Các tế bào khối u tuần hoàn CTC lần đầu tiên được mô tả vào năm 1869 bởi Thomas Asworth, người đã tìm thấy các tế bào có hình thái tế bào khối u trong máu của một người đã chết vì ung th
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC DÒ TÌM TẾ BÀO KHỐI U TUẦN HOÀN BẰNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện TS HUỲNH VĂN BIẾT LÊ HOÀNG PHÚC Th.S TRƯƠNG QUANG TOẢN LÊ THANH ÁI PUIH KIN NA TP Thủ Đức, 10/2023 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC .2 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 3 DANH SÁCH CÁC HÌNH 4 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 4 1.1 Đặt vấn đề 5 1.2 Mục tiêu nguyên cứu 5 1.3 Nội dung thực hiện 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 2.1 Tế bào khối u tuần hoàn (CTC) 6 2.2 Phương pháp làm giàu từ tính miễn dịch 6 2.3 Chất đánh dấu 6 2.4 CK19 6 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .8 3.1 Vật liệu 8 3.2 Phương pháp nghiên cứu 8 3.2.1 Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR 9 3.2.2 Điện di và kiểm tra sản phẩm 9 3.2.3 Định lượng CTC .10 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KHIẾN NGHỊ 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 2 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT CTC Circulating Tumor Cells CK19 Cytokeratin 19 RT- qPCR Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction Epcam Epithelial cell adhesion molecule CT Cycle Threshold 3 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1: Phương pháp làm giàu từ tính miễn dịch 7 Hình 2: Sơ đồ các bước dò tìm CTC 8 Hình 3: Trình tự primer 9 Hình 4: Điện di CK19 mRNA trên gel agarose 2% 10 Hình 5: Định lượng CTC 10 4 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Di căn ung thư, quá trình các tế bào khối u lan rộng từ khối u nguyên phát đến các cơ quan ở xa, là nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư Các tế bào khối u tuần hoàn (CTC) lần đầu tiên được mô tả vào năm 1869 bởi Thomas Asworth, người đã tìm thấy các tế bào có hình thái tế bào khối u trong máu của một người đã chết vì ung thư di căn Đã 20 năm sau, giả thuyết 'hạt giống và đất' được Paget đưa ra và được Fidler sửa đổi vào năm 2003 Khi một cái cây đi gieo hạt, hạt của nó được mang đi khắp mọi hướng, nhưng chúng chỉ có thể sống và phát triển nếu rơi vào mảnh đất phù hợp Vì vai trò quan trọng của CTC là hạt giống di căn, CTC đang trở thành một cột mốc quan trọng trong nghiên cứu ung thư Việc giải phóng CTC được coi là một trong những bước đầu tiên trong quá trình hình thành khối u Chúng cũng có thể hữu ích trong việc dự đoán sự tiến triển của bệnh và theo dõi hiệu quả điều trị 1.2 Mục tiêu nguyên cứu Sử dụng các kỹ thuật, thiết bị về Công nghệ sinh học để làm giàu tế bào CTC trong máu và dùng kỹ thuật RT-qPCR dò tìm mRNA CK19 để định lượng CTC 1.3 Nội dung thực hiện Nội dung 1: Làm giàu tế bào CTC Nội dung 2: Dò tìm mRNA CK19 ( dấu ấn sinh học được sử dụng để tìm kiếm CTC) bằng kỹ thuật RT-qPCR 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tế bào khối u tuần hoàn (CTC) Tế bào khối u tuần hoàn (Circulating Tumor Cells) được định nghĩa là các tế bào khối u đã bị bong ra khỏi khối u nguyên phát và bị hệ thống tuần hoàn hoặc bạch huyết cuốn trôi CTC đã được coi là chất nền của di căn Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về CTC đều tập trung vào CTC trong tuần hoàn máu Sự hiểu biết về dòng di căn của CTC có tiềm năng to lớn trong việc xác định các mục tiêu chống lại sự di căn của ung thư CTC có nguồn gốc từ ung thư biểu mô (ung thư có nguồn gốc biểu mô, phổ biến nhất) có thể được phân loại theo biểu hiện của dấu hiệu biểu mô.CTC có khả năng kháng anoikis, nghĩa là chúng có thể tồn tại trong máu mà không cần gắn vào chất nền 2.2 Phương pháp làm giàu từ tính miễn dịch Việc phát hiện CTC có thể có ý nghĩa quan trọng về tiên lượng và điều trị nhưng vì số lượng của chúng có thể rất nhỏ nên những tế bào này không dễ dàng được phát hiện Người ta ước tính rằng trong số các tế bào đã tách ra khỏi khối u nguyên phát, chỉ có 0,01% có thể hình thành di căn Các tế bào khối u tuần hoàn được tìm thấy với tần số khoảng 1-10 CTC trên mỗi mL máu toàn phần ở những bệnh nhân mắc bệnh di căn Để so sánh, một mL máu chứa vài triệu tế bào bạch cầu và một tỷ tế bào hồng cầu Do vậy cần yêu cầu những biện pháp làm giàu tế bào 2.3 Chất đánh dấu Chất đánh dấu phổ biến nhất để làm giàu CTC là phân tử kết dính tế bào biểu mô (EpCAM), một glycoprotein xuyên màng 40-kDa liên quan đến sự kết dính tế bào Sau đó nó được kết hợp thêm cytokeratins để tăng độ chính xác của việc phát hiện Kháng nguyên đặc hiệu cho EpCam sẽ chứa chất sắc từ, Eqcam là 1 protein biểu hiện trên tế bào biểu mô chứ không trên tế bào bạch cầu, và nếu ta có tế bào ctc thì nó sẽ bị dính với kháng nguyên EqCam, tế bào bạch cầu sẽ không bám dính với các kháng nguyên EqCam Sau đó dùng nam châm để thu được các tế bào CTC, lý tưởng nhất là loại bỏ hầu hết tế bào bạch cầu trong máu 2.4 CK19 Hơn 20 loại CK khác nhau đã được xác định, trong đó CK19 là thành viên nhỏ nhất trong họ protein CK Sự hiện diện của CK19 mRNA trong CTC chỉ ra rằng các tế bào này có nguồn gốc từ các khối u biểu mô, vì CK19 chủ yếu được biểu hiện ở các mô biểu mô Sự biểu hiện quá mức của CK19 đã được báo cáo trong khoảng 30 bệnh ác tính liên quan đến khối u, điều này chứng tỏ nó có thể là một dấu hiệu khối u hiệu quả để tiên lượng và đánh giá các khối u khác ở người trong giai đoạn đầu Do đó, việc phát hiện mRNA CK19 trong CTC có thể giúp xác định sự hiện diện của các tế bào ung thư đang lưu hành và cung cấp cái nhìn sâu sắc về đặc điểm của khối u nguyên phát, bao gồm cả nguồn gốc và đặc điểm phân tử của nó 6 Hình 1: Phương pháp làm giàu từ tính miễn dịch 7 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu - Làm giàu CTC Dung dịch điệm Tris-NH4Cl, Kháng thể đơn dòng cytokeratin-19 ở người , EpCAM ở người ,hạt từ tính , dung dịch muối đệm photphat (PBS) - RT-qPCR Hỗn hợp enzyme PrimeScript RT I, oligo dT primer, random 6-mers, dH2O không có RNase, cDNA, mồi xuôi CK-19 (10 pM), mồi ngược CK-19 (10 pM) ,đầu dò CK-19 (10 pM) và thuốc thử hỗn hợp LightCycler 480 Probes Master, diethylpyrocarbonate (DEPC) và H2O 3.2 Phương pháp nghiên cứu Các mẫu máu được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 800 rpm và huyết tương được loại bỏ Hồng cầu được loại bỏ bằng dung dịch hồng cầu sử dụng đệm Tris-NH4Cl Sau đó, tất cả các tế bào có nhân còn sót lại được phân tán lại trong 1 mL PBS Sau đó, EpCAM và CK-19 được thêm vào huyền phù tế bào và ủ ở 37°C trong 20 phút Sau khi ủ, các tế bào đích được làm giàu bằng phương pháp tách từ Các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và các hạt tế bào thu được được trộn trong 50 µL hỗn hợp khuếch đại Hình 2: Sơ đồ các bước dò tìm CTC 8 3.2.1 Khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ thuật RT-PCR - Giai đoạn RT (tổng hợp cDNA) Công thức cho một phản ứng: 1 µg RNA được phiên mã ngược trong 15 phút ợ 37°C trong hon hợp phãn ưng : 0,5 µl hỗn hợp enzyme PrimeScript RT I, 0,5 µl oligo dT primer, 2 µl random 6-mers,10 µl H2O không có RNase Phản ứng kết thúc bằng cách đun nóng ở 85°C trong 5 giây - Giai đoạn Real time PCR RT-PCR thời gian thực được thực hiện với tổng thể tích 20 µL, chứa 2 µL cDNA, 0,3 µg mồi xuôi CK-19 (10 pM), 0,3 µL mồi ngược CK-19 (10 pM) ,0,3 μL đầu dò CK-19 (10 pM) và 10 μL thuốc thử hỗn hợp LightCycler 480 Probes Master Cuối cùng, diethylpyrocarbonate (DEPC) và H2O được thêm vào hỗn hợp phản ứng Phản ứng PCR được bắt đầu sau 10 phút biến tính ở 95°C, và sau đó là quy trình tuần hoàn, bao gồm sự biến tính ở 95°C trong 10 giây và ủ ở 60°C trong 30 giây, được lặp lại 50 lần Phát hiện huỳnh quang được thực hiện vào cuối mỗi bước ủ trong 0,25 giây PCR được thực hiện như sau: 95°C trong 5 phút, tiếp theo là 95°C trong 10 giây, 55°C trong 10 giây và 72°C trong 1 phút lặp lại 39 chu kỳ , tiếp theo là 72°C trong 10 phút Sản phẩm PCR được chạy trên gel agarose 2% và nhuộm màu SYBR GREEN Hình 3: Trình tự primer 3.2.2 Điện di và kiểm tra sản phẩm Tất cả các sản phẩm RT-PCR được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2% và được phân tích tự động qua máy tính Mức CK19 được coi là dương tính khi số lượng bản sao ≥ 1000 9 Hình 4: Điện di CK19 mRNA trên gel agarose 2% 3.2.3 Định lượng CTC Số lượng CTC có thể được ước tính dựa trên mức độ biểu hiện gen Giá trị CT cao tương quan với mức độ biểu hiện gen thấp, trong khi giá trị CT thấp tương quan với mức độ biểu hiện gen cao Chu kỳ ngưỡng trên 36 được xem là không tìm thấy CTC Hình 5: Định lượng CTC 10 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phương pháp làm giàu từ tính miễn dịch tỏ ra hiệu quả để thu được các tế bào CTC Mức độ biểu hiện mRNA CK19 có liên quan đến sự gia tăng CTC Sử dụng duy nhất biểu hiện CK-19 mRNA để phát hiện CTC trong nghiên cứu hiện tại có thể là một hạn chế của nghiên cứu Cần có những nghiên cứu sâu hơn để làm rõ vai trò lâm sàng của phương pháp RT-PCR trong việc phát hiện CTC trong máu 11 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KHIẾN NGHỊ Việc sử dụng các dấu ấn sinh học tuần hoàn để chẩn đoán hoặc tiên lượng bệnh đang nhanh chóng được quan tâm Lĩnh vực này đòi hỏi phải phát triển hơn nữa và sẽ tiếp tục phát triển với những cải tiến về phương pháp làm giàu, giới hạn phát hiện, giảm lượng mẫu/nguyên liệu ban đầu, mở rộng số lượng chất đánh dấu để đạt được độ đặc hiệu cho phân tích và quan trọng nhất là giảm thời gian vận hành, chi phí , và cơ sở hạ tầng Việc xác nhận lâm sàng các dấu ấn sinh học đã được xác định này sẽ tiếp tục được yêu cầu ở các quần thể thuộc các dòng dõi khác nhau để đánh giá tác động và cách sử dụng của chúng trong tương lai 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ting mei, Xuewen Lu, Ning Sun, et al, Real-time quantitative PCR detection of circulating tumor cells using tag DNA mediated signal amplification strategy, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.06.009 S Morales, A Velasco, A Gasol, F Córdoba, et al Circulating tumor cells (CTCs) and cytokeratin 19 (CK19) mRNA as prognostic factors in heavily pretreated patients with metastatic breast cancer Cancer Treatment and Research Communications https://doi.org/10.1016/j.ctarc.2018.04.003 Morales S, Velasco A, Gasol A, et al Circulating tumor cells (CTCs) and cytokeratin 19 (CK19) mRNA as prognostic factors in heavily pretreated patients with metastatic breast cancer doi:10.1016/j.ctarc.2018.04.003 Park HS, Han HJ, Lee S, et al Detection of Circulating Tumor Cells in Breast Cancer Patients Using Cytokeratin-19 Real-Time RT-PCR doi:10.3349/ymj.2017.58.1.19 Mocellin S, Keilholz U, Rossi CR, Nitti D Circulating tumor cells: the 'leukemic phase' of solid cancers doi:10.1016/j.molmed.2006.01.006 Ulrich Andergassen, Alexandra C Kölbl, et al Real-Time qPCR-Based Detection of Circulating Tumor Cells from Blood Samples of Adjuvant Breast Cancer Patients: A Preliminary Study https://doi.org/10.1159/000447041 Masoumeh Mehrpouya, Zeinab Pourhashem, et al Evaluation of cytokeratin 19 as a prognostic tumoral and metastatic marker with focus on improved detection methods https://doi.org/10.1002/jcp.28768 Shengming Wu, Lei Gu, et al Rapid Label-Free Isolation of Circulating Tumor Cells from Patient Peripheral Blood Using Electrically Charged Fe3O4 Nanoparticles https://dx.doi.org/10.1021/acsami.9b16385 Khoo BL, Grenci G, Jing T, et al Liquid biopsy and therapeutic response: Circulating tumor cell cultures for evaluation of anticancer treatment doi:10.1126/sciadv.1600274 Saeideh Keyvani, Nasrin Karimi, et al Assessment of Cytokeratin-19 Gene Expression in Peripheral Blood of Breast Cancer Patients and Breast Cancer Cell Lines https://doi.org/10.4137/BIC.S38229 https://www.youtube.com/watch?v=vJu_jwcUXG0&t=2001s 13