Tb và kt cnsh báo cáo chiều t3 nhóm 1 phân lập và định danh một số chủng nấm có khả năng phân hủy nhựa pe

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA PO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM

CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Môn học : THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tháng 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM

CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT LÝ GIA HÂN 21126325

ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN 21126482

DƯƠNG VÕ PHƯƠNG NGÂN 21126413

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH SÁCH CÁC BẢNG 0

DANH SÁCH CÁC HÌNH 1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.1.1 Thực trạng ô nhiễm rác thải nhựa 1

1.1.1.1 Tại Việt Nam 1

1.1.1.2 Trên Thế giới 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Phân loại nhựa 2

2.2 Tổng quan về nhựa PE (Polyethylene) 2

2.2.1 Đặc điểm, tính chất của nhựa PE 2

2.2.1 Sự tiêu thụ PE 3

2.3 Phân hủy sinh học 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

3.1 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị 4

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 4

3.2.1 Định danh bằng hình thái 4

3.2.1.1 Đại thể 4

3.2.1.2 Vi thể 5

3.2.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 5

3.2.2.1 Thành phần 5

3.2.2.2 Thực hiện 5

3.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy nhựa PE 7

3.2.2.1 Đối tượng 7

3.2.2.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 7

3.2.2.3 Phương pháp thực hiện 8

3.2.2.4 Kết quả 9

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PE : Polyethylene

HDPE: Polyethylene high-density

LDPE :Low-density polyethylene

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các primer được sử dụng trong nghiên cứu 6 Bảng 3.2 Các primer được sử dụng trong khuếch đại PCR và trình tự DNA 7

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của PE 2 Hình 3.1 Kết quả chụp tấm PE dưới kính hiển vi điện tử SEM 9 Hình 3.2 Khảo sát sự thay đổi của tấm PE 9

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

1.1.1 Thực trạng ô nhiễm rác thải nhựa

1.1.1.1 Tại Việt Nam

có phạm vi ứng dụng rộng rãi cũng như tính linh hoạt trong quá trình sản xuất và sử dụng cùng với giá thành thấp hơn các mặt hàng khác Đó là lý do vì sao rác thải rắn đô thị (MSW) của các nước trên thế giới được báo cáo chứa khoảng 12% nhựa Việt Nam nằm trong top 5 nước nhập khẩu PW nhiều nhất từ tháng 01/2018 đến tháng 11/2018 với khoảng 7,6% tổng lượng nhập khẩu Thực trạng hiện nay cho thấy Việt Nam là quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề bởi rác thải nhựa, gây hậu quả nặng nề cho môi trường Công trình này đưa ra những con số đáng báo động về thực trạng sử dụng và xả thải nhựa ở Việt Nam Quan trọng hơn, chính sách và kịch bản xử lý rác thải nhựa trong thời gian tới được phân tích kỹ lưỡng để tìm ra giải pháp hợp lý nhằm giảm thiểu ô nhiễm do rác thải nhựa ở Việt Nam Cuối cùng, một số gợi ý tái sử dụng rác thải nhựa cũng được đưa

ra nhằm thu hồi và xử lý rác thải nhựa trong bối cảnh Việt Nam Tuy nhiên, chỉ có khoảng 9% tổng số chất thải nhựa được tái chế và có tới 60% trong số đó được chôn trong bãi rác hoặc bị loại bỏ dưới dạng rác trong môi trường trên cạn

1.1.1.2 Trên Thế giới

Trong khi đó, toàn thế giới có đến 204 quốc gia và nhiều khu tự trị, vùng lãnh thổ

khác Tuy không thể thống kê một cách chính xác lượng rác thải trên toàn cầu nhưng theo ước tính, con số này có thể ở mức 4 tỷ - 5 tỷ tấn mỗi năm Trong đó, 50% là từ các nước phát triển Mỗi năm, toàn thế giới thải ra khoảng 300 triệu tấn rác thải nhựa và 5.000 tỷ túi nilon Trong đó: Có đến một nửa sản phẩm nhựa chỉ dùng một lần; 1/3 số

túi nilon không được thu gom; 12,7 triệu tấn rác thải sẽ đi vào đại dương

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định một số chủng nấm có khả năng phân hủy nhựa PE ứng dụng phát triển một số giải pháp trong việc giải quyết các vấn đề ô nhiễm môi trường do nhựa gây ra

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Phân loại nhựa

Các sản phẩm nhựa được sử dụng rộng rãi và rộng rãi, và các thành phần polymer

nhựa khác nhau tùy thuộc vào các ứng dụng dự định của các sản phẩm mà chúng được

sử dụng để chế tạo Các loại nhựa phổ biến bao gồm polyetylen mật độ cao (HDPE), polyetylen mật độ thấp (LDPE) và polyethylene terephthalate (PET) Tính đến năm

2020, khoảng 367 triệu tấn sản phẩm nhựa đã được sản xuất Khối lượng sản xuất nhựa

đã tăng đáng kể kể từ những năm 1990 (Plastics Europe, 2021)

Nhựa là polyme tổng hợp Nhựa là các phân tử polyme chuỗi dài nhân tạo Chúng được sử dụng rộng rãi vật liệu dễ sử dụng, kinh tế được đặc trưng bởi các đặc tính toàn diện tuyệt vời, dễ dàng đúc và sản xuất Theo truyền thống, nhựa rất ổn định và không

dễ bị phân hủy trong môi trường xung quanh Kết quả là ô nhiễm môi trường từ nhựa tổng hợp đã được công nhận là một vấn đề lớn

2.2 Tổng quan về nhựa PE (Polyethylene)

2.2.1 Đặc điểm, tính chất của nhựa PE

Polyethylene (PE) là một loại nhựa nhiệt dẻo đã và đang được sử dụng rất phổ biến

vì chúng có đặc tính là bền, đa dạng, tiện dụng và rất rẻ Polyetylen là một hợp chất hữu

cơ (poly) gồm nhiều nhóm etylen CH2-CH2 liên kết với nhau bằng các liên kết hydro

no Polyetylen được điều chế bằng phản ứng trùng hợp các monome etylen (C2H4) Polyetylen màu trắng, hơi trong, không dẫn điện và không dẫn nhiệt, không cho nước

và khí thấm qua Tùy thuộc vào loại PE mà chúng có nhiệt độ hóa thủy tinh Tg ≈ -100

°C và nhiệt độ nóng chảy Tm ≈ 120 °C

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của nhựa PE

2.2.1 Sự tiêu thụ PE

Các loại nhựa nhiệt dẻo được sử dụng nhiều nhất là PE, PP, PVC và PET Trong

cơ cấu tiêu thụ vật liệu nhựa toàn cầu năm 2017, PE (với các dẫn xuất HDPE, LDPE, LLDPE) và PP chiếm tỉ trọng cao nhất với lần lượt 28% và 20% và đứng thứ 3 trong cơ cấu tiêu thụ là PVC với 12% (Muhonja và ctv, 2018) Ở Việt Nam, lượng tiêu thụ sản phẩm nhựa đang tăng lên nhanh chóng Các thống kê và nghiên cứu ở Việt Nam vẫn chưa cung cấp các thông tin cụ thể về lượng, loại và thành phần của nhựa thải ra môi trường, mà chỉ có một số nghiên cứu về chất thải nhựa nói chung ở một số địa phương Phân tích và tổng hợp sinh thái quốc gia (NCEAS) của Hoa Kì đã công bố một kết quả nghiên cứu trên Tạp chí Science (tháng 2/2015), trong đó chỉ ra rằng tại Việt Nam, ước tính lượng nhựa thải ra biển khoảng 0,28-0,73 triệu tấn/năm (chiếm 6% tổng lượngnhựa thải ra biển của thế giới), đứng thứ 4 trong danh sách các quốc gia có lượng nhựa thải

ra biển nhiều nhất (Jambeck và ctv, 2015)

Hiểm họa từ rác nhựa thể hiện ở chỗ đây là chất liệu bền, chậm phân hủy nhưng lại dễ sản xuất Nhựa là chất liệu không tự phân hủy sinh học mà chỉ có thể phân hủy bởi ánh sáng mặt trời hoặc phân rã thành những mảnh nhỏ Nhựa đang trở thành thứ gây

ô nhiễm môi trường lớn nhất có ở cả lòng đất, trên không khí và dưới đại dương (Jambeck và ctv, 2015)

2.3 Phân hủy sinh học

Phân hủy sinh học có thể định nghĩa là quá trình làm biến chất các vật liệu PE thôngqua các vi sinh vật Trong quá trình này cần có sự tham gia của nhiều loại vi sinh vật khác nhau và bị chi phối bởi các yếu tố như: đặc điểm polymer, loại vi sinh vật và bản chất của quá trình tiền xử lí Trong quá trình phân hủy polymer đầu tiên sẽ được chuyển thành các monomer sau đó các monomer được khoáng hóa Phần lớn các polymer quá lớn để đi qua màng tế bào nên chúng phải được khử thành các monomer trước rồi mới được hấp thụ và phân hủy trong tế bào vi sinh vật Suốt trong quá trình phân hủy thì các exoenzyme từ visinh vật phá vỡ polymer phức tạp tạo ra các phân tử nhỏ hơn của chuỗi ngắn ví dụ như: oligomer, dimer, monomer những chuỗi ngắn này

đủ nhỏ để vượt qua màng bán thấm bên ngoài vi khuẩn và sau đó được sử dụng như nguồn carbon và năng lượng Khi sản phẩm cuối cùng là CO2, H2O hay CH4 thì hoàn thành quá trình phân hủy sinh học của polymer (Shah và ctv, 2008)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu đất được lấy tại các bãi rác tại vị trí có lẫn nhựa PE mục trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh

Loại PE được lựa chọn trong đồng bộ các thực nghiệm là LDPE có độ dày 22,5 µm, không có xúc tác hoặc phụ gia

3.1.2 Dụng cụ

Bình erlen, que cấy trang, máy kéo vạn năng, máy lắc, nồi hấp, dụng cụ tiêu hao

3.1.3 Môi trường sử dụng

LCFSDA (nước cất: 1000mL; peptone: 10g; PE: 1g) môi trường lỏng đặc hiệu với nguồn carbon duy nhất là PE Giúp chọn lọc các chủng nấm có khả năng phân hủy PE CFBSDA (được chuẩn bị bằng cách bổ sung 15g agar vào 1000mL môi trường LCFSDA môi trường thạch dùng để phân lập nấm

SDA (dextrose (glucose): 40g; peptone: 10g; agar: 15g; nước cất: 1000mL) môi trường hỗ trợ tăng sinh nấm

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Lấy 20g đất/mẫu cho vào cốc thủy tinh và làm nhuyễn, pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5, trộn đều mẫu và hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên cho vào đĩa môi trường đặc hiệu dùng phân lập nấm phân hủy PE là CFBSDA với nguồn carbon duy nhất là PE Mẫu được ủ trong tủ ở 37oC trong 21 ngày Những khuẩn lạc phát triển trên môi trường này được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường SDA (nấm)

để tuyển chọn các chủng thuần trước khi cấy chuyển sang môi trường chọn lọc LCFSDA

3.2.1 Định danh bằng hình thái

3.2.1.1 Đại thể

Quan sát ghi nhận các kết quả mô tả đem so sách với các kết quả nghiên cứu trước đât

3.2.1.2 Vi thể

Thông qua phương pháp nhuộm sợi nấm, và sử dụng kính hiển vi với độ phóng đại 40

X, 100 X Mô tả bào tử, sợ nấm, thể sinh bào tử, các cấu trức đặc biệt dựa trên các nghiên cứu trước đâu so sánh và xem xét sự tương đồng nhằm định danh hình thái

3.2.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

3.2.2.1 Thành phần

Mẫu nấm

Buffer cetyltrimethylammonium bromide

Bộ mồi ITS1F/ITS4

Bộ kit Expin™ PCR purification

3.2.2.2 Thực hiện

Thu dòng nấm cho vào ống nghiệm để nhân sinh khối nấm Ly trích thu DNA bộ gen bằng cách sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide Bộ đệm CTAB có hiệu quả trong việc loại bỏ các polysaccharide và polyphenol khỏi các chế phẩm DNA thực vật CTAB (còn gọi là hexadecyltrimethylammonium bromide) là chất tẩy cation tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách polysacarit trong quá trình tinh chế trong khi các chất khác, chẳng hạn như polyvinylpyrrolidone, hỗ trợ vô hiệu hóa polyphenol Dung dịch đệm chiết dựa trên CTAB được sử dụng rộng rãi khi tinh chế DNA từ mô thực vật Tất cả các chủng ban đầu được xác định bằng cách sử dụng trình tự vùng đệm được phiên mã nội bộ (ITS) Để thu được trình tự ITS, PCR được tiến hành bằng cách sử dụng bộ mồi ITS1F/ITS4 Các mồi ITS1f nhắm vào một vị trí trong vùng mã hóa tiểu đơn vị nhỏ ribosome (SSU) và ITS4 nhắm vào một vị trí nằm trong vùng mã hóa tiểu đơn vị lớn ribosome (LSU)

Bảng 3.1 Các primer được sử dụng trong nghiên cứu

Nguồn: doi:10.1371/journal.pone.0097629.t001

Với máy PCR BIORAD C1000 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ biến tính ở 95°C trong 40 giây, ủ ở 55°C trong

40 giây và kéo dài ở 72°C trong 60 giây; và phần mở rộng cuối cùng ở 72°C trong 5 phút Khuếch đại PCR được kiểm tra bằng gel agarose 1%và tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit Expin™ PCR purification Tinh sạch PCR để loại bỏ hiệu quả các mồi ngắn, dNTP không hợp nhất, enzyme, sản phẩm PCR bị lỗi ngắn và muối khỏi phản ứng PCR Trình tự được thực hiện bằng Máy phân tích DNA ABI 3730xL Theo kỹ thuật điện di mao quản gel (CGE) trong nghiên cứu sinh học phân tử phương pháp CGE sử dụng mạng lưới gel trong mao quản để tách các chất phân tích Mạng lưới gel có những lỗ xốp kích thước cỡ phân tử chứa đầy dung dịch đệm, với mạng lưới lỗ xốp như vậy sẽ tạo cho mao quản như một cái “rây” để phân loại các phân tử chất phân tích theo kích thước Có hai loại gel thường được sử dụng hiện nay là gel polyacrylamide và gel agarose (polysaccharide được tách ra từ rong biển)

Phương pháp CGE được áp dụng rất hiệu quả trong y học lâm sàng, trong sinh học để tách các protein có khối lượng phân tử lớn, các phân đoạn DNA, các nucleotid, các peptide, các polymer

Tất cả các trình tự đều được làm bằng ứng dụng FinchTV v.1.4 và được xác định bằng BLAST trong NCBI ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) Việc xác định loài được chỉ định cho các loài có độ giống nhau trên 97% trong BLAST bằng cơ sở dữ liệu NCBI Để xác định chính xác loài, phân tích phát sinh gen RAxML của vùng ITS cho mỗi chi được thực hiện bằng cách sử dụng các trình tự tham chiếu từ GenBank Các vùng Actin ( act ) và RNA polymerase II tiểu đơn vị B ( rpb2) của Cladosporium và Trichoderma, tương ứng, được khuếch đại bổ sung theo cách tương tự như mô tả ở trên để xác định loài chính xác ACT-512F/ACT-783R hoặc ACT1Fd/ACT1Rd cho act và fRPB2-5F/fRPB2-7cR cho rpb2 được sử dụng làm bộ mồi

Bảng 3.2 Các primer được sử dụng trong khuếch đại PCR và trình tự DNA

Nguồn: doi:10.1080/12298093.2022.2152951

Quá trình tiếp theo như mô tả ở trên Tất cả các trình tự được tạo ra trong nghiên cứu này đã được gửi vào GenBank Tất cả nhiều sự sắp xếp được thực hiện bằng MAFFT v.7 với các tùy chọn mặc định Bằng cách sử dụng RAxML các phân tích khả năng tối đa

đã được thực hiện trong cổng web CIPRES với mô hình đảo ngược thời gian chung GTR+ GAMMA với 1.000 lần sao chép bootstrap

3.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy nhựa PE

3.2.2.1 Đối tượng

Loại PE được lựa chọn trong đồng bộ các thực nghiệm là LDPE có độ dày 22,5

µm, không có xúc tác hoặc phụ gia Màng PE được cắt thành các tấm vuông 50 mm × 50

mm để ủ trong môi trường thạch và màng PE 100mg để ủ trong môi trường lỏng Vật liệu

PE được cân, khử trùng bằng ethanol 75% và sau đó sấy khô trong không khí trong dòng chảy tầng trước khi sử dụng

3.2.2.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu

Đo trọng lượng của tấm PE Bắt đầu và nhân giống các phản ứng chuỗi gốc tự do với sự có mặt của oxy trong khí quyển Các quá trình này dẫn đến sự phân hủy một phần

PE, tức là phân mảnh chuỗi polyetylen dài thành các mảnh chuỗi ngắn thường kết thúc bằng các nhóm chức năng (carboxyl, ketone và rượu) Tuy nhiên, đôi khi những mảnh vỡ

này vẫn còn quá dài để xâm nhập qua thành tế bào của vi sinh vật Vì lý do này, chúng lần

bị tấn công bởi các enzyme ngoại bào Sau đó, bằng dint của các chất hoạt động bề mặt sinh học ngoại bào do vi sinh vật tiết ra, các mảnh polyetylen trải qua sự bám dính vào thành tế bào và do đó dễ dàng xâm nhập vào bên trong các tế bào của vi sinh vật Do đó, trọng lượng phân tử của PE giảm một cách có hệ thống

Trọng lượng tấm PE được đánh giá dựa vào các chỉ tiêu Đo vị trí các tấm PE cách bề mặt môi trường nuôi cấy bằng thước kẹp; các tấm PE sau đó được rửa sạch, sấy khô và cân để xác định khối lượng

3.2.2.3 Phương pháp thực hiện

CFBSDA vô trùng (15ml) được đổ vào đĩa Petri (90 mm) và làm nguội ở nhiệt

độ phòng Từ các chủng đã được làm thuần tiến hành tăng sinh và pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5, trộn đều mẫu và hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên trải đều đồng nhất trên bề mặt của tấm CFBSDA, sau đó được phủ lên với tấm PE (50 mm × 50 mm) Bên cạnh đó, trong điều kiện vô trùng tấm PE được thêm vào

mà không cấy mẫu Các đĩa CFBSDA được cấy mẫu không bổ sung màng PE được sử dụng làm đối chứng âm để kiểm tra xem các chủng phân lập có thể phát triển trên riêng thạch không Tất cả các đĩa sau đó được dán kín bằng Parafilm và ủ ở 30°C và độ ẩm tương đối 85% trong 28 ngày

Tấm màng PE được chuyển vào tube 50 ml với 40 ml SW và tube được vortex trong 5 phút Sau đó đem tube ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút Phần nổi phía trên được loại bỏ và kết tủa được giữ lại trong 5ml SW Số lượng tế bào huyền phù được đếm sử dụng phương pháp đếm đĩa pha loãng hàng loạt

Huyền phù tế bào (10 ml) được thêm vào bình erlen 150ml với 40ml LCFSDA Bình được ủ trên máy lắc quay (120 vòng/phút) ở 30°C từ 1-2 ngày Sau đó, phân phối dung dịch vào ống nghiệm và bổ sung tấm PE (3mm x3mm) vào Bên cạnh đó, cần chuẩn

bị thêm ống chứa môi trường LCFSDA không xử lý vi sinh để làm đối chứng âm Quan sát kết quả sau 28 ngày nuôi cấy