất cả

các giai đoạn nuôi, từ cá bột đến cá thương

phẩm Bệnh thường bùng phát mạnh vào

mùa mưa, khi nhiệt độ nước thấp.

– Yêu cầu: Phát hiện sớm vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp

PCR.

Cá bệnh

Cá bình thường

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

• 2.1.Vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri

– Edwardsiella ictaluri (còn gọi là nhiễm

trùng đường ruột ở cá da trơn , bệnh

thủng đầu và ESC ) là một thành viên

của họ Hafniaceae.

– Vi khuẩn này là một hình que ngắn,

gram âm , đa hình thái , có roi Nó gây

ra bệnh nhiễm trùng đường ruột ở cá da

trơn (ESC), gây bệnh mũ gan trên cá

tra, lây nhiễm cho nhiều loài cá (bao

gồm nhiều loài cá da trơn, cá dao và cá

chẽm ).

– Môi trường thích hợp cho vi khuẩn xâm

nhạp và gây bệnh là độ mặn 1.5% NaCl

và 5.5>

Chủng E.ictaluri (Gram x 1.000)

• 2.2 Bệnh gan thận mủ trên cá tra

– 2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh:

Bệnh gan thận mủ (còn gọi là bệnh mủ gan) là bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra

Cá Tra thường bị nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ thấp

(khoảng tháng 9 đến tháng 1 năm sau)

2.2.2 Đường lây nhiễm:

– E.ictalury có thể nhiễm cho cá bằng 2 đường khác nhau:

Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác

và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não.

Cá da trơn còn lây nhiễm qua đường tiêu hóa, thức ăn qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu.

– 2.2.3 Triệu chứng

Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh nhẹ hay nặng Quan sát bên ngoài có thể thấy bụng hơi sưng to, mắt bị đục Cá bệnh thường bơi lờ đờ gần bề mặt ao Khi mổ bụng cá ta thường thấy những đốm trắng nhỏ (như đốm mủ) trên bề mặt của một số cơ quan như gan, thận và lách

3 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

• 3.1 Vật liệu nghiên cứu

– Các chủng vi khuẩn được phân lập từ cá tra có dấu hiệu bệnh mủ gan từ nhiều nguồn khác nhau gồm các chủng CAF255, CAF258, 2B1, 3B3, C1 và C2, sau khi phân lập được nuôi trong môi trường nutrient broth (NB) có bổ sung 25% glycerol và giữ ở -80oC

• 3.2 Các phương pháp nghiên cứu

– Phương pháp sinh hóa truyền thống

– Phương pháp sử dụng kit API

– Phương pháp PCR

• 3.3 Phương pháp PCR

• Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn E ictaluri bao gồm 3 bước:

B1 Chiết tách DNA từ vi khuẩn:

• Vi khuẩn được nuôi tăng sinh hoặc lấy khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần

• Dung dịch vi khuẩn được kết hợp với dung dịch TE và đun 95oC trong 15 phút

• DNA được chiết tách và xác định hàm lượng bằng máy so màu quang phổ

B2 Khuyếch đại DNA:

• Thành phần hoá chất của phản ứng PCR bao gồm 10X PCR buffer, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase, mồi EiFd-1, mồi EiRs-1, DNA mẫu và nước

• Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95oC trong 4 phút, 90oC trong 30 giây,

53oC trong 45 giây và 72oC trong 30 giây lặp lại 30 lần, 72oC trong 10 phút

B3 Đọc kết quả:

• Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 1.5%

• Kết quả dương tính cho thấy dải DNA có kích thước 407 bp

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả điện di

Phương pháp sinh hóa truyền thống và

sử dụng kít API 20E đều có thể định danh

E ictaluri, nhưng mất nhiều thời gian (3-4

ngày hoặc 2-3 ngày) Phương pháp PCR

phát hiện nhanh E ictaluri (hiện vạch tại

vị trí 407 bp) có thể rút ngắn thời gian

xuống còn khoảng 6-7 giờ, tiết kiệm thời

gian và chi phí, đồng thời cho phép phát

hiện sớm các mầm bệnh.

Phương pháp PCR phát hiện nhanh E

ictaluri là hướng đi mới trong việc chẩn

đoán bệnh mủ gan ở cá tra nuôi.

Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng E ictaluri Giếng M: thang đo DNA (1 kb plus Invitrogen); Giếng 1: đối chứng âm (nước); Giếng 2: chủng

CAF255; Giếng 3: chủng 258; Giếng 4:

chủng 3B3; Giếng 5: chủng C1;Giếng 6: chủng C2.

5 KẾT LUẬN

Qui trình PCR phát hiện nhanh vi khuẩn E.ictaluri gây bệnh mủ

gan trên cá tra nuôi được thực hiện và chuẩn hoá Sản phẩm PCR

có kích thước 407 bp Các qui trình PCR phát hiện vi khuẩn

E.ictaluri sử dụng DNA chiết tách từ máu cá tra với thời gian chẩn đoán ngắn, độ nhạy cao có thể ứng dụng để xét nghiệm/chẩn đoán bệnh vi khuẩn trên cá tra, đặc biệt là cá bố mẹ So sánh với phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng kít API 20E thì phương

pháp PCR có thể được sử dụng để phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh mủ gan ở cá tra Mặt khác, thời gian chẩn đoán

bệnh bằng phương pháp PCR được rút ngắn đi rất nhiều so với

phương pháp truyền thống

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đặng Thị Hoàng Oanh, N T (2010) PHÁT HIỆN VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI

GÂY BỆNH MỦ GAN TRÊN CÁ TRA (PANGASIANODON Tạp chí Khoa học

2 Nguyen Ngoc Phuoc, R R (2020) Môi trường tạo điều kiện cho Edwardsiella ictaluri gây

bệnh gan thận mủ uv-vietnam.

3 Trần Hoàng Ngâu, N T (2017) NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN Edwardsiella

ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasius hyphophthalmus) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR.

4 Huyền, T T T., Trung, N T., & Hải, T N (2011) Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây

bệnh trên cá Tra Việt Nam bằng kỹ thuật PCR Vietnam Journal of Biotechnology, 9(1).

5 TRÌNH, N., & mPCR, C H Ẩ N THỜI VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI VÀ

AEROMONAS HYDROPHILA TRÊN THẬN CÁ TRA (PANGASIANODON)

CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE