Gen DWARF4 cà chua, được dựđoán sẽ mã hóa enzyme cytochrome P450 P450 tương đồng với cácP450 khác liên quan đến sinh tổng hợp Brassinosteroids.Brassinosteroid BR bao gồm một nhóm gồm gần
Gen DWARF4 mã hóa enyme Cytochrome P450 trong cà chua
Gen Cytochrome P450 (P450) mã hóa một họ enzyme đa dạng, xúc tác nhiều phản ứng sinh hóa quan trọng trong sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp.
Gen DWARF4 cà chua, được dự đoán sẽ mã hóa enzyme cytochrome P450 (P450) tương đồng với các P450 khác liên quan đến sinh tổng hợp Brassinosteroids.[8].
Brassinosteroid
Brassinosteroid (BR) là nhóm hormone thực vật nội sinh gồm gần 70 dẫn xuất sterol polyhydroxyl hóa, điều chỉnh sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây Cấu trúc BR tương tự hormone steroid động vật, tham gia điều chỉnh phát triển phôi, sau phôi, và cân bằng nội môi Đặc biệt, BR đóng vai trò quan trọng trong quá trình ra hoa và phát triển tế bào, ngay cả khi gặp hạn chế về thành tế bào.
Brassinosteroid (BR) là hormone steroid thiết yếu cho sinh trưởng và phát triển thực vật, điều chỉnh các quá trình như kéo dài thân, mở rộng lá, biệt hóa mạch dẫn, tăng khả năng chống chịu stress, ức chế lão hóa và phát triển khí khổng.
Nghiên cứu cho thấy brassinosteroid (BR) làm tăng kích thước hạt bằng cách tác động lên sự phát triển vỏ, nội nhũ và phôi, đồng thời điều chỉnh trực tiếp các gen kiểm soát kích thước hạt thông qua BZR1 Hình dạng hạt chủ yếu phụ thuộc vào tín hiệu BR từ mô mẹ, nhưng BR từ phôi và nội nhũ cũng đóng góp vào việc tăng kích thước hạt.
514 kích thước hạt, cung cấp bằng chứng cho một phương thức tác động cục bộ của BR trong quá trình phát triển hạt.
Các thể đột biến thiếu hụt Brassinosteroid và không nhạy cảm có ít noãn hoặc hạt hơn so với dạng hoang dã ở cây Arabidopsis.
Nghiên cứu cho thấy thiếu brassinosteroid (BR) ảnh hưởng đến kích thước và hình dạng hạt Arabidopsis do BR tác động lên phôi/nội nhũ và mô mẹ Phân tích phân tử chứng minh BR điều chỉnh các gen điều khiển phát triển hạt, liên kết tín hiệu BR với con đường phát triển quyết định kích thước và hình dạng hạt.
Quá trình sinh tổng hợp brassinosteroid
Brassinosteroids (BR) là hormone thực vật steroid thiết yếu cho sự tăng trưởng và phát triển của cây Quá trình sinh tổng hợp BR được cho là diễn ra qua hai con đường song song, bao gồm cả con đường oxy hóa C-.
Gen *DWARF4* của cà chua mã hóa cytochrome P450, xúc tác quá trình oxy hóa C-6 của 6-deoxocastasterone thành castasterone, tiền chất của brassinolide Thực nghiệm bổ sung cDNA *DWARF4* đã khắc phục kiểu hình lùn của cà chua đột biến Ứng dụng ngoại sinh C-6 oxoBR kích thích sinh trưởng, trái ngược với C-6 deoxoBR và 6-deoxocastasterone Phân tích nồng độ brassinolide xác nhận vai trò của *DWARF4* trong sinh tổng hợp hormone này.
Nghiên cứu 545 nội sinh trong cà chua cho thấy sự hiện diện chủ yếu của 6-deoxoBR Thực vật đột biến (dx) thiếu CS nhưng có hàm lượng 6-deoxoCS cao hơn đáng kể so với thực vật bình thường (D) Biểu hiện chức năng DWARF4 trong nấm men xác nhận vai trò xúc tác quá trình oxy hóa C-6 của 6-deoxoCS thành CS, qua trung gian 6α-hydroxycastasterone Dữ liệu này chứng minh DWARF4 tham gia vào quá trình oxy hóa C-6 trong sinh tổng hợp brassinosteroid (BR).
DWARF4 xúc tác hai bước trong sinh tổng hợp brassinosteroid (BR), đặc biệt là quá trình oxy hóa C-6 Thiếu DWARF4 dẫn đến thực vật lùn.
Thực vật CS có hàm lượng 6-deoxoCS cao hơn thực vật D DWARF4 xúc tác quá trình oxy hóa C-6 của 6-deoxoCS thành CS, qua trung gian 6α-hydroxycastasterone, xác nhận bằng biểu hiện chức năng trong nấm men.
BR Những dữ liệu này cho thấy DWARF có liên quan đến quá trình oxy hóa C-6 trong quá trình sinh tổng hợp BR.
Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9
Công nghệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen gồm hai thành phần chính: RNA hướng dẫn xác định gen mục tiêu và enzyme Cas9 (CRISPR-associated protein 9) cắt DNA tại vị trí đó.
576 gây ra sự phá vỡ chuỗi DNA kép, cho phép sửa đổi gen bộ gen (xem Hình 2.1).
Hình 2.1 Hệ thống CRISPR/Cas9.
Hệ thống CRISPR/Cas9 sử dụng protein Cas9, một enzyme cắt DNA, được dẫn hướng bởi RNA dẫn hướng đơn tổng hợp (sgRNA) đến một trình tự DNA mục tiêu cụ thể (18–20 nucleotide) CRISPR, các trình tự lặp lại palindromic xen kẽ thường xuyên trong bộ gen vi khuẩn, cùng với protein Cas, tạo khả năng bảo vệ chống lại virus bằng cách cắt DNA virus.
CRISPR-Cas9 cần trình tự PAM gồm 5 nucleotide ở đầu 3' của RNA hướng dẫn (trình tự PAM khác nhau tùy thuộc vào vi khuẩn) Sửa chữa DNA sau khi cắt có thể diễn ra qua hai cơ chế: nối đầu không tương đồng (NHEJ) gây đột biến indel, hoặc sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) sử dụng khuôn mẫu DNA.
Công nghệ CRISPR-Cas9 cho phép chỉnh sửa gene chính xác đến từng cặp base đơn nhờ việc phân phối cùng lúc DNA tương đồng và hệ thống Cas9-sgRNA.
Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên cà chua
`Agrobacterium rhizogenes` biến đổi gen thực vật tạo rễ tơ, được ứng dụng đánh giá nhanh biểu hiện và chức năng gen ở cà chua Phương pháp này tạo nguồn lực cho nghiên cứu tế bào rễ cà chua (Solanum lycopersicum và Solanum pennellii) Hình ảnh hiển vi đồng tiêu quét laser trên rễ cà chua biến đổi gen giúp quan sát protein màng Quá trình phân lập hạt nhân tối ưu hóa cho phép theo dõi sự phong phú của RNA và biến đổi nhiễm sắc thể Các phóng viên phiên mã, dịch thuật và kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 xác nhận chức năng gen SHORT-ROOT và SCARECROW được bảo tồn.
Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) và cà chua.
Cà chua được tạo rễ tơ bằng phương pháp gây tổn thương lá mầm và đồng lọc với *A rhizogenes* (ATCC15834) Rễ này hình thành từ mô trụ dưới lá mầm, tương tự rễ bất định Quá trình này duy trì biểu hiện của các gen điều hòa liên quan.
Nghiên cứu chỉ ra 628 gen quan trọng được biểu hiện tương tự trong rễ bất định và rễ sơ cấp ở cây Arabidopsis, cho thấy tiềm năng sử dụng rễ bất định trong nghiên cứu gen Cấu trúc tế bào rễ bất định và rễ tơ cà chua gần như giống hệt nhau, ngoại trừ rễ tơ có thêm một lớp vỏ não Phương pháp sử dụng *A rhizogenes* cho phép trực quan hóa hiệu quả biểu hiện gen ở cấp độ tế bào trong rễ cà chua, tạo nguồn tài nguyên cho nghiên cứu loại tế bào gốc Các kỹ thuật INTACT và TRAP được tối ưu hóa để phân tích polyribosome trong rễ tơ biến đổi Cuối cùng, biến đổi rễ tơ được chứng minh là công cụ hiệu quả trong nghiên cứu chức năng gen bằng CRISPR.
Hình 2.2 Hệ thống CRISPR / Cas9 giới thiệu các đột biến ở các chất biến đổi ở rễ tơ và có thể được sử dụng để nghiên cứu chức năng gen ở rễ.
Hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến ở rễ tơ, hỗ trợ nghiên cứu chức năng gen Bài viết trình bày cấu trúc gen SlSCRpro-mGFP5 và SlSHR, bao gồm trình tự DNA và vị trí các mục tiêu CRISPR.
Nghiên cứu sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để chỉnh sửa gen mGFP5 và SlSHR trong rễ lông của cây biến đổi gen SlSCRpro-mGFP5 sgRNA nhắm vào mGFP5 làm giảm hoặc loại bỏ biểu hiện gen này, trong khi sgRNA nhắm vào SlSHR tạo ra rễ ngắn với sự phát triển bị hạn chế Phân tích DNA sau khi xử lý CRISPR-Cas9 xác nhận sự đột biến tại các vị trí mục tiêu Hình ảnh hiển vi cho thấy sự khác biệt rõ rệt về biểu hiện GFP giữa nhóm đối chứng và nhóm được chỉnh sửa gen.
H, Sắp xếp các trình tự có đột biến do Cas9 gây ra thu được từ rễ được biến nạp bằng Cas9 / sgRNA cho mGFP5 (G) và SHR (H) Trình tự kiểu hoang dã (WT) được hiển thị ở trên cùng Trình tự được nhắm mục tiêu bởi sgRNA tổng hợpđược hiển thị bằng màu đỏ và đột biến
692 được hiển thị bằng màu xanh lam Những thay đổi về độ dài so với kiểu hoang dã được hiển thị ở bên phải.[21]
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Giống cà chua Solanum lycopersicum được lấy từ Tây Nguyên, Đà Lạt, Lâm Đồng Việt Nam.
Viện Nghiên cứu Rau cung cấp giống cà chua VR2, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp giống VT3, và giống HP5 được chọn lọc tại Hải Phòng.
Viện Công nghệ sinh học đã cung cấp chủng *A rhizogenes* K599 (mang pFGC/gfp hoặc pZY102/gus) và *A tumefaciens* AGL1 (mang hệ thống CRISPR/Cas9) cho các nghiên cứu chuyển gen thực vật.
Jen Sheen's lab (Addgene_52254) provided the HBT-pcoCas9 vector; Robert Stupar's lab (Addgene_59188) supplied the pBlu/gRNA vector; and Professor Stacey's lab at the University of Missouri-Columbia (Addgene_84084) contributed the pFGC5941 vector.
- Các mồi đặc hiệu và DNA oligonucleotide được đặt tổng hợp nhân tạo bởi 30 công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)
- Môi trường và hóa chất: các loại môi trường cơ bản: MS, YEP Các hoa chất cơ bản: BAP, IAA, GA3.
Bài viết giới thiệu trang thiết bị hiện đại phục vụ nghiên cứu khoa học, bao gồm: nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, tủ lạnh âm sâu (-4 đến -200°C), tủ cấy vi sinh, máy đo pH, máy ly tâm, máy PCR, pipet, buồng sinh trưởng, nhà lưới và vườn ươm.
3.1.3 Quy trình Đề tài nghiên cứu gồm 6 nội dung:
Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen DWARF4 trên cà chua.
Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn
Agrobacterium rhizogene trên một số giống cà chua Việt Nam, kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9.
Nội dung 3: Tạo cây cà chua mang đột biến gen mã hóa Cytochrome P450 thông qua hệ thống CRISPR/Cas9.
Nội dung 4: Phân tích sự di truyền của các đột biến định hướng và gen chuyển
Nội dung 5: Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng cà chua mang đột biến định hướng.
Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9
- Phân tích thông tin về trình tự và biểu hiện gen
Gen Solyc02g089160 mã hóa protein cytochrome P450, có mức biểu hiện cao ở cà chua, được xác định dựa trên dữ liệu từ NCBI, Phytozome và SoyKB Các trình tự định hướng sgRNA tối ưu (2-3) được thiết kế bằng CRISPR-PLANT và CRISPR Design Tool, dựa trên phương pháp của Vibha Srivastava (2017), nhắm mục tiêu vào gen này Vector chuyển gen thực vật chứa gen Cas9 từ Addgene sẽ được sử dụng.
Cytochrome P450 gene-encoding sgRNA sequences and the Arabidopsis U6 promoter were assembled into a cloning vector using the NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF® v2).
Vector chuyển gen pFGC-Cas9 được cải tiến bằng cách ghép nối các cấu trúc mang trình tự định hướng và promoter U6, sử dụng hệ thống pFGC-Cas9-gateway từ phòng thí nghiệm giáo sư Stacey (Đại học Missouri, Mỹ) [2].
Vector pFGC5941(-) được biến đổi bằng cách chèn phân đoạn gen Cas9 (35S promoter-Cas9-Nos terminator) từ vector HBT-proCas9, sử dụng enzyme cắt hạn chế XhoI và EcoRI, tạo ra vector pFGC5941(-)/Cas9.
Bước 2 sử dụng phản ứng overlap PCR để khuếch đại hai phân đoạn phiên mã gRNA: PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI.
774 dụng khuôn là vector pBlu-gRNA và các cặp mồi như đã nêu trong bảng phụ lục 1.
Bước 3: Nối ghép đồng thời 2 phân đoạn phiên mã 2 gRNA vào vector pFGC5941()/Cas9 tạo thành vector hoàn chỉnh pFGC5941(-)/Cas9/gRNA1/gRNA2
+ Xử lý vector pFGC5941(-)/Cas9 bằng PstI.
+ Xử lý đồng thời 2 phân đoạn PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng cặp enzyme hạn chế PstI và EcoRI.
Enzyme T4-DNA ligase xúc tác phản ứng nối ghép vector pFGC5941(-)/Cas9 đã mở vòng với hai phân đoạn gRNA đã được xử lý enzyme cắt hạn chế.
Sơ đồ thiết kế của vector chuyển gen hoàn chỉnh được mô phỏng như Hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ minh họa cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 được thiết kế để chuyển gen vào cà chua.
Vecto chỉnh sửa gen, sau khi hoàn thiện, được chuyển vào vi khuẩn *A rhizogenes* và *A tumefaciens* AGL1 (nguồn: phòng Công nghệ tế bào thực vật) bằng phương pháp sốc nhiệt của David Neece (2013).
3.2.2 Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes
Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo rễ tơ in vitro trên cà chua để đánh giá hiệu quả chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 Hệ thống rễ tơ này sẽ được dùng để kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen.
Bảng 3 1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ in vitro cà chua
Tên môi trường Thành phần
Gieo hạt (GCM) MS (Murashige and Skoog, 1962); 20 g/l sucrose; 3g/l phytagel, pH 5,6
YEP (Yeast Extract Peptone); 12 g/l Bacto agar; kháng sinh (streptomycine, spectinomycine và kanamycine nồng độ
(500 mg/l) tùy thời điểm, pH 7,0
Lõy nhiễm ẵ MS; 20 g/l sucrose, pH 5,6
Nuôi cấy phát sinh rễ tơ (ICM)
MS; 30 g/l sucrose; 3,0 g/l phytagel; kháng sinh cefotaxime nồng độ (500 mg/l), pH 5,6
Chọn lọc rễ tơ MS; 30 g/l sucrose; 3,0 g/l phytagel; kháng sinh cefotaxime nồng độ (250-500 mg/l); glufosinate (1-3 mg/l)
Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ từ nốt lá mầm, cải tiến từ nghiên cứu của Chen và cộng sự (2018) [3], được mô tả chi tiết với thành phần môi trường nuôi cấy trong Bảng 3.1.
Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp
Hạt cà chua giống tốt, to, tròn, không hư hại được đặt riêng từng loại trong đĩa petri, sau đó khử trùng bằng khí trong bình hút ẩm bằng thủy tinh đặt trong tủ hút an toàn sinh học.
Hạt giống được khử trùng bằng Clo (từ 100ml NaOCl 10% và 4ml HCl 12N) trong 18-20 giờ, sau đó gieo 5 hạt/đĩa chứa 20ml môi trường GCM ở 26-28°C, chiếu sáng 8 giờ/ngày Lá mầm từ cây mầm 3 ngày tuổi được dùng cho biến nạp.
Biến nạp nuôi cấy tạo rễ tơ
Khuẩn *A rhizogenes* được hồi phục từ glycerol 25% (-80ºC), cấy tạo khuẩn lạc (2-3 ngày, 28ºC, tối), sau đó nuôi cấy huyền phù (250 vòng/phút, 28ºC, qua đêm) Sinh khối thu được được điều chỉnh mật độ OD660 = 0,6 trong môi trường lây nhiễm trước khi sử dụng cho biến nạp.
Sau 3 ngày gieo hạt, lá mầm được tách, gây tổn thương và ngâm trong huyền phù vi khuẩn 30 phút Mẫu được đồng nuôi cấy trên giấy thấm ẩm trong điều kiện sáng (24-26ºC) 5 ngày để nhiễm khuẩn.
Mảnh lá mầm cà chua được khử trùng bằng cefotaxime 500 mg/l, sau đó cấy trên môi trường ICM để cảm ứng tạo rễ tơ (1,5-2cm) trong 5 ngày ở 26°C, ánh sáng liên tục Rễ tơ được chuyển sang môi trường chọn lọc.
841 thu thập và sử dụng cho đánh giá biểu hiện của gen chuyển cũng như các phân tích khác.[4].
3.2.3 Kiểm tra sự có mặt và biểu hiện của gen chỉ thị và gen chọn lọc trong rễ tơ cà chua. Đối với hệ rễ tơ hình thành từ cấu trúc mang gen chỉ thị gus sẽ được ngâm trong dung dịch X-Gluc và đặt trong tủ ổn nhiệt 37ºC qua đêm theo phương pháp của Jefferson và đồng tác giả [5] Biểu hiện màu GUS (xanh lam) được quan sát, thống kê và chụp ảnh lưu giữ. Biểu hiện của gen gfp được kiểm tra bằng cách soi trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang (Oplympus- U-SPT (Japan-SZ X 12)), đoạn rễ tơ chứa cấu trúc chuyển gen sẽ phát sáng, độ phát sáng tùy thuộc vào biểu hiện của gen gfp Các dòng rễ tơ in vitro được tách chiết DNA genome theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1991).
ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục đánh giá khả năng làm giảm số lượng hạt của quả cà chua và thực hiện việc tạo ra giống áp dụng vào sản xuất ở quy lớn
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để giảm hàm lượng BRASSINOSTEROID ở cà chua và mở rộng khả năng ứng dụng cho các loại quả có hạt khó tiêu như ổi, ớt, nhằm cải thiện chất lượng nông sản.