Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA PO
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mơn học : THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tháng 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE Giảng viên hướng dẫn TS HUỲNH VĂN BIẾT Sinh viên thực LÝ GIA HÂN ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN DƯƠNG VÕ PHƯƠNG NGÂN Tháng 10/2023 21126325 21126482 21126413 MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .1 DANH SÁCH CÁC BẢNG .0 DANH SÁCH CÁC HÌNH CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Thực trạng ô nhiễm rác thải nhựa 1.1.1.1 Tại Việt Nam .1 1.1.1.2 Trên Thế giới .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại nhựa 2.2 Tổng quan nhựa PE (Polyethylene) 2.2.1 Đặc điểm, tính chất nhựa PE 2.2.1 Sự tiêu thụ PE .3 2.3 Phân hủy sinh học .3 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .4 3.1 Vật liệu nghiên cứu thiết bị 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Định danh hình thái .4 3.2.1.1 Đại thể 3.2.1.2 Vi thể 3.2.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử .5 3.2.2.1 Thành phần 3.2.2.2 Thực 3.2.2 Đánh giá khả phân hủy nhựa PE 3.2.2.1 Đối tượng 3.2.2.2 Phương pháp phân tích tiêu .7 3.2.2.3 Phương pháp thực 3.2.2.4 Kết TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PE : Polyethylene HDPE: Polyethylene high-density LDPE : Low-density polyethylene ii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các primer sử dụng nghiên cứu Bảng 3.2 Các primer sử dụng khuếch đại PCR trình tự DNA iv DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hóa học PE .2 Hình 3.1 Kết chụp PE kính hiển vi điện tử SEM Hình 3.2 Khảo sát thay đổi PE v CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.1.1 Thực trạng ô nhiễm rác thải nhựa 1.1.1.1 Tại Việt Nam Các loại mặt hàng từ nhựa có gia tăng lớn chất lượng số lượng có phạm vi ứng dụng rộng rãi tính linh hoạt trình sản xuất sử dụng với giá thành thấp mặt hàng khác Đó lý rác thải rắn thị (MSW) nước giới báo cáo chứa khoảng 12% nhựa Việt Nam nằm top nước nhập PW nhiều từ tháng 01/2018 đến tháng 11/2018 với khoảng 7,6% tổng lượng nhập Thực trạng cho thấy Việt Nam quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề rác thải nhựa, gây hậu nặng nề cho mơi trường Cơng trình đưa số đáng báo động thực trạng sử dụng xả thải nhựa Việt Nam Quan trọng hơn, sách kịch xử lý rác thải nhựa thời gian tới phân tích kỹ lưỡng để tìm giải pháp hợp lý nhằm giảm thiểu ô nhiễm rác thải nhựa Việt Nam Cuối cùng, số gợi ý tái sử dụng rác thải nhựa đưa nhằm thu hồi xử lý rác thải nhựa bối cảnh Việt Nam Tuy nhiên, có khoảng 9% tổng số chất thải nhựa tái chế có tới 60% số chơn bãi rác bị loại bỏ dạng rác môi trường cạn 1.1.1.2 Trên Thế giới Trong đó, tồn giới có đến 204 quốc gia nhiều khu tự trị, vùng lãnh thổ khác Tuy khơng thể thống kê cách xác lượng rác thải toàn cầu theo ước tính, số mức tỷ - tỷ năm Trong đó, 50% từ nước phát triển Mỗi năm, toàn giới thải khoảng 300 triệu rác thải nhựa 5.000 tỷ túi nilon Trong đó: Có đến nửa sản phẩm nhựa dùng lần; 1/3 số túi nilon không thu gom; 12,7 triệu rác thải vào đại dương 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định số chủng nấm có khả phân hủy nhựa PE ứng dụng phát triển số giải pháp việc giải vấn đề ô nhiễm môi trường nhựa gây CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Phân loại nhựa Các sản phẩm nhựa sử dụng rộng rãi rộng rãi, thành phần polymer nhựa khác tùy thuộc vào ứng dụng dự định sản phẩm mà chúng sử dụng để chế tạo Các loại nhựa phổ biến bao gồm polyetylen mật độ cao (HDPE), polyetylen mật độ thấp (LDPE) polyethylene terephthalate (PET) Tính đến năm 2020, khoảng 367 triệu sản phẩm nhựa sản xuất Khối lượng sản xuất nhựa tăng đáng kể kể từ năm 1990 (Plastics Europe, 2021) Nhựa polyme tổng hợp Nhựa phân tử polyme chuỗi dài nhân tạo Chúng sử dụng rộng rãi vật liệu dễ sử dụng, kinh tế đặc trưng đặc tính tồn diện tuyệt vời, dễ dàng đúc sản xuất Theo truyền thống, nhựa ổn định không dễ bị phân hủy môi trường xung quanh Kết ô nhiễm môi trường từ nhựa tổng hợp công nhận vấn đề lớn 2.2 Tổng quan nhựa PE (Polyethylene) 2.2.1 Đặc điểm, tính chất nhựa PE Polyethylene (PE) loại nhựa nhiệt dẻo sử dụng phổ biến chúng có đặc tính bền, đa dạng, tiện dụng rẻ Polyetylen hợp chất hữu (poly) gồm nhiều nhóm etylen CH2-CH2 liên kết với liên kết hydro no Polyetylen điều chế phản ứng trùng hợp monome etylen (C2H4) Polyetylen màu trắng, trong, không dẫn điện không dẫn nhiệt, không cho nước khí thấm qua Tùy thuộc vào loại PE mà chúng có nhiệt độ hóa thủy tinh Tg ≈ -100 °C nhiệt độ nóng chảy Tm ≈ 120 °C Hình 2.1 Cấu trúc hóa học nhựa PE 2.2.1 Sự tiêu thụ PE Các loại nhựa nhiệt dẻo sử dụng nhiều PE, PP, PVC PET Trong cấu tiêu thụ vật liệu nhựa toàn cầu năm 2017, PE (với dẫn xuất HDPE, LDPE, LLDPE) PP chiếm tỉ trọng cao với 28% 20% đứng thứ cấu tiêu thụ PVC với 12% (Muhonja ctv, 2018) Ở Việt Nam, lượng tiêu thụ sản phẩm nhựa tăng lên nhanh chóng Các thống kê nghiên cứu Việt Nam chưa cung cấp thông tin cụ thể lượng, loại thành phần nhựa thải mơi trường, mà có số nghiên cứu chất thải nhựa nói chung số địa phương Phân tích tổng hợp sinh thái quốc gia (NCEAS) Hoa Kì cơng bố kết nghiên cứu Tạp chí Science (tháng 2/2015), Việt Nam, ước tính lượng nhựa thải biển khoảng 0,28-0,73 triệu tấn/năm (chiếm 6% tổng lượng nhựa thải biển giới), đứng thứ danh sách quốc gia có lượng nhựa thải biển nhiều (Jambeck ctv, 2015) Hiểm họa từ rác nhựa thể chỗ chất liệu bền, chậm phân hủy lại dễ sản xuất Nhựa chất liệu không tự phân hủy sinh học mà phân hủy ánh sáng mặt trời phân rã thành mảnh nhỏ Nhựa trở thành thứ gây ô nhiễm môi trường lớn có lịng đất, khơng khí đại dương (Jambeck ctv, 2015) 2.3 Phân hủy sinh học Phân hủy sinh học định nghĩa trình làm biến chất vật liệu PE thông qua vi sinh vật Trong trình cần có tham gia nhiều loại vi sinh vật khác bị chi phối yếu tố như: đặc điểm polymer, loại vi sinh vật chất q trình tiền xử lí Trong trình phân hủy polymer chuyển thành monomer sau monomer khống hóa Phần lớn polymer lớn để qua màng tế bào nên chúng phải khử thành monomer trước hấp thụ phân hủy tế bào vi sinh vật Suốt trình phân hủy exoenzyme từ vi sinh vật phá vỡ polymer phức tạp tạo phân tử nhỏ chuỗi ngắn ví dụ như: oligomer, dimer, monomer chuỗi ngắn đủ nhỏ để vượt qua màng bán thấm bên ngồi vi khuẩn sau sử dụng nguồn carbon lượng Khi sản phẩm cuối CO2, H2O hay CH4 hồn thành trình phân hủy sinh học polymer (Shah ctv, 2008) CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu nghiên cứu thiết bị 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu đất lấy bãi rác vị trí có lẫn nhựa PE mục khu vực thành phố Hồ Chí Minh Loại PE lựa chọn đồng thực nghiệm LDPE có độ dày 22,5 µm, khơng có xúc tác phụ gia 3.1.2 Dụng cụ Bình erlen, que cấy trang, máy kéo vạn năng, máy lắc, nồi hấp, dụng cụ tiêu hao 3.1.3 Môi trường sử dụng LCFSDA (nước cất: 1000mL; peptone: 10g; PE: 1g) môi trường lỏng đặc hiệu với nguồn carbon PE Giúp chọn lọc chủng nấm có khả phân hủy PE CFBSDA (được chuẩn bị cách bổ sung 15g agar vào 1000mL môi trường LCFSDA môi trường thạch dùng để phân lập nấm SDA (dextrose (glucose): 40g; peptone: 10g; agar: 15g; nước cất: 1000mL) môi trường hỗ trợ tăng sinh nấm 3.2 Phương pháp nghiên cứu Lấy 20g đất/mẫu cho vào cốc thủy tinh làm nhuyễn, pha loãng mẫu nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5, trộn mẫu hút 0,5 ml dịch pha loãng nồng độ cho vào đĩa môi trường đặc hiệu dùng phân lập nấm phân hủy PE CFBSDA với nguồn carbon PE Mẫu ủ tủ 37oC 21 ngày Những khuẩn lạc phát triển môi trường cấy chuyển nhiều lần môi trường SDA (nấm) để tuyển chọn chủng trước cấy chuyển sang môi trường chọn lọc LCFSDA 3.2.1 Định danh hình thái 3.2.1.1 Đại thể Quan sát ghi nhận kết mô tả đem so sách với kết nghiên cứu trước đât 3.2.1.2 Vi thể Thông qua phương pháp nhuộm sợi nấm, sử dụng kính hiển vi với độ phóng đại 40 X, 100 X Mơ tả bào tử, sợ nấm, thể sinh bào tử, cấu trức đặc biệt dựa nghiên cứu trước đâu so sánh xem xét tương đồng nhằm định danh hình thái 3.2.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử 3.2.2.1 Thành phần Mẫu nấm Buffer cetyltrimethylammonium bromide Bộ mồi ITS1F/ITS4 Bộ kit Expin™ PCR purification 3.2.2.2 Thực Thu dòng nấm cho vào ống nghiệm để nhân sinh khối nấm Ly trích thu DNA gen cách sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide Bộ đệm CTAB có hiệu việc loại bỏ polysaccharide polyphenol khỏi chế phẩm DNA thực vật CTAB (còn gọi hexadecyltrimethylammonium bromide) chất tẩy cation tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách polysacarit trình tinh chế chất khác, chẳng hạn polyvinylpyrrolidone, hỗ trợ vơ hiệu hóa polyphenol Dung dịch đệm chiết dựa CTAB sử dụng rộng rãi tinh chế DNA từ mô thực vật Tất chủng ban đầu xác định cách sử dụng trình tự vùng đệm phiên mã nội (ITS) Để thu trình tự ITS, PCR tiến hành cách sử dụng mồi ITS1F/ITS4 Các mồi ITS1f nhắm vào vị trí vùng mã hóa tiểu đơn vị nhỏ ribosome (SSU) ITS4 nhắm vào vị trí nằm vùng mã hóa tiểu đơn vị lớn ribosome (LSU) Bảng 3.1 Các primer sử dụng nghiên cứu Nguồn: doi:10.1371/journal.pone.0097629.t001 Với máy PCR BIORAD C1000 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: biến tính ban đầu 95°C phút; 35 chu kỳ biến tính 95°C 40 giây, ủ 55°C 40 giây kéo dài 72°C 60 giây; phần mở rộng cuối 72°C phút Khuếch đại PCR kiểm tra gel agarose 1%và tinh sản phẩm PCR kit Expin™ PCR purification Tinh PCR để loại bỏ hiệu mồi ngắn, dNTP không hợp nhất, enzyme, sản phẩm PCR bị lỗi ngắn muối khỏi phản ứng PCR Trình tự thực Máy phân tích DNA ABI 3730xL Theo kỹ thuật điện di mao quản gel (CGE) nghiên cứu sinh học phân tử phương pháp CGE sử dụng mạng lưới gel mao quản để tách chất phân tích Mạng lưới gel có lỗ xốp kích thước cỡ phân tử chứa đầy dung dịch đệm, với mạng lưới lỗ xốp tạo cho mao quản “rây” để phân loại phân tử chất phân tích theo kích thước Có hai loại gel thường sử dụng gel polyacrylamide gel agarose (polysaccharide tách từ rong biển) Phương pháp CGE áp dụng hiệu y học lâm sàng, sinh học để tách protein có khối lượng phân tử lớn, phân đoạn DNA, nucleotid, peptide, polymer Tất trình tự làm ứng dụng FinchTV v.1.4 xác định BLAST NCBI ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ) Việc xác định loài định cho lồi có độ giống 97% BLAST sở liệu NCBI Để xác định xác lồi, phân tích phát sinh gen RAxML vùng ITS cho chi thực cách sử dụng trình tự tham chiếu từ GenBank Các vùng Actin ( act ) RNA polymerase II tiểu đơn vị B ( rpb2) Cladosporium Trichoderma, tương ứng, khuếch đại bổ sung theo cách tương tự mô tả để xác định lồi xác ACT-512F/ACT-783R ACT1Fd/ACT1Rd cho act fRPB2-5F/fRPB27cR cho rpb2 sử dụng làm mồi Bảng 3.2 Các primer sử dụng khuếch đại PCR trình tự DNA Nguồn: doi:10.1080/12298093.2022.2152951 Quá trình mơ tả Tất trình tự tạo nghiên cứu gửi vào GenBank Tất nhiều xếp thực MAFFT v.7 với tùy chọn mặc định Bằng cách sử dụng RAxML phân tích khả tối đa thực cổng web CIPRES với mơ hình đảo ngược thời gian chung GTR+ GAMMA với 1.000 lần chép bootstrap 3.2.2 Đánh giá khả phân hủy nhựa PE 3.2.2.1 Đối tượng Loại PE lựa chọn đồng thực nghiệm LDPE có độ dày 22,5 µm, khơng có xúc tác phụ gia Màng PE cắt thành vng 50 mm × 50 mm để ủ mơi trường thạch màng PE 100mg để ủ môi trường lỏng Vật liệu PE cân, khử trùng ethanol 75% sau sấy khơ khơng khí dòng chảy tầng trước sử dụng 3.2.2.2 Phương pháp phân tích tiêu Đo trọng lượng PE Bắt đầu nhân giống phản ứng chuỗi gốc tự với có mặt oxy khí Các q trình dẫn đến phân hủy phần PE, tức phân mảnh chuỗi polyetylen dài thành mảnh chuỗi ngắn thường kết thúc nhóm chức (carboxyl, ketone rượu) Tuy nhiên, đơi mảnh vỡ cịn dài để xâm nhập qua thành tế bào vi sinh vật Vì lý này, chúng lần bị cơng enzyme ngoại bào Sau đó, dint chất hoạt động bề mặt sinh học ngoại bào vi sinh vật tiết ra, mảnh polyetylen trải qua bám dính vào thành tế bào dễ dàng xâm nhập vào bên tế bào vi sinh vật Do đó, trọng lượng phân tử PE giảm cách có hệ thống Trọng lượng PE đánh giá dựa vào tiêu Đo vị trí PE cách bề mặt môi trường nuôi cấy thước kẹp; PE sau rửa sạch, sấy khơ cân để xác định khối lượng 3.2.2.3 Phương pháp thực CFBSDA vô trùng (15ml) đổ vào đĩa Petri (90 mm) làm nguội nhiệt độ phòng Từ chủng làm tiến hành tăng sinh pha loãng mẫu nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5, trộn mẫu hút 0,5 ml dịch pha loãng nồng độ trải đồng bề mặt CFBSDA, sau phủ lên với PE (50 mm × 50 mm) Bên cạnh đó, điều kiện vơ trùng PE thêm vào mà không cấy mẫu Các đĩa CFBSDA cấy mẫu không bổ sung màng PE sử dụng làm đối chứng âm để kiểm tra xem chủng phân lập phát triển riêng thạch khơng Tất đĩa sau dán kín Parafilm ủ 30°C độ ẩm tương đối 85% 28 ngày Tấm màng PE chuyển vào tube 50 ml với 40 ml SW tube vortex phút Sau đem tube ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút 15 phút Phần phía loại bỏ kết tủa giữ lại 5ml SW Số lượng tế bào huyền phù đếm sử dụng phương pháp đếm đĩa pha loãng hàng loạt Huyền phù tế bào (10 ml) thêm vào bình erlen 150ml với 40ml LCFSDA Bình ủ máy lắc quay (120 vịng/phút) 30°C từ 1-2 ngày Sau đó, phân phối dung dịch vào ống nghiệm bổ sung PE (3mm x3mm) vào Bên cạnh đó, cần chuẩn bị thêm ống chứa môi trường LCFSDA không xử lý vi sinh để làm đối chứng âm Quan sát kết sau 28 ngày nuôi cấy 3.2.2.4 Kết Kết đánh giá thông qua tiêu khoảng cách PE cách bề mặt môi trường kết chụp SEM PE có đặc tính nhẹ kị nước tồn mơi trường lỏng chúng bề mặt môi trường, đồng thời ngăn cách tiếp xúc vi sinh vật với bề mặt PE, PE bắt đầu chìm dần mơi trường lỏng (xác định thông qua khoảng cách PE cách bề mặt môi trường) tức dấu hiệu tính kị nước PE giảm dần có thay đổi so với ban đầu lực liên kết monomer yếu Hình 3.1 Kết chụp PE kính hiển vi điện tử SEM Nguồn: Đặng Thị Ngọc Sang ctv (2020) Hình 3.2 Khảo sát thay đổi PE Nguồn: Đặng Thị Ngọc Sang ctv (2020) Hình ảnh chụp SEM bề mặt PE dùng làm đối chứng âm khơng xử lí vi sinh không xuất thay đổi bề mặt Sự thay đổi cấu trúc PE thể qua hình ảnh chụp SEM sau 12 tuần nuôi cấy cho thấy bề mặt phẳng ban đầu vật liệu trở nên gồ ghề, có hố, khoang Xác định chủng ứng viên có khả sinh trưởng mơi trường đặc hiệu có bổ sung PE nguồn carbon thông qua giá trị khoảng cách so với bề mặt môi trường lớn Trong chủng vi sinh vật chủng, biết chủng sinh trưởng mạnh Nghiên cứu sàng lọc chủng có tiềm phân hủy PE cao để tiến hành thực nghiệm 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Yang, J., Yang, Y., Wu, W.-M., Zhao, J., & Jiang, L (2014) Evidence of Polyethylene Biodegradation by Bacterial Strains from the Guts of Plastic-Eating Waxworms Environmental Science & Technology, 48(23), 13776-13784 Brunk, C.F., Jones, K.C and James, T.W (1979) Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenates Analytical Biochemistry 92, 497–500 Raeder, U and Broda, P (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi Letters in Applied Microbiology 1, 17–20 Chen, W.P and Kuo, T.T (1993) A simple and rapid method for preparation of gramnegative bacterial genomic DNA Nucleic Acids Research 21, 2260 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Dang Thi Ngoc Sang, Le Thi Cuc Dung, & Nguyen Thuy Huong (2020) Isolating, screening and selecting polyethylen able of degrading microorganisms Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 17(11), 2198-2209 11