Báo cáo tiểu luận nhóm 11 chiều thứ 4

Trang 1 THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌCNhóm 11GVHD: TS Huỳnh Văn Biết KS Trương Quang Toản Trang 2 CHỌN TẠO CÁC DÒNG NGÔ ĐƯỢC CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU CRYIAC THÔNG QUA VI KHUẨN AGRO

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nhóm 11

GVHD: TS Huỳnh Văn Biết

KS Trương Quang Toản

Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

CHỌN TẠO CÁC DÒNG NGÔ

ĐƯỢC CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU

(CRYIAC) THÔNG QUA VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

2

4

Ngô là một trong 3 cây ngũ cốc quan trọng

(lúa mì, lúa nước, ngô) của thế giới Ở nước

ta, ngô là cây lương thực quan trọng thứ 2

sau cây lúa và là cây màu quan trọng nhất

THÁCH THỨC

Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong một thời gian dài tiêu tốn nhiều chi phí và có tác động không tốt đối với sức khỏe của con người, động vật nuôi và môi trường

ĐẶT VẤN ĐỀ

GIẢI PHÁP

Phát triển kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) để

tạo dòng ngô kháng sâu (CryIAc) thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens là một trong

những cách tiếp cận hiệu quả vừa kiểm soát sự

phát triển của sâu bệnh, vừa ngăn chặn hiện

tượng khối u ở thân cây, đem lại hiệu quả kinh

tế cao, góp phần đảm bảo an toàn sức khỏe và

góp phần trong việc bảo vệ môi trường.

ĐẶT VẤN ĐỀ

8

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu và phát triển tạo ra giống Ngô được

chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens có khả năng kháng côn

trùng, sâu bệnh hại đem lại hiệu quả kinh tế cao và

đảm bảo an toàn sức khỏe cho người sử dụng

2 TỔNG QUAN

VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

GEN KHÁNG SÂU CRYIAC

1 0

KỸ THUẠT CHUYỂN GEN

Electron microscopy of Agrobacterium tumefaciens.

Staining of acidocalcisomes from Agrobacterium

• Là một vi khuẩn không bào tử, có dạng hình que,

gram âm, khả năng di chuyển rất cao và có lông

roi chiếu theo mọi hướng

• Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có khả năng

chuyển một phần nhỏ DNA vào tế bào thực vật và

qua đó kích thích tạo khối u (callus).

VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

https://doi.org/10.1007/3-540-33774-1_3

 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

chứa một Ti plasmid, là một phân tử DNA

mạch vòng, trong tế bào Ti plasmid tồn

tại như một đơn vị sao chép độc lập

 Ti plasmid có hai vùng chính liên quan

VI KHUẨN

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

https://doi.org/10.1128/microbiolspec.plas-0010-2013

Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens

• T-DNA là một phần của Ti plasmid,

được chuyển vào thực vật

• Trên đó định vị những gen tạo khối u

và tổng hợp opine.

• T-DNA được giới hạn bởi hai vùng, bờ

trái và bờ phải.

 CryIAc là một protein tinh thể được tạo ra bởi

vi khuẩn gram dương, Bacillus thuringiensis

(Bt) trong quá trình hình thành bào tử

 CryIAc là một trong những nội độc tố delta do

vi khuẩn này tạo ra, có tác dụng như thuốc trừ

sâu, có khả năng giết chết sâu bệnh hại

GEN KHÁNG SÂU CRYIAC

Cấu trúc tinh thể CryIAc,

https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2018.09.003

14

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

 Tách DNA và plasmid của vi khuẩn bằng cùng

một loại enzyme cắt

 Sử dụng enzyme nối gắn gen của tế bào cho

vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp

 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận

 Phân lập dòng tế bào có chứa DNA tái tổ hợp

Plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens lấy ra khỏi tế bào để làm

vector mang gen (Ti Plasmid).

BƯỚC 1: TÁCH PLASMID RA KHỎI

Tách gen CryIAc ra khỏi DNA của vi khuẩn

Bacillus thuringiensis cũng cùng enzyme giới

hạn Enzyme giới hạn có thể xác định vị trí một chuỗi DNA cụ thể và phá vỡ sợi ngay tại đó

BƯỚC 2: TÁCH GEN NGOẠI LAI (CRYIAC)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

https://tinyurl.com/yc4y5hhs

Tách gen ngoại lai (CryIAc)

 DNA CryIAc và plasmid đã được xử lý được

trộn chung với nhau trong một tube

 Mở vòng Ti plasmid bằng enzyme cắt giới hạn

và chèn đoạn gen CryIAc vào vùng T-DNA, tạo thành DNA tái tổ hợp nhờ enzyme nối ligase

BƯỚC 3: TẠO DNA TÁI TỔ HỢP

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

https://tinyurl.com/yc4y5hhs

Tạo DNA tái tổ hợp

Plasmid tái tổ hợp được đưa trở lại tế bào

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng

phương pháp xung điện hoặc sốc nhiệt.

BƯỚC 4: ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ

Bằng việc tạo vết thương hở và gen

chuyển sẽ được chèn vào hệ gen của cây.

BƯỚC 5: LÂY NHIỄM TẾ BÀO VI KHUẨN

Tế bào chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường thích hợp và tiến

hành sàng lọc.

BƯỚC 6: NUÔI CẤY TẾ BÀO

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Dùng các kĩ thuật như nuôi cấy trong

môi trường kháng sinh thích hợp, PCR,

lai phân tử (Southern Blot)

 Đánh giá thực nghiệm

BƯỚC 7: TIẾN HÀNH SÀNG LỌC VÀ

ĐÁNH GIÁ SỰ XUẤT HIỆN GEN NGOẠI LAI

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ

Sau khi áp dụng kỹ thuật chuyển gen (gen transfer) đã thành công tạo được dòng ngô chuyển gen của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens có khả năng

chống được sâu bệnh hại (CryIAc)

 Các phương pháp chuyển gen sẽ tiếp tục phát

triển trở thành một trong nhiều công cụ phục vụ

cho sự phát triển của xã hội

 Ngô kháng côn trùng không cần sử dụng các

loại thuốc hóa học nên rất đảm bảo về vấn về

sức khỏe và góp phần giải quyết được phần

nào vấn đề ô nhiễm môi trường

KẾT LUẬN

04

28

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Hwang, H H và ctv(2017) Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications Arabidopsis

• Đồng, N V (2010) TẠO DÒNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN KHÁNG SÂU/KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ

https://tinyurl.com/y64azx8t

• Gustavo A và ctv (1998) Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation

• Lương, Đ T (2002) Nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens góp phần tạo

https://www.mard.gov.vn/Pages/bao-cao-thong-ke.aspx#

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC

BẠN ĐÃ LẮNG NGHE

30